Ensaio de splicing massivamente paralelo para examinar erros de splicing causados por variantes intrônicas relacionadas à doença

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para a realização de ensaios de splicing massivamente paralelos (MaPSy), que empregam construções de minigenes para avaliar sistematicamente variantes intrônicas em massa. Essa abordagem permite a análise de alto rendimento de mudanças de splicing induzidas por variantes nas células por meio do sequenciamento de amplicon, fornecendo avaliações funcionais de seu impacto no splicing pré-mRNA.

Resumo

Os erros de splicing representam 10-30% das mutações patogênicas responsáveis por doenças genéticas raras. O splicing de RNA garante a expressão gênica adequada, unindo seletivamente os éxons e removendo íntrons, com as principais sequências regulatórias localizadas dentro dos íntrons. O local de splice 5 'e o local de ramificação interagem com pequenos RNAs nucleares para formar o complexo de reconhecimento do spliceossomo, enquanto elementos como o trato de polipirimidina e intensificadores / silenciadores de splicing recrutam proteínas para regular a montagem do spliceossomo. Prever interrupções de splicing de variantes intrônicas é um desafio devido à complexidade dessas interações.

Variantes intrônicas, compreendendo 90% das variações genéticas humanas naturais, podem interromper o splicing canônico e dar origem a doenças. Para investigar essa possibilidade, desenvolvemos um ensaio de splicing massivamente paralelo (MaPSy) para avaliar variantes intrônicas identificadas pelo paciente. Oligonucleotídeos sintetizados com sequências de referência ou variantes foram ligados em minigenes de splicing contendo sinais de promotor e poliadenilação. Cada construção incluía dois éxons constantes flanqueando um éxon médio que abrigava a sequência de junção íntron-éxon variável de interesse. A eficiência de splicing celular das sequências variantes foi comparada com as contrapartes de referência, permitindo-nos identificar interrupções significativas como variantes de splicing.

Os resultados do MaPSy podem ser validados por meio de abordagens adicionais, como ensaios de minigenes ou edição de genoma mediada por CRISPR in vivo. Além disso, a análise agregada das junções interrompidas pode fornecer informações mais profundas sobre os mecanismos de splicing e a base molecular das doenças associadas a erros de splicing.

Introdução

O splicing de RNA é um processo crucial que une éxons para tradução e remove íntrons, facilitando a exportação de RNA e mantendo a homeostase do ácido nucleico. Esse mecanismo rigidamente regulado opera de maneira temporal e espacial, contribuindo para a diversidade e complexidade do transcriptoma¹. O splicing é guiado por sinais-chave, incluindo o local de emenda 5' (5'ss), local de ramificação e local de emenda 3' (3'ss), juntamente com elementos regulatórios adicionais, como o trato de polipirimidina a jusante do local de ramificação e a zona de exclusão de dinucleotídeos AG, que auxiliam no reconhecimento de 3'ss². Mecanicamente, o pequeno RNA nuclear U1 (snRNA) emparelha com o 5'ss, enquanto o local da ramificação interage com o U2 snRNA³. A atividade coordenada do sítio de ramificação, do trato de polipirimidina e dos 3'ss facilita a ligação de pequenas nucleoproteínas U2 (snRNPs) e fatores auxiliares de U2, estabilizando o spliceossomo e posicionando o ponto de ramificação para ataque nucleofílico no 5'ss, iniciando assim o splicing.

Com o rápido avanço das tecnologias de sequenciamento, o custo do sequenciamento do genoma completo continua a diminuir, levando a um catálogo cada vez maior de variantes genéticas humanas. Estima-se que 10-30% das mutações associadas a doenças em doenças genéticas raras afetam o splicing de RNA ^4,5,6, muitas vezes produzindo produtos gênicos aberrantes que podem servir como alvos terapêuticos. No entanto, avaliar o impacto funcional das variantes intrônicas continua sendo um desafio devido à complexidade dos sinais de splicing, que muitas vezes são redundantes e degenerados. Embora os locais de emenda 5 'e 3' sejam relativamente bem caracterizados, os locais de ramificação, tratos de polipirimidina e outros elementos reguladores de splicing exibem considerável sequência e variabilidade posicional em eucariotos superiores. Estudos de mapeamento em larga escala demonstraram ainda que vários locais de ramificação podem existir dentro de um único íntron 7,8,9,10, complicando a interpretação das variações do limite íntron-exon.

