Um procedimento flexível para realizar FISH de telômeros e imunofluorescência em células que expressam proteínas fluorescentes

Resumo

Este protocolo descreve um método para combinar FISH de telômeros (nativos ou desnaturantes) com imunofluorescência e/ou visualização de uma proteína fluorescente.

Resumo

A visualização de telômeros usando hibridização in situ de fluorescência (TelFISH) tem sido uma ferramenta essencial em experimentos de biologia de telômeros. A combinação de TelFISH com imunofluorescência (IF) também é um método bem estabelecido (IF-TelFISH), por exemplo, na identificação de focos induzidos por disfunção dos telômeros, onde os telômeros co-localizam com 53BP1. Mais recentemente, o telômero nativo FISH (nTelFISH) tornou-se uma ferramenta importante para o ensaio de alongamento alternativo de telômeros, um mecanismo de manutenção dos telômeros usado em algumas células tumorais. A expressão de proteínas fluorescentes também é uma ferramenta essencial na biologia celular, permitindo a visualização de proteínas e estruturas que podem permanecer indetectáveis por outros métodos. Como os tampões FISH desnaturam as proteínas, a realização do ensaio em células com uma proteína fluorescente expressa (FP) resulta em perda do sinal FP. Um método para integrar IF e FISH telômero em células com uma proteína fluorescente expressa que preserva o sinal FP mesmo após FISH é descrito aqui. São fornecidas alternativas para FISH de telômeros nativos e desnaturantes em combinação com vários cenários de FI e FP. Em conjunto, este protocolo oferece uma estrutura flexível para explorar a biologia dos telômeros em células normais e tumorais.

Introdução

Organismos com cromossomos lineares devem enfrentar dois problemas. Primeiro, devido ao problema de replicação final, as extremidades dos cromossomos sofrem erosão ligeiramente cada vez que o DNA é replicado. Em segundo lugar, as células devem ser capazes de distinguir as extremidades naturais do DNA das quebras de DNA. Os telômeros evoluíram como uma solução para esses problemas. Através da ação da ribonucleoproteína telomerase, os cromossomos são alongados pela adição de repetições curtas em tandem-TTAGGG em humanos. Essas repetições são ligadas pelo complexo shelterina, que oculta a extremidade do cromossomo da maquinaria de reparo de danos ao DNA celular¹. Telômeros curtos ou disfuncionais levam à senescência celular e fenótipos^{de envelhecimento 2}, enquanto o escape da crise dos telômeros é um marco importante na tumorigênese³. Por essas razões, a biologia dos telômeros é de especial interesse na compreensão da saúde e da doença humanas.

A hibridização in situ fluorescente de telômeros (FISH) tem sido um método importante para visualizar telômeros em células interfásicas ou spreads metafásicos⁴. Durante décadas, os telômeros FISH foram acoplados à coloração de imunofluorescência (IF) 53BP1 para identificar focos induzidos por disfunção dos telômeros (TIFs), um marcador de telômeros disfuncionais^e não tampados ^5,6. Da mesma forma, uma característica dos tumores que usam o alongamento alternativo dos telômeros (ALT) para a manutenção dos telômeros é a associação de telômeros com corpos nucleares de PML para formar corpos de PML associados a ALT ou APBs⁷. Os APBs podem ser testados emparelhando os telômeros FISH com a coloração PML IF. Assim, IF-FISH é uma ferramenta bem estabelecida na biologia dos telômeros.

Aqui, o uso do IF-FISH foi estendido de duas maneiras. Primeiro, o IF-FISH é realizado em células com proteínas fluorescentes expressas (FP). A expressão de proteínas marcadas com fluorescência tornou-se uma ferramenta onipresente na biologia celular. Expressar uma proteína marcada pode ser a única opção para visualizar uma proteína para a qual não existem bons anticorpos. Por exemplo, o cromocorpo de actina nuclear marcado com GFP expresso (nAC-GFP) revela a dinâmica da actina nuclear⁸. Este reagente abriu novas oportunidades na exploração da f-actina nuclear, que já foi considerada um tema controverso. Enquanto FPs como GFP e mCherry normalmente mantêm a atividade de fluorescência após a fixação, a formamida nos tampões de hibridização FISH os tornará escuros⁹. Para contornar esse problema, este protocolo oferece a inovação de um "reforço" anti-FP marcado com fluoróforo na etapa secundária da coloração IF. O brilho do fluoróforo não é afetado pela formamida, permitindo o IF-FP-FISH.

