Artigo de método

Fabricação baseada em recombinação de vetores virais projetados para pesquisa e terapia

DOI:

10.3791/68988

⸱

26 de setembro de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CEINGE Biotecnologie Avanzate Franco Salvatore S.C.aR.L., 2Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples Federico II, 3ImGen-T Srl

Neste artigo

Resumo

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A recombinação, um método de engenharia genética mediado por recombinação, permite modificações precisas do genoma viral sem depender da digestão enzimática. Essa abordagem é crucial para a pesquisa básica, como deleções direcionadas, e para o desenvolvimento de vírus modificados usados em terapias oncolíticas, terapia genética e vacinas genéticas, expandindo as possibilidades tanto em pesquisas quanto em aplicações clínicas.

Resumo

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A crescente demanda por vetores virais modificados em pesquisas básicas e translacionais ressaltou a necessidade de métodos flexíveis, rápidos e escaláveis para gerar vírus de DNA recombinantes. As estratégias que dependem da digestão e ligação da enzima de restrição são limitadas por limitações dependentes da sequência e etapas de clonagem demoradas. Aqui, descrevemos o método de engenharia genética mediado por recombinação (recombinação) que contorna essas limitações, permitindo modificações precisas e contínuas de genomas virais em cromossomos artificiais bacterianos (BACs). Essa abordagem permite a exclusão, inserção ou substituição eficiente de elementos genéticos codificantes ou não codificantes, fornecendo uma plataforma poderosa para o desenvolvimento de vetores virais de alto rendimento. A recombinação é particularmente valiosa em aplicações de pesquisa básica, como a deleção ou mutação de genes virais para investigar sua função. Mais importante, essa metodologia permite a geração de dezenas de vírus recombinantes que codificam cargas imunoestimulantes ou terapêuticas distintas em paralelo, tornando-a excepcionalmente adequada para a avaliação pré-clínica rápida de novas construções. Embora essa tecnologia possa ser potencialmente implementada para qualquer finalidade científica, este artigo se concentra na aplicação da recombinação em duas áreas específicas: a geração de vírus oncolíticos baseados no vírus herpes simplex e o desenvolvimento de vetores adenovirais não replicativos para transferência de genes. Em conclusão, a recombinação oferece uma abordagem versátil para a engenharia do genoma viral, acelerando significativamente o pipeline desde o design até o teste funcional. Sua relevância abrange desde a virologia fundamental até a medicina translacional para atender às necessidades clínicas e de pesquisa em evolução.

Introdução

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Os vetores virais surgiram como ferramentas potentes na terapia genética, viroterapia oncolítica e desenvolvimento de vacinas genéticas devido à sua capacidade natural de fornecer material genético às células hospedeiras. Eles alavancam os mecanismos naturais de tropismo e transdução dos vírus, facilitando a expressão gênica transitória e de longo prazo. Eles são capazes de sobreviver no ambiente extracelular, de se ligar a um receptor celular específico (que define o tropismo viral) e promover sua internalização, de sequestrar a maquinaria de expressão gênica da célula hospedeira e conduzir a expressão de seus próprios genes, e de iludir sensores intracelulares e ligados à membrana do braço imune inato 1,2. Dessa forma, após uma infecção viral produtiva, os vírus transformam as células em fábricas de progênie viral que espalham novos vírus no organismo, eventualmente causando uma doença.

Os vírus do tipo selvagem podem ser transformados em uma ferramenta biotecnológica por engenharia genética: seu genoma pode ser facilmente manipulado para reter a capacidade de transdução e obter um resultado clínico. Com base em sua aplicação clínica, os vetores virais podem ser projetados para reter (pelo menos em parte) ou ser ablacionados em sua competência de replicação para gerar vetores competentes ou incompetentes para replicação 3,4.

Os vírus competentes para replicação destinam-se principalmente a fins de vírus oncolíticos. As células cancerígenas, muitas vezes deficientes em defesas antivirais1, permitem a replicação de vírus recombinantes atenuados projetados por meio da deleção de genes de virulência. Esses vírus se replicam seletivamente em tumores, poupando o tecido normal. À medida que a compreensão da virologia avançou, os vírus atenuados foram substituídos por modificações mais precisas do genoma, projetadas para aumentar a segurança e a eficácia terapêutica.