O aprendizado profundo tem sido empregado para avaliar como as sequências primárias contribuem para o reconhecimento do local de splicing ^4,11,12, revelando que as variantes de splicing se agrupam em locais de splice canônicos enquanto se estendem esparsamente para o éxon e a região 3 'dos íntrons. Esse padrão se alinha com o entendimento estabelecido de que a seleção do local de splice 5' é ditada principalmente por sequências de consenso, enquanto o reconhecimento do local de splice 3' depende de elementos intrônicos adicionais, como locais de ramificação e tratos de polipirimidina. No entanto, os modelos existentes foram treinados para distinguir locais de emenda constitutivos de alternativos ou artificiais, em vez de se concentrar especificamente em variantes intrônicas. Como resultado, essas ferramentas computacionais mostram apenas precisão preditiva moderada, identificando principalmente locais de splice e variantes de splicing exônico 13,14,15,16. Além dos modelos preditivos, um sistema experimental capaz de validar variantes de splicing em massa melhoraria significativamente a identificação e caracterização de defeitos de splicing.

Dados abrangentes de sequenciamento de RNA ligando variantes intrônicas associadas a doenças a fenótipos de splicing permanecem escassos devido à sua baixa frequência e à dificuldade de prever resultados de splicing de conjuntos de dados existentes. Para resolver essa lacuna, ensaios de splicing de alto rendimento e modelos computacionais foram desenvolvidos para analisar sistematicamente as variantes de splicing. Ensaios repórteres de splicing massivamente paralelos (MaPSy) foram projetados para avaliar o impacto de sequências variáveis na seleção do local de splice. Ao incorporar variações de sequência perto dos locais de emenda de 5 'e 3' ou abrangendo regiões inteiras de íntron-exon dentro de backbones de minigenes fixos, o MaPSy permite uma avaliação funcional das alterações de splicing. No entanto, devido às limitações da síntese de oligonucleotídeos em massa, variantes intrônicas profundas e ativação de pseudo-exons não são capturadas nesta abordagem.

A robustez do MaPSy foi validada usando 70 minigenes de splicing independentes, produzindo uma correlação de Pearson de 0,89¹⁷. Notavelmente, aproximadamente 90% das variantes de doadores de splicing (+1 e +2) exibiram defeitos de splicing, destacando a precisão do ensaio. Além disso, o MaPSy com sequências aleatórias de sítios ramificados revelou a natureza degenerada do reconhecimento de sítios ramificados e sua dependência de proteínas centrais U2¹⁸. Além disso, um projeto MaPSy de GFP dividido juntamente com a classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) tem sido usado para investigar eventos de salto de exon causados por variações genéticas. Essa abordagem revelou que 54% das variantes de interrupção de splicing residem em regiões intrônicas, incluindo locais de splicing canônicos¹³, ressaltando o papel significativo dos elementos intrônicos na regulação do splicing. Coletivamente, esses achados reforçam a importância das sequências intrônicas no controle do splicing e demonstram a utilidade do MaPSy na identificação de defeitos de splicing associados à doença (Figura 1).