Em segundo lugar, o IF é realizado em conjunto com o Native Telomere FISH (nTelFISH), um diagnóstico importante para o status de ALT. Na desnaturação de FISH, deve-se usar algum método para derreter as fitas de DNA¹⁰ (por exemplo, calor ou álcali), permitindo o acesso da sonda ao DNA que normalmente é de fita dupla. Em contraste, o FISH nativo não inclui uma etapa de desnaturação, então a sonda só pode acessar o DNA que já é de fita simples. O FISH de telômeros nativos detecta especificamente repetições de telômeros de fita C de fita simples, outra marca registrada de ALT em células tumorais^11,12. Acoplar este ensaio com a coloração IF-FP nos permite abordar novas questões na compreensão do mecanismo da ALT, que agora é considerada uma forte candidata para terapias tumorais direcionadas.

O protocolo descrito aqui pode ser usado em um estilo "escolha sua própria aventura" para corar qualquer combinação de IF, FP e FISH de telômeros nativos ou desnaturantes. Como o protocolo é altamente configurável, o tempo pode variar substancialmente. De um modo geral, o tempo prático é necessário em quatro dias, mas esses dias podem não ser sequenciais. As estimativas do tempo necessário para concluir um fluxo de trabalho típico de FISH de desnaturação são fornecidas na Figura 1. Os PEIXES nativos não precisam ser hibridizados durante a noite, portanto, pode-se potencialmente eliminar uma etapa noturna (combinando o Dia 2 e o Dia 3) se um longo dia no banco for viável.

Um microscópio confocal típico acomodará imagens de quatro canais de cores: grosso modo, azul, verde, vermelho e vermelho distante. Quatro exemplos de combinações potenciais de quatro cores são demonstrados, mas as permutações potenciais são infinitas. É possível usar dois anticorpos IF ou dois FPs expressos com igual sucesso. O protocolo é simples e robusto. Qualquer anticorpo que produza bons resultados de FI por conta própria é adequado. Embora apenas as sondas de telômero para FISH estejam incluídas aqui, a desnaturação de FISH com uma sonda de centrômero também produz bons resultados. Assim, este protocolo oferece um amplo grau de flexibilidade para responder a questões importantes em biologia nuclear.

Protocolo

Antes de começar, considere o microscópio, a linha celular que expressa FP e as sondas e anticorpos disponíveis. O azul é normalmente usado para uma coloração de DNA, como DAPI, pois os fluoróforos azuis geralmente não são brilhantes. Anticorpos secundários azuis podem ser usados, se necessário. Se as células expressarem GFP, uma sonda FISH marcada com um fluoróforo vermelho pode ser usada junto com um anticorpo secundário para IF marcado com AF-647. Alternativamente, para imagens de células que expressam mCherry, um anticorpo secundário IF marcado com AF-488 e uma sonda FISH marcada com AF-647 podem ser selecionados. Exemplos de quatro combinações possíveis de IF-FP-FISH são mostrados na Figura 2 e pretendem ser um guia para incentivar a flexibilidade do projeto experimental. É importante escolher peixes nativos ou desnaturantes, pois esses métodos não podem ser combinados. Um método confiável para lamínulas de lavagem com ácido para permitir a aderência celular está incluído aqui. Isso pode ser concluído a qualquer momento antes do uso, e as lamínulas estéreis podem ser armazenadas indefinidamente. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Lavagem ácida de lamínulas

NOTA: As lamínulas de vidro devem ser limpas e lavadas com ácido para permitir a adesão das células cultivadas. Para o crescimento em placas de 12 poços, lamínulas redondas de 18 mm são ideais. Consulte a instalação central de microscopia para determinar se as lamínulas # 1 ou # 1.5 são preferidas. Os tempos indicados para a limpeza das lamínulas não são críticos, mas não se restrinjam na lavagem ácida.