Entre os campos de interesse que requerem engenharia molecular cirúrgica de genomas virais estão: i) Vírus oncolíticos condicionados à replicação, onde os promotores virais são substituídos por promotores associados a tumores (promotores celulares transcritos em células tumorais), restringindo assim a expressão gênica viral às células doentes5. ii) Vírus com tropismo alterado 6,7, onde as glicoproteínas do envelope que determinam a infecção podem ser modificadas ou substituídas por fragmentos de anticorpos ou ligantes que têm como alvo proteínas superexpressas em células tumorais 8,9. iii) Vírus oncolíticos armados. A morte celular tumoral induzida por vírus oncolíticos desencadeia a morte celular imunogênica (CDI), caracterizada pela liberação de mediadores inflamatórios 1,10 e antígenos tumorais11. Esses sinais promovem o reconhecimento eficiente de antígenos tumorais pelo sistema imunológico, restaurando a vigilância12e permitindo a combinação com inibidores de checkpoint imunológico 13,14,15 e outras terapias imunológicas, como terapias e vacinas baseadas em RNA16.

Em apoio a esse efeito imunoterapêutico, os transgenes de interesse podem ser codificados dentro do genoma viral, explorando assim o vírus não apenas por sua atividade oncolítica, mas também para aumentar seu potencial imunoterapêutico por meio da produção in situ de cargas úteis relevantes 3,7,17,18,19. Essas cargas úteis podem incluir citocinas, quimiocinas, anticorpos, genes suicidas e antígenos 3,20. A inserção requer precisão, com regiões intergênicas do genoma viral preferidas para minimizar a interrupção dos genes virais e preservar a replicação e a potência7. Portanto, técnicas que permitam a triagem de locais de inserção ideais e transgenes de interesse são essenciais.

Por outro lado, no contexto de vírus não replicativos, usados para terapia gênica ou como veículos para vacinas genéticas, é importante que o vetor viral entregue o transgene (transitoriamente ou de longa duração) sem se replicar na célula hospedeira para evitar toxicidade21. Os vetores adenovirais são caracterizados por alta eficiência de transdução, expressão robusta de transgenes e capacidade de infectar células em divisão e não em divisão3. Essas propriedades os tornaram os primeiros da classe para o desenvolvimento de vacinas genéticas, incluindo aquelas para doenças infecciosas emergentes, como COVID-19, bem como terapias de substituição de genes22. O exemplo mais famoso de um vetor adenoviral que chegou ao mercado é a vacina Oxford-AstraZeneca COVID-19, conhecida pelo nome comercial de Covishield ou Vaxzevria, baseada em um adenovírus de chimpanzé modificado, ChAdOx1, que codifica a proteína Spike do SARS-CoV-2. Quando injetado por via intramuscular, o Covishield é capaz de penetrar no interior das células e induzir a expressão da proteína Spike, preparando o sistema imunológico para montar uma resposta imune contra ela3.

Há uma clara necessidade de modificar genomas virais sem ser restringido por locais de reconhecimento de enzimas de restrição. Entre os vírus oncolíticos, os vetores baseados no Herpes Simplex Virus-1 (HSV-1) oferecem vantagens únicas, incluindo capacidade lítica, segurança e grande tamanho do genoma, permitindo a inserção de transgenes consideráveis ou múltiplos elementos genéticos23,24. Além do HSV, muitos outros vírus mostram promessa terapêutica, como recentemente revisado em Sasso et al.3. Em vez de um vetor universal "best-in-class", diferentes plataformas virais são adequadas a necessidades terapêuticas distintas3. Atualmente, os sistemas de recombinação homóloga em bactérias ou clonagem híbrida de levedura-bactéria continuam sendo as alternativas mais comuns às enzimas de restrição, mas são trabalhosas, de várias etapas e ineficientes25.

Uma alternativa emergente é o uso de CRISPR/Cas9, recentemente aplicado para projetar genomas de vírus, incluindo o vírus vaccinia (VV), o vírus herpes simplex e vetores adenovirais. Cas9 é atraente para a inativação de genes por meio de mutações indel, mas se torna menos prático quando vários cortes são necessários para excluir segmentos do genoma ou inserir um transgene via DNA do doador. Além disso, a edição é limitada pelo design do gRNA, efeitos fora do alvo nos genomas viral e do hospedeiro e dependência de sequências PAM em regiões de interesse25.