Figura 1: Projeto experimental de ensaio de splicing massivamente paralelo (MaPSy) de mutações intrônicas próximas ao exon. Variantes documentadas em bancos de dados de doenças humanas foram coletadas e sintetizadas como 5.307 pares de oligos. Cada par de oligos contém uma referência e um alelo variante nas regiões intrônica de 78 nucleotídeos (nt) e exônicas de 35 nt. Os oligos são flanqueados por locais de priming comuns para amplificação e ligação em minigenes de splicing de 3-éxons. Assim, a região sintetizada compreende os 3'ss do segundo éxon do minigene. Após a montagem do minigene, os minigenes agrupados foram emendados em células renais embrionárias humanas (HEK293T). As isoformas emendadas resultantes foram colhidas e resolvidas por sequenciamento de amplicon. Essa figura foi adaptada com permissão de Chiang et ^al.17. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

1. Síntese da biblioteca de oligonucleotídeos (oligo) MaPSy

1. Estrutura básica do oligo: Projete cada oligo no pool de 155 nuncleotídeos (nt) para incluir uma sequência exônica de 35 nt e uma sequência intrônica de 80 nt, formando uma região específica do gene de 115 nt flanqueada por sequências de priming comuns de 20 nt em cada extremidade ( Figura 2A ).
2. Coleção de variantes: Para manter a integridade do motivo e focar nas regiões regulatórias que afetam o splicing, colete as variantes intrônicas que são:
   -78 a +10 nt do 3'ss
   -3 a +30 nt do 5'ss
   NOTA: As variantes clínicas podem ser obtidas do ClinVar¹⁹, entradas de baixa frequência no dbSNP²⁰, publicações relevantes e bancos de dados clínicos adicionais. As coordenadas do genoma podem ser usadas para cruzar variantes com as regiões genômicas desejadas (por exemplo, usando BEDTools²¹). Apenas polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) e pequenas inserções/deleções (indels) abaixo de 15 nt devem ser selecionados para minimizar a variabilidade de tamanho dentro do pool de oligos para síntese em massa.
3. Estrutura básica do minigene: Para preservar a estrutura da junção de splicing, cada backbone do minigene contém três éxons: dois éxons externos constantes que codificam fragmentos de EGFP (de pGint, Addgene Plasmid # 24217) e um éxon médio derivado do éxon 15 de CAMTA2 humano ( Figura 2B ). Digerir o fragmento CAMTA2 e pGint com enzimas de restrição BamHI e SalI e ligar o fragmento CAMTA2 em pGint entre os éxons EGFP, criando minigenes de três éxons pGint-CAMTA2 (Arquivo Suplementar 1).
   NOTA: O éxon médio, ou seja, o éxon 15 CAMTA2 , deve exibir uma eficiência de splicing intermediária quando expresso em células-alvo. Essa característica é essencial, pois fornece uma linha de base equilibrada, permitindo a detecção de aumentos e diminuições na eficiência de splicing devido a efeitos variantes.
4. Projeto do local de preparação: Anexe a sequência do local de inserção a ambas as extremidades da biblioteca para que cada oligo contenha sequências de flanqueamento de ~ 20 nt que se sobrepõem ao local de inserção pretendido dentro do éxon / íntron médio (Figura 2A).
   NOTA: Se o pool de oligo for projetado para várias construções de minigenes, vários locais de escorva podem ser incorporados.
5. Design de código de barras: Para variantes intrônicas, os códigos de barras exônicos são essenciais para distinguir genótipos de produtos emendados, pois as sequências intrônicas são perdidas após o splicing. Para evitar quaisquer alterações de emenda devido a sequências de código de barras (ou seja, o efeito de código de barras), posicione os códigos de barras distalmente dentro dos éxons, longe dos locais de emenda (ou seja, ao lado do local de escorva exônico).
   NOTA: Recomenda-se usar vários códigos de barras por variante sempre que possível. O comprimento do código de barras necessário depende da complexidade da biblioteca. Por exemplo:
   Um código de barras de 1 nt é suficiente se um alelo de referência for emparelhado com apenas uma variante.
   Um código de barras de 2 nt é preferível se um alelo de referência for emparelhado com seis variantes diferentes.
   Bibliotecas com múltiplas variantes intimamente relacionadas a um único alelo de referência (por exemplo, diferindo em apenas um nucleotídeo) podem aumentar a complexidade da análise.
6. Oligos de ordenação: Ordene oligos no formato de arquivo FASTA, com cada junção variante emparelhada ao lado de seu alelo de referência.
   NOTA: Para junções com múltiplas variantes, apenas um alelo de referência é necessário por junção. Os serviços de síntese de sequências agrupadas estão disponíveis em empresas como GeneScript (https://www.genscript.com/gentitan-oligo-pools.html), Twist Bioscience (https://www.twistbioscience.com/products/oligopools), IDT (https://sg.idtdna.com/pages/products/custom-dna-rna/dna-oligos/custom-dna-oligos/opools-oligo-pools) e Agilent (https://www.agilent.com/en/product/oligo-pools-oligo-gmp-manufacturing/pooled-oligo-synthesis). O comprimento da síntese, a capacidade da biblioteca e os custos podem variar dependendo do provedor e da região.