1. Use uma pinça de lamínula (Figura 3A) para colocar lamínulas nos racks de forma que suas superfícies não se toquem. Coloque lamínulas adicionais na diagonal para aumentar a capacidade, se necessário (Figura 3B). Encaixe várias prateleiras confortavelmente no prato de coloração (Figura 3C).
2. Encha o prato de coloração com água e uma pequena quantidade de detergente. Abaixe suavemente as prateleiras com as lamínulas no prato.
3. Agite as lamínulas na água com sabão por 30 min usando um balancim ou nutator.
4. Levante as prateleiras de lamínulas do prato de coloração. Descarte a água com sabão.
5. Enxágue o prato de coloração e encha com água deionizada. Retorne as prateleiras de lamínulas para a água limpa e coloque em uma cadeira de balanço para agitar suavemente por 5 min.
6. Repita o enxágue com duas trocas adicionais de água limpa deionizada, para um total de três enxágues.
7. Levante as prateleiras de lamínulas do prato de coloração. Adicione 1 N HCl ao prato.
   CUIDADO: HCl é cáustico. Manuseie em uma hotte e use equipamento de proteção individual. Abaixe cuidadosamente as lamínulas na solução ácida. Certifique-se de que o HCl 1 N cobre totalmente as lamínulas. Coloque a tampa no prato de coloração.
8. Coloque a placa de coloração contendo as lamínulas e a solução ácida no tanque de um sonicador de banho. Sonicar durante 15 min a 55 °C.
9. Deixe as lamínulas no banho de ácido durante a noite.
10. Remova cuidadosamente as prateleiras de lamínula do prato de coloração no dia seguinte. Descarte o HCl 1 N de acordo com os protocolos de segurança institucionais.
11. Enxágue o prato de coloração e encha-o com água deionizada. Retorne as prateleiras de lamínulas para a água limpa e coloque em uma cadeira de balanço para agitar suavemente por 5 min.
12. Repita o enxágue com mais duas trocas de água limpa deionizada, para um total de três enxágues.
13. Levante as prateleiras de lamínulas do prato de coloração. Esvazie o prato e encha-o com etanol 70%. Retorne as prateleiras de lamínulas ao prato e agite suavemente por 5 min.
14. Levante as prateleiras de lamínulas do prato de coloração. Esvazie o prato e encha-o com etanol 100%. Retorne as prateleiras de lamínulas ao prato e agite suavemente por 5 min.
15. Leve o prato com etanol 100% e as lamínulas para uma capa de cultura de tecidos. No capô, remova as prateleiras de lamínulas do prato e deixe-as secar ao ar.
16. Esvazie o prato e devolva as prateleiras de lamínulas para ele. Armazene com a tampa para manter a esterilidade. O prato de coloração não é hermético; Se as lamínulas forem deixadas no etanol, ele acabará evaporando. As lamínulas permanecerão utilizáveis.

2. Células de revestimento em lamínulas

NOTA: O manuseio de lamínulas requer prática. É mais fácil começar com uma placa de 6 poços até ficar confiante. Ao usar uma placa de 6 poços, dobre os volumes de lavagem fornecidos para placas de 12 poços.

1. Cultive células saudáveis em crescimento expressando a proteína de interesse marcada com GFP ou mCherry (vários FPs vermelhos ou verdes são adequados; veja as notas na Tabela de Materiais). As células de osteossarcoma U2OS, que usam ALT para manutenção dos telômeros, são usadas nos exemplos mostrados.
   1. Use células transitoriamente transfectadas ou linhagens celulares com expressão estável de FP. Se o experimento exigir tratamento medicamentoso ou transfecção, considere a confluência desejada na fixação (normalmente 70% -80%), a duração do tratamento e a taxa de crescimento celular para calcular o número apropriado de células a serem plaqueadas por lamínula.
2. Prepare lamínulas na capa de cultura de tecidos para manter a esterilidade. Para cada poço de uma placa de 12 poços, adicione 1 mL de PBS estéril. Usando uma pinça de lamínula, coloque uma lamínula limpa e lavada com ácido em cada poço. Agite suavemente com a mão por alguns segundos.
3. Aspirar PBS. Adicione 1 mL de PBS fresco estéril por poço. Reserve o prato.
4. (Opcional) Cubra as lamínulas com fibronectina para melhorar a adesão celular. Muitas linhagens celulares aderentes aderem bem a lamínulas lavadas com ácido quando plaqueadas por pelo menos 18 h antes da fixação. Se as células não aderirem bem ou precisarem de fixação logo após o revestimento, cubra as lamínulas para promover a adesão.
   1. Prepare uma solução de 5 μg/ml de fibronectina em PBS estéril.
   2. Aspire PBS das lamínulas. Aplique suavemente aproximadamente 300 μL de solução de fibronectina em cada lamínula, formando uma gota retida pela tensão superficial.
   3. Incubar durante várias horas a 37 °C ou durante a noite a 4 °C.
   4. Enxágüe várias vezes com PBS, segurando as lamínulas em uma troca final de PBS. Deixe o prato de lado enquanto prepara as células.
   5. Se a fibronectina não for adequada, considere poli-L-lisina, colágeno ou gelatina como alternativas.
5. Tripsinizar as células e diluir um número apropriado em 12 mL de meio de cultura com base no desenho experimental e na densidade celular desejada na fixação.
6. Aspire PBS das lamínulas e adicione 1 mL da suspensão celular por poço.
7. Coloque as células na incubadora.
8. Trate as células conforme necessário com medicamentos, siRNAs ou outros reagentes de acordo com o projeto experimental. Cresça até a confluência desejada.

3. Coloração IF-FP

NOTA: Ao longo do protocolo, não deixe as lamínulas secarem. É aconselhável pipetar com uma mão e aspirar as soluções com a outra, de modo que as lamínulas fiquem fora da solução o menor tempo possível. Pipete as soluções suavemente contra a parede do poço, não diretamente na lamínula. Manuseie as lamínulas com firmeza, mas com cuidado, com uma pinça. É fácil quebrar uma lamínula segurando-a com muita força. No início, planeje lamínulas duplicadas em caso de quebra. Com a experiência, lamínulas quebradas tornam-se uma ocorrência rara. As lamínulas não podem ser retiradas de um poço seco. As lamínulas devem ser cobertas com tampão para serem recolhidas.

