Avaliação da segurança microbiana de laticínios usando perfil proteômico bacteriano via abordagem MALDI

Resumo

Este protocolo permite uma avaliação rápida e econômica da composição microbiana em produtos lácteos, combinando culturomics com MALDI-TOF MS. Ele fornece resultados de taxonomia comparáveis ao sequenciamento de rRNA 16S com um tempo de resposta mais curto do que os métodos tradicionais de cultura.

Resumo

Apresentamos um protocolo usando o método de identificação de espectrometria de massa por tempo de voo de dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI-TOF MS, doravante denominado "MS") para monitorar a presença de microrganismos em diferentes produtos lácteos (manteiga, queijo mussarela, leite, creme) usando uma abordagem proteômica, culturômica moderna e vários procedimentos de preparação de amostras que podem ser incorporados aos laboratórios de controle de qualidade de segurança alimentar como um rápido, Ferramenta confiável e robusta para monitorar a segurança microbiana. Inclui uma etapa de isolamento microbiano, coleta de colônias cultivadas, procedimentos de preparação de amostras (células intactas, extração no local e no tubo), definição de parâmetros de análise de MS, geração e coleta de espectros de MS (impressões digitais de proteínas) e, finalmente, obtenção de taxonomia usando a plataforma MS, seguida de interpretação e visualização de dados. Este método, validado por vários estudos, oferece uma identificação mais confiável e econômica de microrganismos do leite em comparação com sistemas de teste bioquímicos comerciais. Destaca-se como um avanço promissor em microbiologia de alimentos, atendendo aos diversos requisitos dos laboratórios por meio de seus protocolos simples e tempo de análise significativamente reduzido. O protocolo apresentado atende às necessidades da indústria alimentícia, fornecendo identificação microbiana confiável em um tempo de resposta adequado (TAT) que seja adequado aos processos de fabricação.

Introdução

O objetivo geral deste protocolo é fornecer uma metodologia abrangente para monitorar a segurança microbiana de vários produtos lácteos, incluindo manteiga, queijo, leite e creme, empregando MS para perfil proteômico bacteriano. Essa abordagem, que combina culturômica moderna com procedimentos otimizados de preparação de amostras, pretende ser uma ferramenta rápida, confiável e robusta para laboratórios de controle de qualidade e segurança alimentar. A lógica por trás da criação e aplicação dessa metodologia vem das limitações dos métodos padrão de identificação microbiana. Por muitos anos, os laboratórios veterinários e de diagnóstico de alimentos confiaram em testes bioquímicos convencionais que examinam o crescimento e o metabolismo bacteriano em meios de cultura diferenciais, seguidos por vários ensaios enzimáticos¹. Embora esses métodos, frequentemente baseados em diretrizes padrão como as do Manual de Bacteriologia Determinativa de Bergey, sejam relativamente baratos e possam produzir dados quantitativos e qualitativos, eles são trabalhosos e demorados, exigindo extensa preparação de meios, diluição de amostras, plaqueamento, incubação, contagem de colônias, isolamento e etapas de caracterização detalhada ^2,3.

A introdução de sistemas comerciais semiautomatizados e automatizados, como Analytical Profile Index (API), BBL Crystal, Vitek e Biolog MicroPlates, simplificou a identificação microbiana usando ensaios bioquímicos, reduzindo assim os custos e os tempos de resposta. No entanto, esses sistemas apresentam algumas desvantagens, como baixa reprodutibilidade, falta de entradas em seus respectivos bancos de dados e dificuldades em determinar variações fenotípicas entre cepas, particularmente para bactérias não fermentativas ou cepas dentro de uma espécie com pequenas diferenças bioquímicas, o que pode levar a resultados in vitro incorretos⁴. Diante disso, a EM evoluiu como uma alternativa potente, atualmente comum em microbiologia clínica e ganhando atenção em laboratórios de diagnóstico veterinário e qualidade do leite. Essa abordagem foi complementada por sua velocidade, precisão e custo-benefício na detecção de vários microrganismos¹. Numerosos estudos demonstraram que a EM oferece uma identificação mais confiável de microrganismos do leite, fornecendo resultados mais rápidos e baratos do que os sistemas comerciais de teste bioquímico ^5,6,7. Embora os testes bioquímicos possam ser suficientes para a identificação em nível de gênero ou grupo, o diagnóstico em nível de espécie geralmente requer métodos mais avançados, como MS ou sequenciamento de rRNA 16S⁸. De fato, o MS é considerado uma plataforma promissora para identificação flexível e confiável de isolados microbianos de alimentos, atendendo a diversos requisitos de laboratórios de microbiologia de alimentos por meio de seus protocolos simples e tempo de análise significativamente reduzido, aumentando assim a segurança alimentar ^4,5. Os custos operacionais são mínimos devido ao baixo consumo de reagentes, e o manuseio de amostras permite maior automação e alto rendimento⁸. No entanto, deve-se notar que a utilidade deste método é inerentemente dependente das condições de crescimento microbiano selecionadas (incluindo o tipo de meio de cultura) e de uma cobertura de espécies de banco de dados de referência, que são reconhecidas como os principais fatores que limitam sua utilidade.