Com isso em mente, e por meio de dois exemplos baseados em HSV e adenovírus, este artigo ilustra o método de recombinação, que pode ser aplicado amplamente - de vírus a bacteriófagos, plasmídeos complexos e diversos sistemas experimentais. A recombinação é uma técnica de engenharia genética in vivo , usada principalmente em Escherichia coli, que explora proteínas de recombinação de bacteriófagos dependentes da temperatura para catalisar a recombinação homóloga entre elementos de DNA com apenas 30 pb de homologia26. Essa abordagem permite a inserção, exclusão ou modificação precisa de sequências sem dependência de locais de restrição ou tamanho de DNA. Neste manuscrito, descrevemos uma versão baseada na cepa SW102 de E. coli induzível pelo calor, embora cepas alternativas com sistemas induzíveis específicos também estejam disponíveis27.

A recombinação começa com a preparação de células bacterianas eletrocompetentes por meio de um choque de temperatura controlada para ativar o maquinário de recombinação de fagos. As moléculas de DNA que carregam os braços de homologia apropriados são então eletroporadas. Estes podem ser DNAs de fita dupla (dsDNA) gerados por digestão de restrição ou PCR ou DNAs de fita simples (ssDNAs), como oligonucleotídeos. A presença de sequências homólogas juntamente com proteínas de recombinação ativas permite a criação de novas moléculas de DNA com a modificação desejada.

A tecnologia de clonagem molecular recombinante permite engenharia genética precisa e é aplicada em diversos contextos, incluindo a inserção de marcadores selecionáveis ou não selecionáveis em plasmídeos, DNA cromossômico bacteriano e cromossomos artificiais bacterianos (BACs). Os BACs são particularmente valiosos para a clonagem de grandes fragmentos genômicos, incluindo DNA adenoviral e HSV, permitindo a rápida produção de vetores virais. Além das aplicações translacionais, a recombinação também apóia a pesquisa básica, permitindo a exclusão, modificação ou substituição direcionada de genes virais ou domínios de proteínas. A recombinação tem algumas limitações: braços de homologia curtos dificultam a recombinação em regiões repetitivas; Substratos amplificados por PCR podem ocasionalmente introduzir mutações; e a sequência da região alvo deve ser conhecida.

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Protocolo

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Como pré-requisito para a recombinação, uma cepa bacteriana proficiente (por exemplo, SW102) com um genoma de interesse BAC deve estar disponível. Embora a recombinação seja um método altamente eficiente para enriquecer colônias que sofreram a modificação desejada, aqui descrevemos uma estratégia de recombinação em duas etapas, conhecida como primeira e segunda etapas (Figura 1). Na primeira etapa, um de expressão contendo marcadores de seleção positivos e negativos é inserido no locus de interesse. Na segunda etapa, este é substituído pela modificação genética real destinada ao genoma final. Os marcadores de seleção usados neste estudo incluem resistência à ampicilina (AmpR), atividade da beta-galactosidase (β-gal) e o gene sacB ; no entanto, qualquer combinação de marcadores de seleção positivos e negativos pode ser empregada, dependendo das necessidades específicas do grupo de pesquisa.