Figura 2: Projeto de minigene oligo e splicing para MaPSy. (A) Projeto para síntese de oligo agrupado da extremidade 3 'ou 5' dos íntrons. Os diagramas ilustram a estrutura básica dos oligos de 155 nt. A capacidade real de síntese de oligo depende da empresa selecionada para produção. (B) Projeto dos minigenes MaPSy. Um minigene de três éxons (ii) foi modificado a partir do plasmídeo pGint (i), e os locais de splice foram substituídos pelos oligos agrupados para introduzir variações de sinal de splicing (iii). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Construção de modelos de DNA da biblioteca MaPSy

1. Amplificação inicial ao receber o pool de oligo
   1. Após o recebimento do pool de oligos, amplifice 10-50 ng da biblioteca de oligos com os locais de preparação flanqueadores projetados por uma reação em cadeia da polimerase (PCR) de 100 μL usando DNA polimerase de alta fidelidade para converter os oligos em fitas duplas (primers LibF e LibR na Tabela 1, configurações do termociclador na Tabela 2).
   2. Limpe os produtos de PCR usando colunas de purificação. Em detalhes, ligue o produto de PCR à membrana da coluna e, em seguida, lave com tampões contendo etanol a 70% para remover primers residuais, sais e polimerase. Finalmente, elui o produto de PCR purificado usando tampão com baixo teor de sal ou água sem nuclease.
   3. Verifique o tamanho do oligo amplificado por eletroforese em gel. Carregue 5 μL do produto de PCR purificado em um gel de agarose a 1,5% preparado em tampão TAE 1× (base Tris 40 mM, ácido acético 20 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0).
      NOTA: Limite os ciclos de amplificação de PCR a 15 para evitar superamplificação e viés de PCR. Uma banda difusa secundária, normalmente maior que o produto alvo, pode indicar superamplificação e recozimento incompleto dentro do pool de oligos. Salve uma parte dos produtos de PCR e sequencie o pool de oligo para avaliar a qualidade e as taxas de erro antes de prosseguir (ponto de parada).
2. Construção de minigenes de splicing MaPSy - PCR inicial.
   1. Fragmentos de backbone: Use 0,5 ng do backbone do plasmídeo pGint-CAMTA2 como fonte para os dois fragmentos principais de PCR
      1. Produto de PCR 1: Amplificar o promotor do CMV, o primeiro éxon (EGFP N-terminal) e parte do primeiro íntron (Tabela 1 e Tabela 2).
      2. Produto de PCR 3: Amplifica parte do éxon médio (CAMTA2 exon 15), o segundo íntron, o terceiro éxon (EGFP C-terminal) e o sinal de poliadenilação SV40 (Figura 3, Tabela 1 e Tabela 2).
   2. Amplicon de biblioteca: Produto de PCR 2: Para a biblioteca 3ss, amplifique os amplicons de biblioteca com sequências sobrepostas em cada extremidade para corresponder às extremidades internas do Produto 1 de PCR e do Produto 3 de PCR, permitindo uma integração eficiente nos 3'ss do éxon 15 de CAMTA2 (Figura 3, Tabela 1 e Tabela 2).
      NOTA: Para a biblioteca 5'ss, substitua a extremidade 5' da junção do éxon do meio pela sequência da biblioteca.
3. Após a PCR, limpe todos os produtos usando colunas de purificação conforme a etapa 2.1.2. Para evitar a contaminação do vetor molde, purifique os produtos desejados de PCR1 e PCR3 por extração em gel de agarose. Especificamente, após a eletroforese, excise ~ 100 mg de gel de agarose contendo o produto de PCR alvo e dissolva-o no tampão de ligação. Ligar a solução de gel dissolvido à membrana da coluna e, em seguida, prosseguir com o protocolo de purificação por PCR padrão.
4. Construção de minigenes de splicing MaPSy - PCR de extensão de sobreposição: Execute uma ou rodadas sequenciais de PCR sobreposta para ligar os três fragmentos principais (Produto de PCR 1, o amplicon de biblioteca e o Produto de PCR 3; use ~ 20 ng cada como modelo) em um minigene de splicing de comprimento total (use os primers mais externos CAMGFPF e CMVGFPR na Tabela 1 e as configurações do termociclador na Tabela 2).
   NOTA: O produto final contém o promotor CMV e três éxons com os primeiros 3's derivados da biblioteca de oligonucleotídeos, e está pronto para transfecção para experimentos baseados em células.
5. Após a montagem, limpe os modelos de DNA completos usando colunas de purificação de PCR. Se forem observadas bandas não específicas no gel, execute a extração do gel para isolar com precisão o produto completo desejado conforme a etapa 2.3.
   NOTA: Sequências muito semelhantes na biblioteca podem levar a uma montagem incompleta. Se a montagem completa em uma única reação de PCR for difícil, PCRs sequenciais sobrepostos (começando com dois fragmentos e adicionando um terceiro) podem ser tentados. Para melhorar a especificidade da PCR, considere ajustar a temperatura de recozimento ou implementar a PCR de toque para melhorar a especificidade de ligação para modelos complexos. Prepare construções MaPSy suficientes para realizar pelo menos quatro experimentos independentes. Guarde uma pequena alíquota de cada construção para sequenciamento de próxima geração para verificar a integridade da sequência, pois alguns oligonucleotídeos podem não amplificar com eficiência e resultar em montagens incompletas (ponto de parada).