A EM desempenha um papel significativo na microbiologia de alimentos, identificando e diferenciando bactérias patogênicas transmitidas por alimentos, bactérias do ácido lático (BAL) e outras bactérias fermentativas⁹. Sua utilidade se estende à culturômica moderna, permitindo a identificação de todas as colônias microbianas cultivadas em meios de cultura e facilitando a aquisição de informações sobre unidades formadoras de colônias (UFC)⁷. Essa abordagem já foi aplicada com sucesso para descobrir comunidades microbianas complexas como as presentes no intestino humano, envolvidas em infecções do pé diabético ou conectadas ao trato urinário, revitalizando métodos dependentes de cultura em práticas microbiológicas^10,11.

Este protocolo é apresentado para orientar os laboratórios na implementação eficaz do MS para a avaliação de rotina da segurança microbiana em produtos lácteos, atendendo à necessidade da indústria de identificação microbiana confiável dentro de um tempo de resposta prático (TAT) adequado para processos de fabricação. O protocolo detalha etapas cruciais, incluindo (1) isolamento microbiano de produtos lácteos líquidos (leite, creme, soro de leite) e sólidos (manteiga, queijo) usando uma seleção de meios de cultura apropriados (ágar Man, Rogosa e Sharpe - ágar MRS, ágar M-17, ágar Tween 80 para todos os fins - ágar APT, ágar China Blue Lactose - ágar CBL, ágar Milk Plate Count - MPCA, ágar soja tríptica - TSA) e condições de incubação adaptadas; (2) procedimentos padronizados de preparação de amostras para análise de EM, oferecendo opções como transferência direta de colônias, extração de ácido fórmico no alvo e extração de proteína de etanol/ácido fórmico em tubo para acomodar diferentes tipos de bactérias e fluxos de trabalho laboratoriais; e (3) análise sistemática de MS, incluindo calibração de instrumentos, definição de parâmetros ideais de aquisição de espectros e diretrizes para interpretação de dados, incluindo avaliação do valor da pontuação e verificações de consistência para atribuição taxonômica confiável. Ao fornecer uma abordagem estruturada e validada, este protocolo visa aumentar a precisão e a eficiência do monitoramento microbiano na indústria de laticínios, contribuindo para melhorar a qualidade dos alimentos e a saúde pública.

Protocolo

Os reagentes e os equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Isolamento de bactérias relacionadas a laticínios

