Artigo de método

Preparação de amostras para estudos metabolômicos de espectrometria de massa de célula única: lavagem, têmpera, secagem e armazenamento de células combinadas

DOI:

10.3791/68995

⸱

16 de setembro de 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Oklahoma, 2Department of Biochemistry and Physiology, University of Oklahoma Health Sciences Center

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo visa preservar metabólitos celulares para espectrometria de massa de célula única (SCMS), combinando lavagem de solução salina volátil, têmpera rápida de nitrogênio líquido, liofilização e armazenamento de -8 °C. Isso demonstra que a extinção do nitrogênio líquido é essencial para manter os perfis de metabólitos, enquanto o armazenamento refrigerado prolongado deve ser minimizado para evitar alterações metabólicas.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A espectrometria de massa de célula única (SCMS) tornou-se uma ferramenta indispensável para estudar o metabolismo celular. Devido aos avanços nas técnicas modernas de espectrometria de massa (MS) e à demanda em estudos de heterogeneidade celular em ciências biológicas fundamentais e doenças humanas, uma variedade de diferentes técnicas de SCMS foram desenvolvidas e aplicadas em pesquisas de laboratório. Como os metabólitos podem refletir com precisão o status celular, a análise metabolômica SCMS de células vivas é considerada uma ferramenta poderosa para fornecer informações moleculares sobre as células. No entanto, um grande desafio na análise de SCMS de células vivas é preservar os perfis de metabólitos endógenos durante a preparação, transporte e medição da amostra. Os metabólitos celulares sofrem rápida renovação e são altamente sensíveis às mudanças ambientais, tornando-os suscetíveis à degradação ou transformação antes da análise. Para resolver essa limitação, apresentamos um protocolo de preparação celular robusto e reprodutível projetado para preservar a integridade do metabólito celular para SCMS. O protocolo integra lavagem celular com uma solução volátil de formiato de amônio (AF), têmpera rápida com nitrogênio líquido (LN2), liofilização a vácuo e armazenamento a -80 °C. Essa abordagem minimiza os danos à membrana celular enquanto interrompe efetivamente a atividade metabólica. Os resultados indicam que a extinção rápida das células é vital; no entanto, é necessário limitar o tempo de armazenamento a -80 °C para preservar os metabolitos celulares. O protocolo proposto pode ser usado para outras técnicas SCMS existentes para aplicações amplas.

Introdução

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A heterogeneidade célula a célula emergiu como um princípio fundamental dos sistemas biológicos, especialmente nos contextos de progressão da doença, resistência a drogas e diferenciação celular 1,2. Em organismos multicelulares, mesmo células geneticamente idênticas no mesmo microambiente podem exibir fenótipos distintos, decorrentes de diferenças nos níveis transcriptômico3, proteômico4 e, crucialmente, metabolômico5. Embora a genômica e a transcriptômica de célula única tenham ganhado força substancial na última década, a metabolômica de célula única permanece comparativamente subdesenvolvida devido à complexidade inerente e à dinâmica rápida dos metabólitos6. Os metabólitos são altamente sensíveis a estímulos ambientais, têm diversas estruturas químicas e polaridades7 e existem em baixas concentrações em pequenos volumesde células 8. Essas propriedades tornam sua medição confiável de células individuais um desafio analítico. Como a metabolômica oferece o instantâneo mais próximo do estado funcional em tempo real de uma célula, o avanço de métodos para estudar robustamente o metaboloma na resolução de uma única célula é essencial para uma compreensão mais profunda da fisiologia e patologia celular7.

As técnicas tradicionais de metabolômica em massa calculam a média dos sinais em grandes populações de células, mascarando a heterogeneidade celular e potencialmente obscurecendo assinaturas metabólicas raras, mas significativas. Em contraste, a metabolômica de célula única revela perfis bioquímicos únicos no nível da célula individual, tornando-a inestimável para estudar processos como diferenciação de células-tronco, respostas a medicamentos e mecanismos de doenças 6,9,10,11,12,13. Métodos baseados em espectrometria de massa (MS), como MS de ionização por dessorção a laser assistida por matriz (MALDI) e MS de íons secundários (SI), avançaram no campo, mas enfrentam desafios como preparação complexa, requisitos de vácuo e ionização destrutiva que limitam a análise de células vivas 9,14. Particularmente, desenvolvimentos recentes em instrumentação resultaram em técnicas de ponta, incluindo MALDI em modo de transmissão acoplado a postionização induzida por laser (t-MALDI-215) e espectrometria de massa de íons secundários Orbitrap (OrbiSIMS) 16 , 17 , permitiram imagens metabólicas 3D de alta resolução e sem rótulos no nível de célula única e subcelular, oferecendo excepcional precisão de massa e resolução espacial.