Figura 3: Fluxo de trabalho de construção de bibliotecas. (A) Primers usados na PCR sobreposta (ver também Tabela 1). (B) O procedimento para sobreposição de PCR. Em resumo, os pools de oligo e as outras partes dos minigenes de splicing foram amplificados por 25 ciclos de PCR. O fragmento contendo o promotor e o primeiro éxon (produto de PCR 1) foi costurado ao pool de oligo (produto de PCR 2) por PCR sobreposto usando 20 ciclos de amplificação. Em seguida, o produto costurado (produto de PCR 1+2) foi costurado ao fragmento contendo o^3º éxon e o sinal de poliadenilação (produto de PCR 3) usando 20 ciclos de amplificação para obter a construção final (produto de PCR 1+2+3). Essa figura foi adaptada com permissão de Chiang et ^al.17. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Construção da cartilha da biblioteca MaPSy		nota
CMVGFPF	CCGCCATGCATTAGTTATTAATAG	Produto de PCR 1
LibR2	CAGGTCTTCAGGCCCCAGCC	Produto de PCR 1
LibF	GGCTGGGGCCTGAAGACCTG	PCR produto 2
LibR	AAGGCGCACATGACCCCGGG	PCR produto 2
LibF2	CCCGGGGTCATGTGCGCCTT	Produto 3 do PCR
CMVGFPR	GGACAAACCACAACTAGAATGC	Produto 3 do PCR
Primer de PCR da biblioteca MaPSy para sequenciamento de amplicon
P7-Lib0F	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P7-Lib1F	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNAAGTTCAGCGTGTGTCCGGCGA
P7-Lib2F	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNNAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P7-Lib3F	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGNNNAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
P5-Lib0RI	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCGAAGGCTCCTGTCTCTCTGTAGT
P5-Lib1RI	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNCGAAGGCTCCTCTGTCTCTGTAGT
P5-Lib2RI	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNCGAAGGCTCCTGTCTCTCTGTAGT
P5-Lib3RI	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNCGAAGGCTCCTGTCTCTCTGTAGT
Cartilha de validação
Lib0F (validação de biblioteca)	AAGTTCAGCGTGTCCGGCGA
Lib0R (validação de biblioteca)	CAGCTTGCCGTAGGTGGCAT

Tabela 1: Primers usados neste protocolo.