1. Obtenção de culturas bacterianas de produtos lácteos líquidos ou sólidos
   1. Seleção de meios de cultura
      1. Para isolamento bacteriano de amostras de laticínios, selecione os meios de cultura de acordo com os grupos microbianos esperados, incluindo meios de crescimento geral, meios para bactérias Gram-negativas, bactérias do ácido lático (BAL), bactérias formadoras de esporos, bem como microrganismos de crescimento lento ou exigentes.
         NOTA: Para maximizar a recuperação de espécies dominantes e raras, vários meios devem ser inoculados em paralelo. Um conjunto de meios de exemplo para análise de microbioma de amostras de laticínios é apresentado na Tabela 1.
   2. Inoculação e plaqueamento
      1. Obtenha uma amostra representativa do produto lácteo e misture bem.
      2. Transfira assepticamente 1 mL (amostras líquidas: leite, creme, leitelho) ou 1 g (amostras sólidas: queijo, manteiga) da amostra para um tubo centrífugo cônico de 15 mL contendo 9 mL de meio líquido estéril (água peptonada / solução de NaCl a 0,85%). Para amostras sólidas, aqueça o meio líquido a 40-42 °C antes de adicionar a amostra.
      3. Homogeneizar a amostra por vórtice vigorosamente por 30-60 s. Para amostras gordurosas ou duras, continuar a homogeneização até obter uma suspensão uniforme.
      4. Prepare uma série de diluições de dez vezes tomando 1 mL de suspensão e transferindo-a para tubos sucessivos contendo 9 mL de solução estéril. Misture bem cada diluição.
         NOTA: Dependendo do tipo de amostra e do nível esperado de contaminação microbiana, prepare diluições que variam de ^10-1 a ^10-6. Para a maioria das amostras, diluições de até ^10-3 serão suficientes; No entanto, ao analisar o leite fresco ou o queijo azul, será necessário preparar diluições adicionais. Para garantir um isolamento preciso e facilidade de seleção de colônias, a diluição ideal da inoculação deve dar de 30 a 300 colônias por placa. Essa faixa permite a diferenciação clara de colônias individuais e minimiza o risco de crescimento sobreposto, facilitando a obtenção de culturas bacterianas não contaminadas e homogêneas para análise posterior. Para alguns produtos lácteos processados (por exemplo, leitelho), uma amostra fresca não diluída (por exemplo, 0,1 mL) pode ser usada para o plaqueamento direto.
      5. Retirar 0,1 ml da amostra ou da sua diluição e transferir para a superfície de placas de Petri previamente preparadas contendo o meio de ágar adequado.
      6. Espalhe uniformemente o inóculo sobre a superfície do ágar usando um espalhador estéril. Deixe o inóculo absorver no meio por 15 min e, em seguida, inverta as placas.
   3. Incubação
      1. Incubação aeróbia: para todas as amostras investigadas, inocular placas de ágar APT, M-17, CBL, MPCA e TSA, incubar em condições aeróbicas a 37 °C e 30 °C por 24 h. As temperaturas de incubação foram determinadas com base nos requisitos ideais de crescimento de diferentes grupos microbianos cruciais para avaliar a qualidade higiênica (30 ° C para mesófilos gerais) e a segurança da saúde pública (37 ° C para patógenos associados ao homem e organismos indicadores) de produtos lácteos.
         NOTA: Se for esperado um crescimento intensivo de bactérias formadoras de esporos, no caso da TSA, é preferível um tempo de incubação mais curto (~ 12 h).
      2. Incubação anaeróbia: para todas as amostras investigadas, inocular placas de ágar MRS, incubar em condições anaeróbias a 37 °C e 30 °C por 24-72 h, verificando o crescimento microbiano todos os dias. As temperaturas de incubação foram determinadas conforme mencionado na etapa 3.1.
         NOTA: As condições de incubação anaeróbica podem ser alcançadas colocando placas em recipientes herméticos com sachês geradores de atmosfera anaeróbica, que eliminam o oxigênio e fornecem uma atmosfera adequada para o crescimento de bactérias anaeróbicas.
   4. Obtenção de culturas puras
      1. Após a incubação, inspecione as placas e selecione colônias individuais cultivadas com base em suas características morfológicas (por exemplo, tamanho, forma, cor, textura).
      2. Purificar as colónias seleccionadas por subcultura (estrias) no mesmo meio de ágar utilizando uma alça microbiana de 1 μL e as mesmas condições de incubação.

Meio de cultura	Aplicação	Condição de cultura
Ágar Soja Tríptica (TSA)	meio geral para o cultivo de uma ampla gama de bactérias	30–37 °C, 24–48 h, aeróbico
Ágar sangue (BLA; com 5% de sangue de ovelha)	enriquecido, diferenciação de hemólise, útil para Streptococcus, Listeria, Bacillus	30–37 °C, 24–48 h, aeróbico
Ágar MRS (ágar de Man, Rogosa e Sharpe)	seletivo para Lactobacillus e outros LAB Adicionar 1% de Tween-80 para apoiar o crescimento de L. casei, L. delbrueckii, L. helveticus ou L. acidophilus.	30 °C, 48–72 h, anaeróbico ou microaerofílico
Ágar-ágar M17	seletivo para Lactococcus, Streptococcus thermophilus	30 °C, 48–72 h, anaeróbico ou microaerofílico
Ágar APT (ágar All-Purpose Tween 80)	seletivo para LAB e algumas Bifidobactérias	30 °C, 48–72 h, anaeróbico ou microaerofílico
Ágar-Scheadler	seletivo e enriquecedor, isolamento de anaeróbios, incluindo Bifidobacterium, Clostridium	30–37 °C, 48–72 h, anaeróbico
Ágar CBL (ágar Lactose azul da China)	meio diferencial, para bactérias coliformes e outras bactérias fermentadoras de lactose	37 °C, 24–48 h, aeróbico
Ágar Contagem de Placas de Leite (MPCA)	universal, para o número total de bactérias aeróbias mesófilas	30–37 °C, 24–48 h, aeróbico

Tabela 1: Lista de meios sugeridos para análise do microbioma de amostras de laticínios com condições de cultura especificadas.