1. Remova a mídia e fixe as células usando o fixador de sua escolha. Não é necessário enxaguar as células antes da fixação. Use 1 mL por poço em uma placa de 12 poços ou 2 mL por poço em uma placa de 6 poços.
   1. Opção 1: Use formaldeído a 4% em PBS.
      CUIDADO: O formaldeído é tóxico. Manuseie com luvas e descarte adequadamente. Prepare fresco usando 16% de formaldeído sem metanol e 10x caldo de PBS. Fixe por 15 min em temperatura ambiente.
   2. Opção 2: Use formaldeído a 4% no tampão citoesqueleto com sacarose (CBS).
      NOTA: Este tampão é preferido para preservar a estrutura do citoesqueleto¹³. O CBS tem uma concentração final de 10 mM MES pH 6,1, 138 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 2 mM EGTA e 0,32 M de sacarose. Para preparar o fixador, faça um estoque CBS 2x com 20 mM MES pH 6,1, 276 mM KCl, 6 mM MgCl₂, 4 mM EGTA. Prepare um estoque separado de 1,28 M de sacarose. Armazenar ambos os estoques a 4 °C. Para um fixador de trabalho fresco, misture 1 volume de formaldeído sem metanol a 16%, 1 volume de estoque de sacarose e 2 volumes 2x estoque CBS. Fixe por 15 min em temperatura ambiente.
   3. Opção 3: Fixe com metanol a -20 °C. Recomendado para alvos de anticorpos de ácidos nucleicos (por exemplo, ssDNA, G-quadruplexes, híbridos de RNA-DNA). Fixe por 5 min a -20 °C.
2. Aspirar fixador e descartar de acordo com as políticas institucionais.
3. Enxágue as lamínulas várias vezes com PBS.
   1. PONTO DE PARADA: As lamínulas fixas podem ser armazenadas em PBS a 4 °C por vários dias com perda mínima de sinal. Para armazenamento mais longo, desidrate a 100% de etanol (2 min em etanol 70%, 2 min em etanol 90%, armazene em etanol 100%), feche a placa com filme de laboratório e armazene a -20 °C. As lamínulas podem ser armazenadas dessa maneira por semanas a meses. Quando estiver pronto para colorir, reidratar as lamínulas (2 min em etanol a 90%, 2 min em etanol a 70%, 15 min em PBS) e prosseguir para a próxima etapa.
4. Permeabilize as lamínulas em Triton X-100 a 0,5% em PBS por 5 min a 4 °C. Execute esta etapa na placa.
5. Enxágue as lamínulas várias vezes com PBS.
6. Prepare a câmara umidificada (Figura 3D). Coloque toalhas de papel úmidas no fundo da câmara. Para criar um suporte para manchas, rotule a parte superior de uma tampa de uma placa de 12 poços para corresponder às lamínulas.
   1. Cubra a tampa com filme de laboratório para que os rótulos permaneçam visíveis. Certifique-se de que a câmara esteja à prova de luz com uma tampa bem ajustada. Cubra com papel alumínio, se necessário (Figura 3E).
7. Pipete gotas de 75 μL de 100 μg/mL de RNase A em PBS no suporte marcado. Pegue suavemente cada lamínula e passe a borda no tecido de laboratório para remover o excesso de tampão. Inverta as lamínulas nas gotas de RNase A (lado da célula para baixo). Coloque o suporte na câmara umidificada e feche a tampa. Incubar durante 45 min a 37 °C.
8. Adicione PBS fresco à placa de 12 poços. Retorne as lamínulas para a placa, com a célula voltada para cima. Enxágüe várias vezes com PBS.
9. Bloqueie por 30 min ou mais em temperatura ambiente. Limpe a solução RNase do suporte coberto por filme. Pipete gotas de 75 μL de soro de burro a 20% em PBS no filme. Inverta as lamínulas no buffer de bloqueio (lado da célula para baixo).
10. Prepare o anticorpo primário.
    1. Use 75 μL por lamínula. Prepare 10% a mais para permitir o erro de pipetagem.
    2. Diluir o anticorpo em soro de burro a 5%. Determine as diluições de anticorpos empiricamente. Uma diluição de 1:100 é um ponto de partida razoável.
    3. Durante o bloqueio, prepare um segundo suporte marcado para incubação de anticorpos primários. Cubra a tampa com filme e aplique gotas de 75 μL do anticorpo diluído nos pontos designados.
11. No final da etapa de bloqueio, transfira lamínulas para as gotículas de anticorpos (lado da célula para baixo). Coloque o suporte na câmara umidificada, feche a tampa e incube por pelo menos 2 h em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C.
12. Adicione PBS fresco à placa de 12 poços. Retorne as lamínulas para a placa, com a célula voltada para cima. Lave em PBS três vezes por 5 min cada em temperatura ambiente com balanço.
13. Durante a lavagem final, prepare anticorpos secundários.
    1. Use 75 μL por lamínula. Prepare 10% a mais para permitir o erro de pipetagem.
    2. Recomenda-se uma diluição de 1:400 para anticorpos secundários fluorescentes e anticorpos de reforço GFP/RFP. Ajuste conforme necessário com base na experiência com o alvo.
    3. Dilua os anticorpos secundários em soro de burro a 5%. Aplique gotas de 75 μL nos pontos apropriados no suporte rotulado.
14. Após a lavagem, transfira as lamínulas para as gotículas de anticorpos secundários (lado da célula para baixo). Incube por pelo menos 30 min em temperatura ambiente na câmara umidificada selada.
15. Adicione PBS fresco à placa de 12 poços. Retorne as lamínulas para a placa, com a célula voltada para cima. Lave em PBS três vezes por 5 min cada em temperatura ambiente com balanço.