Mistura de reação de PCR
Componentes	Volume
ddH2O	13,4 μL
5x tampão HF	4 μL
10 mM dNTPs	0,4 μL
Primário direto 10 μM	0,5 μL
Primer reverso 10 μM	0,5 μL
cDNA	1 μL
DNA polimerase de alta fidelidade	0,2 μL

Execute o programa de PCR (reação de 20 μL)
	Temp	Hora	Ciclos
Desnaturação Inicial	98°C	1 minuto	1
Desnaturação	98°C	30 s	10–20
Recozimento	65°C	30 s
Extensão	72°C	30 s	Voltar para a desnaturação
Extensão final	72°C	5 min	1
Segurar	4°C	Segurar	Segurar

Tabela 2: Configurações do termociclador.

3. Expressão e recuperação de minigenes de splicing de células de mamíferos

1. Cultura celular: Manter HEK293T células em meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 unidades/mL de penicilina e estreptomicina 2 mM de L-glutamina em 5% de CO₂ a 37 °C.
2. Transfecção de minigenes de splicing:
   1. Placa 5 × 10⁵ células HEK293T em 2 mL de meio em placas de 6 poços 24 h antes da transfecção.
   2. Células transfectadas com 1-2 μg de construções MaPSy, pré-incubadas por 5 min com 3,75 μL de reagente de transfecção, seguindo o protocolo do fabricante. A transfecção bem-sucedida é indicada pela presença de sinais EGFP da biblioteca de emenda.
   3. Lisar as células usando 250 μL de Trizol (ou equivalente) 24 h após a transfecção.
3. Extração de RNA: Extraia o RNA total usando um kit de minipreparação de RNA, seguindo o protocolo do fabricante. Especificamente, ligue o RNA no Trizol às membranas da coluna, lave com tampões contendo 70% de etanol para remover sais, proteínas e outras impurezas e elui o RNA purificado usando tampão com baixo teor de sal ou água sem nuclease.
   CUIDADO: Trizol (ou equivalente) é altamente corrosivo e tóxico. A exposição pode levar a queimaduras químicas graves, cicatrizes permanentes e insuficiência renal.
   NOTA: O RNA pode ser armazenado em Trizol (ou um reagente equivalente à base de Trizol, como o extrator de RNA TOOLSmart da TOOLS) a -80 ° C por até um ano (ponto de parada). O RNA purificado pode ser armazenado a -80 °C por até dois anos se os ciclos de congelamento e descongelamento forem minimizados (ponto de parada).
4. Transcrição reversa: Prepare o cDNA a partir de 2 μg de RNA total usando transcriptase reversa com hexâmeros aleatórios, seguindo o protocolo do fabricante. Especificamente, incube o RNA com hexâmeros aleatórios de 50 μM à temperatura ambiente por 10 min para permitir o recozimento e, em seguida, execute a transcrição reversa a 55 ° C por 10 min.
   NOTA: o cDNA pode ser armazenado a -20 °C por até um ano (ponto de parada).
5. Amplificação dos minigenes emendados: Realize PCR usando as sequências de priming específicas para os minigenes emendados (Tabela 2). Use o número mínimo de ciclos necessários para visualizar o produto em um gel de agarose.
   NOTA: Bandas mistas de produtos não emendados e emendados devem ser visíveis no gel. As bandas podem parecer difusas devido à população mista de espécies de DNA (Figura 4A).
6. Limpar o produto PCR utilizando colunas de purificação conforme o passo 2.1.2.
7. Conexão de adaptadores de sequenciamento: Execute uma rodada final de PCR para anexar sequências de adaptadores de sequenciamento às extremidades do amplicon. Inclua 0-3 nucleotídeos aleatórios no final dos amplicons para garantir a detecção de fluorescência balanceada na plataforma NextSeq (Tabela 1).
8. Limpar o produto PCR utilizando colunas de purificação conforme o passo 2.1.2.