2. Preparação de amostras bacterianas para análise de MS

1. Antes de começar, prepare a solução de matriz MALDI
   NOTA: O composto de matriz mais comumente usado é o HCCA, ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico. Este composto é fotossensível, portanto, prepare e armazene a matriz em recipientes escuros ou longe da luz.
   1. Prepare a mistura de solventes usando as seguintes proporções: 50% de acetonitrila (grau HPLC), 47,5% de água (grau HPLC) e 2,5% de ácido trifluoroacético (TFA).
   2. Dissolver a matriz na mistura de solventes até uma concentração final de aproximadamente 10 mg/ml (ou até à saturação - até que os cristais não dissolvidos permaneçam visíveis).
   3. Se a solução não estiver límpida (restam cristais), centrifugue ou filtre a solução (por exemplo, através de um filtro de seringa de 0,22 μm) para obter um líquido límpido.
      NOTA: O armazenamento no refrigerador é permitido por curtos períodos, desde que haja um número baixo de ciclos de degelo.
2. Para identificar bactérias usando EM, use um dos 3 procedimentos de preparação de amostra:
   1. Transferência direta de colônias - Use este método mais simples e rápido ao lidar com bactérias não resistentes à lise e de bom crescimento, como a maioria das bactérias Gram-negativas.
      1. Usando um laço estéril ou palito de dente, transfira uma pequena quantidade (~ 1 μL) da colônia crescida para um local na placa MALDI.
      2. Espalhe o material bacteriano diretamente em um ponto designado na placa-alvo MALDI para criar uma camada fina e uniforme.
      3. Depois de seco, cubra o local com 1 μL de solução de matriz HCCA e deixe secar ao ar em temperatura ambiente.
   2. Extração de ácido fórmico no alvo - Use para bactérias difíceis de identificar (por exemplo, Gram-positivas, leveduras) cujas paredes celulares dificultam a liberação de proteínas sem processamento adicional.
      1. Pegue uma pequena quantidade de biomassa bacteriana de uma única colônia bacteriana usando uma alça microbiana descartável ou um palito de dente estéril.
      2. Espalhe o material bacteriano diretamente em um ponto designado na placa-alvo MALDI para criar uma camada fina e uniforme.
      3. Cubra o material bacteriano manchado com 1 μL de solução de ácido fórmico a 70% e seque ao ar em temperatura ambiente.
      4. Depois de seco, cubra o local com 1 μL de solução de matriz HCCA e deixe secar ao ar em temperatura ambiente.
   3. Extração de proteína no tubo (método de etanol/ácido fórmico) - Use este método para microrganismos difíceis de identificar, incluindo algumas bactérias Gram-positivas, leveduras e micobactérias.
      1. Usando uma alça estéril ou cotonete, transfira 1-3 colônias completas de uma placa de cultura de ágar para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 300 μL de água estéril.
      2. Adicione 900 μL de etanol absoluto para ajustar a concentração final de etanol para aproximadamente 75%. Misture ou vortex por alguns segundos.
      3. Centrifugue a amostra por 2 min a 15.000 x g (temperatura ambiente).
      4. Descarte cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet celular.
         NOTA: No caso de estirpes mucosas, recomenda-se centrifugação adicional a 4 °C.
      5. Deixe o tubo da pelota aberto até que todo o etanol residual tenha evaporado (5-10 min, temperatura ambiente).
      6. Adicione 20-50 μL de ácido fórmico (FA) a 70% ao pellet de células secas. Misture por pipetagem ou vórtice até que o pellet esteja totalmente ressuspenso.
         NOTA: O volume deve ser proporcional à quantidade de material biológico.
      7. Adicione um volume igual de acetonitrilo (ACN) à suspensão de ácido fórmico. Misture com cuidado.
      8. Centrifugue a 15.000 x g por 2 min (temperatura ambiente).
      9. Transferir 1 μL do sobrenadante para um ponto designado numa placa-alvo MALDI.
      10. Deixe o local secar completamente à temperatura ambiente.
      11. Cubra o local da amostra seca com 1 μL de solução de matriz de ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico (HCCA).
      12. Deixe a matriz secar completamente à temperatura ambiente antes da análise de MS (Figura 1).
          NOTA: 70% Ácido Fórmico: Corrosivo; causa queimaduras. Manuseie em um exaustor. Acetonitrila: Inflamável e tóxico. Mantenha longe de chamas e evite inalação/contato. Ácido trifluoroacético (TFA): Forte, corrosivo e volátil; Evite contato com a pele / olhos e inalação. Sempre use jaleco, luvas resistentes a produtos químicos e óculos de segurança. Manuseie todos os reagentes em uma hotte para evitar a inalação. Evite o contato com a pele e os olhos; trabalhe longe de chamas abertas. Colete resíduos de solventes ácidos e orgânicos em recipientes compatíveis e claramente rotulados para descarte adequado.