1. Insira o de seleção na região de destino

  1. Dia 0
    1. Liste as células SW102 contendo o BAC desejado em LB Agar + antibiótico (cujo gene de resistência está no BAC (por exemplo, cloranfenicol 12,5 μg / mL). Cultive-os durante a noite na incubadora a 32 °C.
      NOTA: Evite temperaturas > 32 ° C para evitar a indução de genes recombinadores durante esta fase.
  2. Dia 1
    1. Realize uma PCR para amplificar o de seleção AmpR/LacZ/SacB. Use primers diretos e reversos contendo na extremidade 3 'a sequência para recozer e amplificar o de seleção e na extremidade 5 '30-80 pb que representam braços de homologia para a região genômica viral a ser modificada (Tabela 1).
      NOTA: O de seleção, bem como o inserto, podem ser facilmente encomendados como construções sintéticas de fornecedores especializados. No entanto, deve-se tomar cuidado para evitar a presença de promotores, terminadores ou outros elementos genéticos duplicados dentro do BAC (controlando os genes BAC) ou no genoma viral para evitar eventos de recombinação indesejados.
    2. Garanta a identidade e a pureza do fragmento de PCR por eletroforese em gel de agarose (como o AmpR/LacZ/SacB é de 3.400 pb, execute um gel de agarose a 1%) e que os valores de 260/230 e 260/280 estejam alinhados com o ácido nucléico puro.
    3. À tarde, inocular uma única colónia SW102 em 5 ml de LB e incubar durante a noite a 32 °C.
  3. Dia 2
    1. Inocule 1-2 mL da cultura noturna em 100 mL frescos de LB. Aumente a bactéria para um OD600 de 0,55-0,7, medindo o OD600 regularmente para não perder a fase exponencial.
    2. Prepare um banho-maria a 42 °C para indução e resfrie a 4 °C ~ 250 mL de ddH2O estéril para lavagens.
    3. Quando a cultura atingir a DO desejada, transferir 50 ml para um tubo cónico limpo e incubar a 42 °C em banho-maria durante 15 min. Inclua um controle negativo não induzido.
      NOTA: Esta etapa induzirá proteínas vermelhas lambda.
    4. Deixe os tubos no gelo por 10 min e depois centrifugue por 5 min a 3.200 × g a 4 ° C (induzido a 42 ° C e não induzido).
    5. Rejeitar o sobrenadante, adicionar 40 ml de ddH2O esterilizado e gelado e ressuspender o sedimento (induzido a 42 °C e não induzido).
    6. Centrifugue novamente por 8 min (consulte a etapa 1.3.4) e repita a etapa de lavagem (etapa 1.3.5) e centrifugação. Repita a etapa de lavagem até que o sobrenadante esteja límpido como água (sem turbidez e suspensões) (2-4 lavagens).
    7. Após a última centrifugação, rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 μL de ddH2O estéril e gelado (induzido e não induzido a 42 °C).
    8. Transfira uma alíquota dos pellets ressuspensos (50 μL de HSV-1 e 25 μL de Adeno) para tubos pré-resfriados de 1,5 mL (induzidos a 42 ° C e não induzidos). Adicione 50-400 ng de produto PCR purificado (não exceda 5μL). Agite os tubos e incube no gelo por 5 min.
    9. Transfira a mistura da etapa anterior para uma cubeta pré-resfriada e eletroporada a 2,50 kV (cubeta de 2.500 V, 0,2 cm) (induzida a 42 °C e não induzida).
    10. Após a eletroporação, permita que as bactérias se recuperem em 1 mL de LB por 1,5 h a 32 ° C. Adicione 1 mL de LB à cubeta para limpá-la e coletar tudo.
    11. Espalhe diferentes quantidades de bactérias (10, 50, 200 μL) em Ágar LB + Ampicilina (100μg/mL), X-Gal (20 μg/mL) e IPTG (0,5 mM) e deixe-as crescer durante a noite (ON) a 32 °C.
    12. Prepare as placas com AMP/X-Gal (mesma concentração da etapa 1.3.11) e placas comsacarose 5.
  4. Dia 3
    NOTA: Neste ponto, espera-se que as colônias tenham crescido e que apareçam azuis, mas apenas nas placas onde as bactérias foram induzidas a 42 ° C e eletroporadas com o inserto contendo o de seleção foram plaqueadas. Uma vez estabelecido, é necessário verificar a integridade do de seleção em algumas das colônias.
    1. Identifique as placas de ON onde as colônias são <50 para evitar a escolha de duas ou mais colônias. Escolha várias colônias (normalmente 8-10 são suficientes para identificar pelo menos uma colônia adequada) e dilua-as em aproximadamente 50 μL de H2O. Inocule colônias azuis únicas em 50 μL de H2O e listre-as em placas seletivas negativas (LB Ágar / Sacarose / Cloranfenicol) e positivas (LB Ágar / Ampicilina / Cloranfenicol / X-Gal / IPTG) (mesma concentração das etapas 1.1.2 e 1.3.11) (Figura 2).
      NOTA: Espera-se encontrar 20-100 colônias na placa, onde 50 μL foram espalhados. No entanto, se o número de colônias for menor, isso não significa necessariamente que a recombinação esteja comprometida.
    2. Inocular a água do passo 1.4.1 em 5 ml de LB e incubar as placas e a cultura de LB durante a noite a 32 °C (figura 2).
  5. Dia 4
    1. Selecione apenas colônias azuis que cresceram em placas Amp / X-Gal e não cresceram em placas de sacarose (Figura 3). Para esses clones positivos (Tabela 2), transfira uma alíquota de 500 μL da cultura durante a noite para 50 mL de LB fresco.
  6. Dia 5
    1. Para cada clone positivo, preparar uma facada de glicerol e extrair e isolar o plasmídeo BAC (midiprep).
    2. Após a extração do BAC, execute o controle de qualidade para verificar se a recombinação ocorreu corretamente. Realize o sequenciamento Sanger do local de inserção. Se tudo estiver correto, prossiga com a segunda seção.