4. Sequenciamento e análise de amplicon

1. Sequenciamento de leitura curta: Sujeite os amplicons de PCR a 150 sequenciamentos de extremidade emparelhada usando Illumina Miseq, Novaseq ou equivalente, por meio de uma instalação central ou serviço comercial.
2. Alinhamento:
   1. Crie um genoma de referência: Crie um "genoma de referência" sintético rotulando cada genótipo único como um cromossomo separado. O genoma de referência inclui os éxons e íntrons sintéticos contidos nos amplicons.
   2. Alinhe as leituras de sequenciamento: Alinhe as leituras de extremidade emparelhada ao genoma de referência usando HISAT2^22,23, ajustando os parâmetros para controlar os elementos específicos de splicing (consulte o Arquivo Suplementar 2 para obter detalhes da linha de comando).
   3. Selecione leituras de alta qualidade: Converta SAM para o formato BAM, filtre leituras de alta qualidade (qualidade de mapeamento ≥60) e, em seguida, classifique e indexe os arquivos BAM²⁴ (consulte Arquivo Suplementar 2 para obter detalhes da linha de comando).
   4. Identifique junções de emenda e calcule as leituras de junção: Quantifique o uso da junção de emenda extraindo eventos de salto de exon de strings CIGAR no arquivo BAM alinhado. Identifique as leituras de abrangência de junção com base em "N" operações e agregue contagens de leitura por coordenada de junção e fita para avaliar padrões de emenda (consulte o Arquivo Suplementar 2 para obter detalhes da linha de comando).
   5. Classificar os locais de emenda canônicos: classifique os locais de emenda como canônicos se eles corresponderem às junções GT-AG anotadas.
      NOTA: Em casos raros, os alelos de referência no MaPSy podem utilizar sites de emenda não canônicos. As leituras que não têm junções abrangendo a posição do local de emenda designada são mantidas como leituras não emendadas.
3. Análise estatística para identificar variantes de splicing: categorize as leituras em três grupos:
   (1) leituras emendadas versus não emendadas;
   (2) canônico versus não canônico entre todas as leituras emendadas;
   (3) leituras canônicas versus não canônicas mais não emendadas.
   Realize um teste exato de Fisher bilateral, seguido de correção da taxa de descoberta falsa (FDR) (Tabela 3), para avaliar o impacto das variantes na eficiência e precisão do splicing.
4. Filtrar variantes de splicing de alta confiança: classifique os pares de referência/variante que excedem 100 contagens de leitura com um valor q inferior a 0,05 em quatro repetições como significativos. Em seguida, considere candidatos com uma mudança de razão de chances de 2 vezes com o alelo de referência ou variante tendo >5% de leituras não emendadas e não canônicas, variantes de splicing de alta confiança (Figura 4B).

Lê	Emendados	Não emendado e/ou não canônico
Referência	um	b
Variante	c	d

Tabela 3: Tabela dois por dois para o teste exato de Fisher.