Figura 1: Uma árvore de decisão que visualiza o processo de seleção de um procedimento apropriado de preparação de amostras para identificação de isolados bacterianos por meio da técnica MS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Aquisição de espectros e identificação microbiana usando a técnica MS

1. Calibração
   NOTA: Para uma determinação precisa da massa em MS, antes de analisar amostras desconhecidas, calibre o instrumento usando os padrões apropriados. A calibração adequada do instrumento é crucial para uma identificação confiável.
   1. Prepare pontos de calibração na placa-alvo MALDI contendo 1 μL de: (a) Padrão de Teste Bacteriano (BTS), contendo um extrato de Escherichia coli DH5 alfa, cobrindo uma faixa de massa de 3,6-17 kDa (para MBT Biotyper); (b) Calibrador de microbiologia contendo extrato de proteína E. coli ATCC 25922, ribonuclease e mioglobina, cobrindo uma faixa de massa de 3,6-17 kDa (para EXS2600 sistema). Deixe secar ao ar e cubra os pontos secos do calibrador com 1 μL de solução de matriz HCCA, semelhante ao preparo da amostra.
   2. Carregue a placa-alvo MALDI contendo as amostras preparadas e os pontos de calibração no instrumento. Execute a análise de pontos de calibração usando o modo de calibração (automático).
   3. Verifique a calibração para garantir que a precisão da massa esteja dentro dos limites aceitáveis em (100 ppm) na faixa de massa especificada (2-20 kDa).
2. Aquisição de espectros
   NOTA: Quando o instrumento é calibrado, os espectros de massa de cada ponto de amostra preparado são adquiridos.
   1. Parâmetros gerais de aquisição
      1. Opere o espectrômetro de massa no modo de íon positivo linear.
      2. Defina a faixa de detecção de massa de 2.000 a 20.000 m/z (2 a 20 kDa).
   2. Use as seguintes configurações específicas do instrumento
      1. Tensões da fonte de íons: fonte de íons 1 (IS1) a 20 kV, fonte de íons 2 (IS2) a 18 kV, tensão da lente a 9 kV. A tensão de aceleração pode ser de até 25 kV.
      2. Tensão do detector: Defina para aproximadamente 2,65 kV.
      3. Configurações de extração de íons pulsados: 100 ns, tempo de extração retardado fixado em 230 ns.
      4. Configurações de potência do laser: ajuste manualmente para obter a melhor qualidade de espectro (tendo em vista o número de sinais e intensidades de sinal), normalmente variando de 40% a 65% da potência mínima necessária.
      5. Número de disparos por espectro: adquira um número suficiente de disparos a laser de diferentes regiões de cada ponto para gerar um espectro de soma com boa relação sinal-ruído (S/N)→ (a) média de 200 disparos, tirados em 50 passos de 4 regiões diferentes de cada ponto ou (b) aquisição em 500 passos de disparo - 50 disparos de dez posições diferentes do ponto alvo usando o modo AutoXecute.
   3. Estratégia de medição de amostra
      1. Meça vários pontos por isolado (pelo menos 2 pontos por isolado).
      2. Adquirir espectros em réplica para cada ponto para garantir consistência e precisão dos achados → medir em duplicata, visando um certo número de espectros totais por amostra (4 espectros por amostra pelo menos → réplicas técnicas).
         NOTA: Submeta amostras biológicas (pelo menos 3) para obter réplicas biológicas.

4. Identificação de microrganismos e análise de dados

NOTA: A identificação do organismo ocorre comparando o perfil proteico obtido (proteína específica "impressão digital" do microrganismo) com um banco de dados de referência, e a correlação resultante da posição e intensidade do sinal é usada para gerar um valor correspondente, que descreve o nível de confiança com o qual o organismo estudado foi combinado com seu microrganismo de referência correspondente. Identifique microrganismos comparando espectros processados com bancos de dados de referência.