4. Re-fixação e desidratação

1. Prepare formaldeído a 4% em PBS em temperatura ambiente para refixação. Use formaldeído para esta etapa, mesmo que o metanol tenha sido usado para a fixação inicial. Remova a lavagem final do PBS e fixe novamente as células por 15 min com um balanço suave.
2. Aspirar o fixador e descartá-lo de acordo com as políticas institucionais.
3. Enxágue as lamínulas várias vezes com PBS.
4. Desidrate as lamínulas e seque ao ar para se preparar para a hibridização:
   1. Incubar em etanol a 70% por 2 min.
   2. Incubar em etanol a 90% por 2 min.
   3. Incubar em etanol 100% por 2 min.
   4. Após 100% de etanol, coloque as lamínulas com o lado da célula para cima no papel de filtro rotulado para manter a orientação. Deixe-os secar completamente ao ar enquanto prepara a sonda FISH.

5. PEIXE (OPÇÃO 1): Desnaturação de PEIXE

1. Prepare dois suportes de folha (veja a Figura 3F).
   1. Dobre um pedaço de papel alumínio em quartos para criar quatro camadas. Certifique-se de que o lado opaco esteja voltado para fora.
   2. Apare a folha dobrada para caber dentro da tampa de uma placa de 12 poços. Usando um lenço umedecido, esfregue o papel alumínio contra o interior da tampa para que as saliências da tampa gravem um padrão no papel alumínio. Isso criará sulcos que impedem que as lamínulas deslizem umas para as outras durante as etapas subsequentes.
   3. Prepare dois desses suportes. Eles podem ser apagados e reutilizados em experimentos posteriores.
2. Diluir a sonda 10 μM 1:50 em tampão de hibridização (70% de formamida deionizada, 10 mM de Tris, pH 7,4, 0,5% de solução de bloqueio de Roche a 10×). Use 75 μL desta sonda diluída por lamínula e prepare 10% extra para compensar a perda de pipetagem. A concentração final da sonda deve ser de 200 nM.
3. Pré-aqueça um bloco de calor a 90 °C e um termociclador a 85 °C.
4. Desnaturar as lamínulas: Coloque as lamínulas secas ao ar com a célula voltada para cima em um dos suportes de alumínio preparados. Coloque delicadamente o papel alumínio no bloco do termociclador e feche a tampa. Incube por 5 min para desnaturar.
5. Simultaneamente, aquecer a sonda diluída no bloco de calor a 90 °C durante 5 min.
6. Pipetar gotas de 75 μL da sonda desnaturada para o segundo suporte de folha preparado. Certifique-se de que o lado opaco da folha esteja voltado para cima para permitir gotículas bem formadas. Se o lado brilhante estiver para cima, a sonda se espalhará e perderá a tensão superficial.
7. Inverta as lamínulas desnaturadas nas gotas da sonda, colocando-as com o lado da célula voltado para baixo.
8. Transferir o suporte de folha com sonda e lamínulas para o bloco termociclador regulado para 85 °C e incubar durante 5 min. Use uma espátula para ajudar na transferência. Mova-se com cuidado para evitar bater ou deslocar as lamínulas.
9. Mova a folha com lamínulas e sonda para uma câmara umidificada. Cubra com a tampa e incube durante a noite em temperatura ambiente.

6. PEIXE (OPÇÃO 2): PEIXE Nativo

1. Diluir a sonda 10 μM 1:200 em tampão de hibridização (70% de formamida deionizada, 10 mM de Tris, pH 7,4, 0,5% de solução de bloqueio de Roche a 10×). A concentração final da sonda é de 50 nM. Use 75 μL por lamínula e prepare 10% a mais para permitir o erro de pipetagem.
2. Aplique gotas de 75 μL de sonda diluída nos pontos designados no suporte coberto por filme.
3. Inverta as lamínulas desnaturadas nas gotas de 75 μL da sonda, colocando-as com o lado da célula voltado para baixo.
4. Coloque o suporte em uma câmara umidificada e feche a tampa. Incube por pelo menos 45 min em temperatura ambiente. A incubação pode ser estendida para pernoite, se preferir.