5. Validação

1. Emenda de minigene para validação:
   1. Síntese e amplificação de oligos: Sintetize os oligos de DNA de sequências candidatas MaPSy selecionadas individualmente (por exemplo, por Tecnologias Integradas de DNA). Em seguida, amplifique os oligos usando as sequências flanqueadoras projetadas em fitas duplas por PCR usando DNA polimerase de alta fidelidade (Tabela 2).
   2. Clonagem de minigenes: Digerir os produtos de PCR resultantes e o pGint-CAMTA2 por BbsI e SmaI e ligar o produto digerido por DNA ligases.
   3. Transfecção: Transfecção das construções resultantes em células HEK293T usando um reagente de transfecção como etapa 3.2.2.
   4. Extração de RNA: Extraia o RNA das células transfectadas, conforme descrito na etapa 3.3.
   5. Transcrição reversa: Realize a reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa (RT-PCR) usando hexâmeros aleatórios.
   6. Amplificação de isoforma de splicing: Amplificar as isoformas de splicing com primers direcionados aos dois primeiros éxons do minigene (Lib0F e Lib0Rl, Tabela 1, configurações do termociclador na Tabela 2). Resolva os produtos amplificados por eletroforese e visualize usando o Gel Doc System.
   7. Quantificação: Quantifique a intensidade do sinal de cada isoforma de splicing usando ImageJ (National Institutes of Health, EUA) ^{25 , 26} . Como alternativa, use o kit de triagem de DNA usando o analisador de ácido nucleico de alto desempenho eGENE HDA-GT12 para quantificar a intensidade e o peso molecular dos produtos de PCR.
   8. Extração e confirmação de isoforma: Isole cada isoforma por extração em gel de agarose conforme a etapa 2.3 e confirme o resultado do splicing por sequenciamento Sanger dos produtos de PCR por meio de uma instalação central ou serviço comercial, avaliando o splicing normal, inclusão de íntrons e salto de exon.
2. Minigenes de splicing de múltiplos exons:
   1. Depois de validar os resultados do MaPSy, selecione a variante de interesse e clone de três a cinco éxons do DNA genômico (gDNA) para fornecer um contexto mais genômico para o defeito de splicing observado.
   2. Realize mutagênese dirigida ao local usando primers mutagênicos e PCR sobrepostos para montar construções de minigenes que abrigam a alteração de sequência desejada no local alvo.
      NOTA: Se os íntrons flanqueadores forem muito longos para clonagem, retenha aproximadamente 300 nt da sequência intrônica para cada local de emenda para garantir um contexto de splicing adequado.
   3. Efectuar o ensaio de splicing baseado em células como descrito acima em 5.1.
3. Validação celular: Para validar o efeito de splicing nas células, use a edição CRISPR baseada em modelo para alterar a sequência das variantes selecionadas em um modelo celular apropriado.
   NOTA: Quando possível, use amostras humanas carregando a variante específica para avaliar o padrão de splicing diretamente.

Resultados

Após o splicing celular de construções MaPSy, produtos emendados e não emendados estão presentes como uma mistura. Devido à diversidade de tamanho da biblioteca e ao potencial para emendas não canônicas, ambos os tipos de produtos podem parecer um tanto difusos em um gel. Em construções direcionadas à extremidade 3 ', o segundo íntron, contendo sequências parciais de adenovirais, tende a se unir de forma muito robusta ( Figura 4A ).

Em experimentos MaPSy, aproxima...

Discussão

O sinal EGFP intrínseco na construção MaPSy permite a detecção baseada em fluorescência de salto de exon. Se a sequência no éxon médio ou íntrons promover o salto de éxons, a ligação do primeiro e terceiro éxons produz um sinal EGFP detectável por FACS, tornando este um método valioso para identificar variantes que influenciam o salto de éxons e facilitar a visualização baseada em microscopia de variantes de splicing¹³. No entanto, a abordagem de sequenciamento de...

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Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit MiniPrep Plus de RNA Direct-zol	Pesquisa Zymo	R2072
Dulbecco' s Águia Modificada' s Medium (DMEM)	Thermo Fisher Científico	11965084
Soro fetal bovino (FBS)	Thermo Fisher Científico	26140079
L-Glutamina	Thermo Fisher Científico	A2916801
Lipofectamina 3000	Thermo Fisher Científico	L3000015
Penicilina-estreptomicina	Thermo Fisher Científico	15140122
plasmídeo pGint	Addgene	24217
Polimerase de DNA de alta fidelidade Phusion	Thermo Fisher Científico	F530L
Kit de extração de gel QIAquick	Qiagen	28706
Kit de Purificação PCR QIAquick	Qiagen	28106
Kit de triagem de DNA QIAxcel (2400)	Qiagen	929004
Transcriptase reversa SuperScript IV	Thermo Fisher Científico	18090010