Este protocolo permite uma avaliação rápida e econômica da composição microbiana em produtos lácteos, combinando culturomics com MALDI-TOF MS. Ele fornece resultados de taxonomia comparáveis ao sequenciamento de rRNA 16S com um tempo de resposta mais curto do que os métodos tradicionais de cultura.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Avaliação da segurança microbiana de laticínios usando perfil proteômico bacteriano via abordagem MALDI
Neste artigo
Resumo
Resumo
Apresentamos um protocolo usando o método de identificação de espectrometria de massa por tempo de voo de dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI-TOF MS, doravante denominado "MS") para monitorar a presença de microrganismos em diferentes produtos lácteos (manteiga, queijo mussarela, leite, creme) usando uma abordagem proteômica, culturômica moderna e vários procedimentos de preparação de amostras que podem ser incorporados aos laboratórios de controle de qualidade de segurança alimentar como um rápido, Ferramenta confiável e robusta para monitorar a segurança microbiana. Inclui uma etapa de isolamento microbiano, coleta de colônias cultivadas, procedimentos de preparação de amostras (células intactas, extração no local e no tubo), definição de parâmetros de análise de MS, geração e coleta de espectros de MS (impressões digitais de proteínas) e, finalmente, obtenção de taxonomia usando a plataforma MS, seguida de interpretação e visualização de dados. Este método, validado por vários estudos, oferece uma identificação mais confiável e econômica de microrganismos do leite em comparação com sistemas de teste bioquímicos comerciais. Destaca-se como um avanço promissor em microbiologia de alimentos, atendendo aos diversos requisitos dos laboratórios por meio de seus protocolos simples e tempo de análise significativamente reduzido. O protocolo apresentado atende às necessidades da indústria alimentícia, fornecendo identificação microbiana confiável em um tempo de resposta adequado (TAT) que seja adequado aos processos de fabricação.
Introdução
O objetivo geral deste protocolo é fornecer uma metodologia abrangente para monitorar a segurança microbiana de vários produtos lácteos, incluindo manteiga, queijo, leite e creme, empregando MS para perfil proteômico bacteriano. Essa abordagem, que combina culturômica moderna com procedimentos otimizados de preparação de amostras, pretende ser uma ferramenta rápida, confiável e robusta para laboratórios de controle de qualidade e segurança alimentar. A lógica por trás da criação e aplicação dessa metodologia vem das limitações dos métodos padrão de identificação microbiana. Por muitos anos, os laboratórios veterinários e de diagnóstic....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Os reagentes e os equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Isolamento de bactérias relacionadas a laticínios
- Obtenção de culturas bacterianas de produtos lácteos líquidos ou sólidos
- Seleção de meios de cultura
- Para isolamento bacteriano de amostras de laticínios, selecione os meios de cultura de acordo com os grupos microbianos esperados, incluindo meios de crescimento geral, meios para bactérias Gram-negativas, bactérias do ácido lático (BAL), bactérias formadoras de esporos, bem como microrganismos de ....
- Seleção de meios de cultura
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Abordagem culturômica
A abordagem culturômica é uma estratégia que visa diversificar ao máximo as condições de cultivo de microrganismos, a fim de aumentar as chances de isolar, entre outras, espécies raras, difíceis de cultivar ou não descritas anteriormente12. Isso torna possível obter uma imagem muito mais ampla da biodiversidade da microflora presente em várias amostras, por exemplo, amostras de alimentos. O aumento da diversidade de micror.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O protocolo dedicado à identificação microbiana de produtos lácteos oferece um avanço importante em relação aos métodos tradicionais, garantindo um consenso ideal sobre velocidade, confiabilidade e custo-benefício. No entanto, algumas etapas cruciais dentro do protocolo exigem atenção cuidadosa. Em primeiro lugar, a fase de isolamento e cultura é fundamental. Os meios de cultura e as condições de incubação devem corresponder à diversidade e carga microbiana esperadas. A obtenção de cultu.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Todos os autores declaram não haver conflito de interesses.
Agradecimentos
E.S., M.Z. e P.P. são membros do Centro de Excelência de Toruń "Rumo à Medicina Personalizada", operando sob a Iniciativa de Excelência-Universidade de Pesquisa. Esta pesquisa foi apoiada financeiramente no âmbito do projeto LIDER intitulado "Desenvolvimento de um método preparativo para o isolamento de lactoferrina biologicamente ativa", DPWP/LIDER-XIII/6/2023, financiado pelo Centro Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (Varsóvia, Polônia).
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 70% ácido fórmico | Chempur | 115676307 | |
| Acetonitrilo | Merck KGaA | 1.00014.1011 | |
| Ágar APT | Merck KGaA | 1.10453.0500 | |
| Padrão de Teste Bacteriano | Bruker Daltonik GmbH | 8255343 | |
| Ágar CBL (Ágar Azul Lactose da China) | Merck KGaA | 1.02348.0500 | |
| Ágaro de sangue da Colômbia | Oxoide | CM0331B | |
| Ágar M17 | |||
| Ágar de Contagem em Placas de Leite (MPCA) | Oxoide | CM0681 | |
| MRS agar (de Man, Rogosa e Sharpe Agar) | Merck KGaA | 1.10660.0500 | |
| MSP 96 alvo de aço polido BC | Bruker Daltonik GmbH | 8280800 | |
| Água peptona | Sigma-Aldrich | 70179 | |
| Ágar Scheadler | Sigma-Aldrich | 91019 | |
| Sangue de ovelha | Biomáximos | SL0160-100 | |
| Ácido trifluoroacético | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Ágar de Soja Tripta (TSA) | Sigma-Aldrich | 22091 | |
| Água | Merck KGaA | 1.15333.2500 | |
| &alfa;-Ciano-4-hidroxicinâmico | Bruker Daltonik GmbH | 8201344 |
Referências
- Savage, E., et al. Evaluation of three bacterial identification systems for species identification of bacteria isolated from bovine mastitis and bulk tank milk samples. Foodborne PathogDis. 14 (3), 177-187 (2017).
- Holt, J. G., et al.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