1. Processamento de espectros
   1. Use o software apropriado para processamento de espectros: (a) flexAnalysis para sistemas MALDI Biotyper ou (b) EX-Accuspec para sistemas EXS2600.
   2. Aplique um método de Savitzky-Golay como um algoritmo de suavização (largura 2 m/z, 10 ciclos).
   3. Execute a correção da linha de base para remover o ruído de fundo usando o algoritmo TopHat (limite S/N = 2, largura do filtro TopHat 0,2 Da).
   4. Use um modo centróide como um algoritmo de detecção de pico (limite S/R = 2).
2. Comparação de bases de dados e interpretação de pontuação
   1. Carregue os espectros de massa processados de isolados desconhecidos para a plataforma MALDI de identificação microbiana. Em seguida, execute a identificação.
      NOTA: Nestes estudos foram utilizados os seguintes softwares: Biotyper versão 4.1.100, Ex-Accuspec versão V1. No caso do software MALDI Biotyper, a criação de espectros principais (MSPs) a partir de espectros brutos é recomendada para garantir a melhor confiabilidade de correspondência.
   2. Avalie os resultados da identificação de acordo com os limites padrão do fabricante.
      NOTA: Para MALDI Biotyper e EXS2600, os valores de pontuação são:
      2.300-3.000: identificação de espécies altamente prováveis;
      2.000-2.299: identificação segura de gêneros, identificação de espécies prováveis;
      1.700-1.999: identificação do gênero provável;
      0,000-1,699: identificação não confiável.
      Durante a avaliação do resultado da identificação derivado da plataforma MALDI Biotyper, os resultados de suporte usando Categorias de Consistência: A- Espécie Consistente → melhor correspondência e todas as outras correspondências com um valor de pontuação igualmente alto (>1,999) apontam para a mesma espécie; B - Gênero Consistente → melhor correspondência e outras correspondências com valores de pontuação semelhantes (1,700 - 1,999) apontam para o mesmo gênero, mas podem diferir no nível da espécie; C- Sem consistência → requisitos para consistência em nível de espécie ou gênero não foram atendidos.

Resultados

Abordagem culturômica
A abordagem culturômica é uma estratégia que visa diversificar ao máximo as condições de cultivo de microrganismos, a fim de aumentar as chances de isolar, entre outras, espécies raras, difíceis de cultivar ou não descritas anteriormente¹². Isso torna possível obter uma imagem muito mais ampla da biodiversidade da microflora presente em várias amostras, por exemplo, amostras de alimentos. O aumento da diversidade de micror...

Discussão

O protocolo dedicado à identificação microbiana de produtos lácteos oferece um avanço importante em relação aos métodos tradicionais, garantindo um consenso ideal sobre velocidade, confiabilidade e custo-benefício. No entanto, algumas etapas cruciais dentro do protocolo exigem atenção cuidadosa. Em primeiro lugar, a fase de isolamento e cultura é fundamental. Os meios de cultura e as condições de incubação devem corresponder à diversidade e carga microbiana esperadas. A obtenção de cultu...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
70% ácido fórmico	Chempur	115676307
Acetonitrilo	Merck KGaA	1.00014.1011
Ágar APT	Merck KGaA	1.10453.0500
Padrão de Teste Bacteriano	Bruker Daltonik GmbH	8255343
Ágar CBL (Ágar Azul Lactose da China)	Merck KGaA	1.02348.0500
Ágaro de sangue da Colômbia	Oxoide	CM0331B
Ágar M17
Ágar de Contagem em Placas de Leite (MPCA)	Oxoide	CM0681
MRS agar (de Man, Rogosa e Sharpe Agar)	Merck KGaA	1.10660.0500
MSP 96 alvo de aço polido BC	Bruker Daltonik GmbH	8280800
Água peptona	Sigma-Aldrich	70179
Ágar Scheadler	Sigma-Aldrich	91019
Sangue de ovelha	Biomáximos	SL0160-100
Ácido trifluoroacético	Sigma-Aldrich	T6508
Ágar de Soja Tripta (TSA)	Sigma-Aldrich	22091
Água	Merck KGaA	1.15333.2500
&alfa;-Ciano-4-hidroxicinâmico	Bruker Daltonik GmbH	8201344