2. Substitua o de seleção pela modificação desejada

  1. Dia 0
    1. Listre o clone positivo no ágar LB. Incubar durante a noite a 32 °C.
  2. Dia 1
    1. Realize uma PCR para amplificar a inserção/modificação. Use primers diretos e reversos contendo na extremidade 3' a sequência para recozer e amplificar o de seleção e na extremidade 5' os mesmos braços de homologia de 30-80 pb usados na etapa 1.3.1 (Tabela 1).
    2. Garantir a identidade e a pureza do fragmento de PCR por eletroforese em gel de agarose e que os valores de 260/230 e 260/280 estejam de acordo com o ácido nucléico puro.
    3. Inocular uma única colónia em 5 ml de LB e incubar durante a noite a 32 °C.
  3. Dia 2
    1. Transfira 2 mL da cultura durante a noite para 100 mL de LB e cresça a 32 ° C até que OD600 atinja 0,55-0,7 (em ~ 2,5-3 h). Prepare um banho-maria a 42 °C para indução e resfrie a 4 °C ~ 250 mL de ddH2O estéril para lavagens.
    2. Uma vez atingida a DO desejada, transferir 50 ml de cultura para um tubo cónico e incubar em banho-maria a 42 °C durante 15 min para induzir as proteínas de recombinação de λ-fagos. Mantenha outro tubo de 50 ml a 32 °C como controlo não induzido.
    3. Após a indução de calor, coloque os tubos no gelo por 10 min.
    4. Centrifugue por 8 min a 3.200 × g a 4 °C (induzido a 42 °C e não induzido).
      NOTA: A partir deste ponto, trabalhe no gelo para manter a competência da célula SW102.
    5. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet com 40 mL de água pré-resfriada girando suavemente.
    6. Centrifugue por 5 min a 3.200 × g a 0-4 °C.
    7. Repita a etapa de lavagem (etapa 2.3.5) uma vez.
    8. Remova o sobrenadante e ressuspenda suavemente o pellet em 100 μL de água.
    9. Transferir uma alíquota dos grânulos ressuspensos (50 μL de HSV-1 e 25 μL de Adeno) para tubos pré-arrefecidos de 1,5 ml (induzidos a 42 °C e não induzidos). Adicione 50-400 ng de produto de PCR purificado (não exceda 5 μL). Agite os tubos e incube no gelo por 5 min.
    10. Transferir a mistura da etapa anterior para uma cubeta pré-arrefecida e eletroporar a 2,50 kV (induzida a 42 °C e não induzida).
    11. Deixe as células se recuperarem em 5 mL de meio LB por 4-5 h a 32 ° C com agitação.
      NOTA: O tempo de recuperação é maior do que na primeira etapa de recombinação para permitir a degradação da proteína SacB residual após a substituição do.
    12. Plaquear diferentes quantidades (50, 200, 500 μL) de cultura em placas de Petri de ágar LB contendo sacarose, X-Gal e IPTG (mesma concentração das etapas 1.1.2 e 1.3.11). Incubar durante a noite a 32 °C.
  4. Dia 3
    1. Rastreie um número substancial de colônias (20-100) para aumentar a probabilidade de identificar clones positivos que foram recombinados com sucesso com o fragmento que carrega a modificação desejada e o de seleção. Realize uma triagem de primeiro nível usando PCR de colônia. Use uma placa de Petri com uma grade; escolha colônias de um determinado quadrante e rotule-as (Figura 4).
      NOTA: Uma abordagem particularmente eficaz envolve o uso de um par de primers em que um primer recoze fora da região alvo (no genoma viral) e o outro dentro do fragmento recombinado (Figura 5).
    2. Verificar a presença e o tamanho do amplicon de PCR por gel de agarose (1,5%).
    3. Escolher no quadrante correcto os clones positivos e inocular em 100 ml de LB. Incubar durante a noite a 32 °C.
  5. Dia 4:
    1. Execute um midiprep para extrair o plasmídeo de culturas bacterianas.
    2. Digerir o plasmídeo com enzimas de restrição e executar um gel de agarose para analisar o padrão de digestão.
    3. Se o padrão de digestão estiver correto, prossiga com o sequenciamento da região modificada do genoma viral.
    4. Depois de garantir a identidade molecular dos clones recombinantes, proceda-se à transfecção e resgate das partículas virais.