7. Lavagem e montagem

NOTA: O meio de montagem ideal depende da abertura numérica da objetiva do microscópio. Consulte a instalação central de microscopia local para obter recomendações. Uma escolha adequada pode ser o ProLong Glass com NucBlue, que tem um índice de refração de 1,52. No entanto, um meio de montagem alternativo pode ser mais apropriado, dependendo do microscópio em questão.

1. Retorne as lamínulas para a placa de 12 poços para lavagem. Inverta-os para que fiquem com o lado da célula para cima.
2. Lave 3× 10 min em formamida 70% / Tris 10 mM, pH 7,5.
   CUIDADO: A formamida é tóxica; descartá-lo de acordo com as políticas institucionais.
3. Lave 3× 5 min em TNT (0,05 M Tris / 0,15 M NaCl / 0,05% Tween-20, pH 7,5).
4. Enxágüe várias vezes em PBS. Se uma coloração de DNA não estiver incluída no meio de montagem, considere adicionar DAPI na lavagem final. Para corar com DAPI, adicione 300 nM DAPI ao PBS, aplique em lamínulas e incube por 5 min. Descarte a solução DAPI de acordo com as diretrizes institucionais.
5. Monte as lamínulas nas lâminas de vidro usando uma gota de meio de montagem. Inverta as lamínulas na queda: com o lado da célula para baixo.
6. Deixe o meio de montagem curar durante a noite antes de fazer a imagem.

Resultados

Os resultados típicos deste protocolo são mostrados na Figura 4. Se executada corretamente, a morfologia celular será bem mantida e os sinais fluorescentes serão brilhantes. A desnaturação dos telômeros FISH deve revelar um padrão de dezenas de pontos em cada núcleo representando cada telômero (ver Figura 4, Exemplos 1 e 2). Os focos de telômeros devem estar presentes quase exclusivamente no núcleo, embora às vezes ocorra coloração citoplasmática dos telômeros, especialmente em linhagens celulares ALT. Os sinais dos telômeros resultantes tendem a ser extremamente brilhantes, tanto que deve-se tomar cuidado para evitar o sangramento do sinal dos telômeros em outros canais de detecção. Nas linhagens celulares ALT, os telômeros geralmente se agrupam nos corpos^{PML 14}, resultando em menos focos do que normalmente seria esperado. Esse agrupamento pode ser observado na Figura 4, Exemplo 2.

Em linhagens celulares que usam ALT para manutenção dos telômeros, os telômeros nativos FISH detectam o ssDNA telomérico que é uma marca registrada da ALT^11,12. Não se espera que todos os núcleos tenham ssDNA dos telômeros, nem que mais do que um pequeno número de pontos esteja presente em um único núcleo (ver Figura 4, Exemplos 3 e 4). O sinal FISH dos telômeros nativos não será tão brilhante quanto o FISH dos telômeros desnaturantes. A linhagem celular de osteossarcoma U2OS é um bom controle positivo para FISH nativos. Não se espera que o ssDNA dos telômeros seja observado em linhagens celulares com telômeros mantidos pela telomerase.

Tanto para peixes desnaturantes quanto nativos, a fluorescência nucleolar forte é artificial. Se um sinal nucleolar excessivo for observado, tente usar uma solução nova de RNase A ou estender o tratamento com RNase A¹⁵ (Etapa 3.8 do protocolo). Para experimentos FISH de telômeros nativos usando células com status ALT desconhecido, uma linha celular ALT positiva, como U2OS, é usada para calibrar as configurações de detecção.

As observações de FPs em experimentos IF-FP-FISH podem ser prontamente comparadas com experimentos de imagem de células vivas para validação. Se forem observadas discrepâncias, tente variar as condições de fixação. A fixação no tampão CSB (Etapa 3.1.2 do Protocolo) pode ser benéfica para preservar as estruturas celulares, revelando uma localização FP mais precisa¹³.

A coloração por imunofluorescência varia muito de acordo com a proteína de interesse. Os resultados do FI devem ser comparados com amostras preparadas sem FISH para avaliar o impacto do protocolo FISH na localização e intensidade da proteína de interesse. Em geral, os experimentos IF-FP-FISH são adequados para contagem de focos, mas as intensidades podem não ser quantitativas⁶.