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Resultados

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Geração de um vírus do herpes oncolítico codificador de IL12
Conforme descrito na seção introdutória deste trabalho, uma aplicação potencial da recombinação é a inserção de transgenes imunoestimuladores no genoma de vírus oncolíticos, com o objetivo de aumentar seu potencial imunoterapêutico. Abaixo, apresentamos um exemplo de tal aplicação usando um vetor oncolítico baseado em HSV-1. Especificamente, este estudo investiga o impacto da inserção de um transgene em um locus intergênico dentro da região ...

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Discussão

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Este protocolo de "RECOMBINEERING" (engenharia genética mediada por RECOMBInação homóloga) usa uma estratégia de duas etapas: primeiro, a integração de um de seleção no locus genômico de interesse e, segundo, a substituição desse pela modificação desejada (Figura 1).

Os marcadores de seleção usados incluem resistência à ampicilina (AmpR), beta-galactosidase (β-gal) e sacB. O AmpR permite a seleção baseada na resistência a antibiót...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm interesses financeiros ou não financeiros relevantes a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado por: PRIN 2022-MUR Itália, Grant 20224NCSN5 (PreMeRetHOn). POR Campania: piattaforma per lo sviluppo di nuove tecnologie vaccinali. PNRR CN3 Centro Nacional de Terapia Gênica e Medicamentos baseados na Tecnologia de RNA. PNRR PE13 One Health Ações de investigação básica e translacional que respondem às necessidades não satisfeitas em matéria de doenças infecciosas emergentes. Os autores agradecem ao serviço de síntese Geneart por fornecer DNAs personalizados. Os autores também expressam sincera gratidão a Michele Veneruso, que contribuiu para a conclusão bem-sucedida deste estudo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AmpicilinaqualquerqualquerGrau molecular
Para oligo amplificar Il-12: CTGGCTAGCGTTTAA
ACGGGCCCTCTAGACTCG
AGCGGCCGCACGCCACCA
TGTGTCCTCAGAAGCTAACC		qualquerqualquerHPLC purificada
Para oligo para amplificar AmpR/LacZ/SacB  : CTGGCTAGCGTTTAAA
CGGGCCCTCTAGACTCGAG
CGGCCGCACGCCACCACC
CCTATTTGTTTATTTTTC		qualquerqualquerHPLC purificada
IPTGqualquerqualquerGrau molecular
ágar LB
LB médio
Polimerase DNA de Alta Fidelidade Phusion Hot Start II Thermo CientíficoF549S
Rev oligo para amplificar Il12: GGCAACTAGAAGGCA
CAGTCGAGGCTGATCAGC
GGTTTAAACTTAAGCTTTC
AGGCGGAGCTCAGATAG 		qualquerqualquerHPLC purificada
Rev oligo para ampliar AmpR/LacZ/SacB  : GGCAACTAGAAGGCAC
AGTCGAGGCTGATCAGC
GGTTTAAACTTAAGCTTT
TATTTGTTAACTGTTAATTG 		qualquerqualquerHPLC purificada
de seleção SacB / AmpR / LacZEste manuscrito--
SacarosequalquerqualquerGrau molecular
SW102 com BAC-HSV-1 ou BAC-AdvEste manuscrito--
TriptonaqualquerqualquerGrau molecular
Wizard SV GelPromegaA9281
X-galqualquerqualquerGrau molecular
Extrato de leveduraqualquerqualquerGrau molecular

Referências

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