Figura 1: Exemplo de fluxo de trabalho com durações estimadas. Um dia adicional pode ser necessário se a incubação primária de anticorpos for realizada durante a noite. No caso de PEIXES nativos, os dias 2 e 3 às vezes são combinados, embora isso resulte em um tempo de bancada estendido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Exemplos de combinações experimentais bem-sucedidas usadas com imagens de quatro cores. Os exemplos 1 e 2 demonstram a desnaturação dos telômeros FISH, enquanto os 3 e 4 usam FISH nativos. Observe que este protocolo é útil se estiver imunomarcando duas proteínas-alvo (Exemplo 1), combinando uma coloração FP e uma IF (Exemplos 2 e 4) ou dois FPs (Exemplo 3). Os resultados representativos para esses experimentos são dados na Figura 4. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Equipamento utilizado neste protocolo. (A) Pinça de lamínula. Enquanto a pinça reta pode ser usada para lidar com lamínulas, a pinça de lamínula angular torna a tarefa muito mais fácil. (B) Lamínulas guardadas para lavagem. Observe que, além de serem empilhadas em linha reta, as lamínulas também são anguladas entre as ranhuras adjacentes para aumentar a capacidade. (C) Quatro prateleiras de lamínulas em um prato de coloração. Um prato de coloração de vidro contém dezenas de lamínulas e é impermeável à lavagem com ácido HCl. (D) Uma câmara umidificada preparada. A parte externa é coberta com papel alumínio para criar um ambiente escuro, preservando os fluoróforos. Toalhas de papel úmidas na parte inferior fornecem umidade. (E) A câmara umidificada selada. Uma tampa bem ajustada é essencial para evitar o ressecamento. (F) Fazendo o suporte de folha de alumínio. A gravação de sulcos na folha aparada ajuda a evitar que as lamínulas deslizem umas nas outras durante a etapa de desnaturação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Resultados representativos de experimentos de imagem de quatro canais, incluindo IF, FISH e FPs expressos. Os painéis descrevem os resultados reais dos experimentos descritos na Figura 2. DAPI cora DNA, nAC-GFP destaca f-actina nuclear, TelFISH e TRF2-mCherry marcam telômeros, a imunocoloração PML marca corpos PML nucleares e nTelFISH revela ssDNA telomérico. Todas as células são células de osteossarcoma U2OS. As imagens foram adquiridas em um microscópio confocal com capacidade de super-resolução. As imagens do exemplo 1 foram adquiridas com microscopia confocal de varredura a laser; todas as outras imagens foram adquiridas com Microscopia de Iluminação Estruturada. Todas as barras de escala representam 5 μM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Experimentos usando IF-FISH têm sido um dos pilares no campo dos telômeros como um ensaio para estresse nos telômeros ou detecção de ALT ^5,6,16. Aqui, o protocolo é estendido para incluir uma proteína fluorescente. Além disso, a opção de FISH de telômero nativo é oferecida como um ensaio ALT ortogonal¹¹. Este protocolo é simples de executar e produz resultados satisfatórios de forma confiável.

Ao operar em lamínulas com gotículas de anticorpos ou sondas PNA, este protocolo foi projetado para ser econômico. O uso de gotículas conserva reagentes valiosos. Em contraste, alternativas como lâminas compartimentadas são caras e oferecem menos flexibilidade. Embora o manuseio de lamínulas exija prática para desenvolver proficiência, a economia de custos faz com que o investimento de tempo valha a pena. Deve-se notar que gotículas de reagente maiores que 75 μL não são recomendadas. Gotículas maiores simplesmente fazem com que as lamínulas deslizem e não melhoram os resultados.

A expressão de nAC-GFP é uma ferramenta indispensável para a visualização da f-actina^{nuclear 8}, como visto na Figura 4. Existem muitos outros reagentes marcados que podem ajudar a responder a questões biológicas importantes. Por exemplo, o sistema de plasmídeo FUCCI pode ser usado para visualizar o ciclo celular e, usando este protocolo, pode ser combinado com o telômero FISH¹⁷. Uma abordagem diferente para testar o ciclo celular pode usar o cromocorpo PCNA para obter informações sobre o ciclo celular¹⁸. Dependendo da pergunta que está sendo feita, muitos reagentes marcados com FP estão disponíveis comercialmente.

Aqui, este protocolo é demonstrado com FISH de telômero, mas resultados bem-sucedidos também foram alcançados com FISH de centrômero, usando uma sonda PNA na mesma concentração. É possível multiplexar uma sonda de centrômero marcada com FAM com uma sonda de telômero marcada com Cy3, por exemplo. É importante enfatizar que é improvável que o protocolo funcione com DNA FISH de locus único. Para sondar um único locus, é necessária a digestão da amostra por protease, e essa digestão é claramente incompatível com a detecção de IF ou FP¹⁹. No entanto, o sucesso foi alcançado na combinação de IF e mRNA FISH com uma abordagem semelhante; obviamente, a etapa de tratamento com RNase deve ser omitida neste cenário.

Finalmente, é evidente que os telômeros nativos FISH estão rapidamente se tornando um ensaio essencial para o status de ALT^20,21. Ao contrário do ensaio do círculo C para ALT, que é baseado na população²², o FISH dos telômeros nativos fornece uma leitura de ALT no nível celular, permitindo a detecção sensível de alterações na dinâmica da ALT. Ao unir os telômeros nativos FISH com a expressão de IF e FP, informações importantes sobre o mecanismo ALT podem ser reveladas. Com o tempo, esperamos que esses insights levem a terapias direcionadas para tumores que dependem da ALT para a manutenção dos telômeros.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10 % Tween-20	Bio-Rad	1610781	Descarte se a solução estiver turva.
10x PBS	Gibco	70011044	Para preparar fixadores e outros tampões, use pós-fixação
Placas de cultura de células de 12 poços	Nunc	150628
16% de formaldeído sem metanol	Thermo Scientifc	28908
5 M de cloreto de sódio	Millipore Sigma	S6546
Células aderentes, por exemplo, células de osteossarcoma U2OS	ATCC	HTB-96
Caixa hermética para câmara umidificada	Mepal	106415032500	Qualquer caixa hermética adequada funcionará, mas cuidado com caixas com fundo irregular.
Alconox	Millipore Sigma	Z742914
folha de alumínio	Fisher Científico	01-213-100
Meio de cultura celular apropriado, por exemplo, McCoy's 5A	Gibco	16600082	para U2OS, adicione 15% de FBS
Sonda de centrômero (FAM)	PNA Bio	F3001	Vários fluoróforos estão disponíveis
Plasmídeo de actina-cromocorpo nuclear ChromoTek (TagGFP)	Tecnologia de proteína	ACG-N
Pinças de lamínula	Ferramentas de Belas Ciências	11251-33
Suportes para lamínulas	Millipore Sigma	Z688568
DAPI	Invitrogen	D21490	Opcional, caso o meio de montagem não contenha uma coloração de DNA
Soro de burro	Jackson Imunopesquisa	017-000-121
EGTA	Mundo biológico	40520008	Solução 0,5 M pH 8,0
etanol	Warner-Graham	200 Provas
Soro fetal bovino	Gibco	A5670801
Fibronectina	Millipore Sigma	F0635	Para revestimento opcional de lamínulas
formamida	Millipore Sigma	47671-250ML-F
Lamínulas de vidro alemãs	Warner Insruments	64-0714	CS-18R15 (espessura # 1,5, confirme se isso é apropriado para o seu microscópio)
Impulsionador GFP	Tecnologia de proteína	gb2AF488	reconhece GFP/mClover/YFP/Venus e outros.  Consulte as informações do produto para obter uma lista abrangente
Mancha de vidro com tampa	Millipore Sigma	900203
Limpador ultrassônico aquecido com temporizador digital	Branson	CPX-952-218R	Este modelo de sonicador de banho inclui calor, mas não possui potência ou intensidade configuráveis.
Ácido clorídrico	Millipore Sigma	258148	HCl concentrado é 12 N.  Adicione 20 mL de HCl concentrado a 220 mL de água deionizada para 1 N HCl
Solução de cloreto de magnésio	Millipore Sigma	63069	Solução 1 M
Economia de mercado	Millipore Sigma	475893
metanol	Millipore Sigma	179337
Parafilme	EUA Científico	3023-4526
Cloreto de potássio	Millipore Sigma	Pág. 9541
anticorpo primário  anti-LMP de camundongo	Santa Cruz	SC-377390
anticorpo primário  coelho anti-53BP1	Novus	NB100-904
anticorpo primário  coelho anti-LMP	ABclonal	Rolamento A1184
Prolongue o vidro com NucBlue	Invitrogen	Pág. 36981
Impulsionador de RFP	Tecnologia de proteína	rb2AF568	reconhece mRFP/mCherry/mKate2/mPlum.  Consulte as informações do produto para obter uma lista abrangente
RNAse A	Millipore Sigma	RNASEA-RO
Solução de bloqueio da Roche	Millipore Sigma	11096176001
anticorpo secundário, por exemplo, AF488 anti-mouse	Invitrogen	A-11001	Ou similar
anticorpo secundário, por exemplo, AF594 anti-coelho	Invitrogen	A-11012	Ou similar
anticorpo secundário, por exemplo, AF647 anti-mouse	Invitrogen	A-21235	Ou similar
espátula	Fisher Científico	10257402
PBS estéril	Gibco	14190144	Para preparar lamínulas
sacarose	Millipore Sigma	S0389
Sonda TelC (Cy3)	PNA Bio	F1002	Vários fluoróforos estão disponíveis
Sonda TelG (AF647)	PNA Bio	F1014	Vários fluoróforos estão disponíveis
Tris Base	Millipore Sigma	648311	Prepare a solução 1 M em água, ajuste o pH usando HCl
Tritão X-100	Millipore Sigma	100 X
Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenol	Gibco	25200072
Microscópio Zeiss Elyra	Zeiss		Ou similar