O MS de ionização ambiente aborda esses problemas. As técnicas representativas de SCMS em ambiente incluem espectrometria de massa de vídeo de célula única ao vivo (Video-MS) 18, DESI19 e nano-DESI20. Dentre elas, o SCMS de sonda única é uma das técnicas que se destaca por sua capacidade de amostrar e ionizar diretamente células vivas em tempo real usando um sistema de duplo capilar 21,22,23,24. Esta técnica minimiza a perturbação da amostra, ao mesmo tempo em que permite perfis metabólicos in situ de alta resolução e tem sido aplicada com sucesso a estudos de absorção de drogas e influência no metabolismo celular 22,25,26,27,28,29,30, respostas ambientais31,32 e heterogeneidade metabólica33, 34,35,36 entre células individuais.

Embora muitos métodos de SCMS ambiente permitam a análise de células vivas, eles normalmente sofrem de baixo rendimento devido ao manuseio manual necessário para a seleção de células individuais 23,37,38. Como o metabolismo celular é altamente dinâmico, a preparação prolongada da amostra pode alterar os perfis de metabólitos. Para resolver isso, os pesquisadores aplicam técnicas de extinção imediatamente após o isolamento das células39,40. A têmpera interrompe a atividade metabólica por resfriamento rápido 41,42,43,44 ou desnaturação enzimática 43,45,46,47, preservando o estado bioquímico das células em um momento específico. Esta etapa é vital para garantir dados metabolômicos precisos e temporalmente relevantes. Um protocolo de têmpera eficaz deve interromper rápida e completamente a atividade metabólica intracelular. Vários métodos foram avaliados, incluindo solução salina isotônicafria 48, acetonitrila resfriada46, metanol frio 44,47,48,49, solução tampão fosfato gelada (PBS)43,50, LN2 43,44,51 e até mesmo tratamentos com ar quente52. Embora muitos deles tenham sido originalmente desenvolvidos para metabolômica de células em massa, alguns, como metanol frio e acetonitrila, foram adaptados para técnicas de célula única, como Pico-ESI-MS39 e MALDI-MS46. Apesar de sua eficácia, cada método tem desvantagens: solventes orgânicos podem causar vazamento de metabólitos e danos às membranas celulares48,53, e soluções salinas não voláteis podem interferir na SM, causando supressão de íons54, reduzindo a sensibilidade e comprometendo a precisão dos dados47,55.

O congelamento instantâneo LN2 é comumente usado em pesquisas biológicas56 porque interrompe rapidamente o metabolismo celular sem deixar para trás sais não voláteis, tornando-o uma boa opção para SCMS. No entanto, pode danificar as membranas celulares, o que é problemático para SCMS57,58. Para reduzir esse dano, alguns estudos usaram um método que envolve filtração rápida, lavagem a frio de NaCl e congelamento de LN2, que ajuda a reter metabólitos de rápida rotatividade53,59. Ainda assim, este método não é ideal para SCMS devido a dificuldades em isolar células individuais e potenciais efeitos de matriz de resíduos de sal. O armazenamento a -80 °C é outro método de preservação comum, mas seus efeitos nos perfis de metabólitos de uma única célula permanecem obscuros. Relatamos anteriormente estudos para abordar essas limitações combinando várias etapas principais: as células são primeiro lavadas com uma solução AF volátil compatível com MS, depois temperadas com LN2, liofilizadas a vácuo e armazenadas em baixa temperatura (-80 ° C) 60 . A abordagem atual minimiza os danos celulares e a degradação dos metabólitos, permitindo medições SCMS mais precisas. Este trabalho é focado em detalhes experimentais, visando promover a adoção deste método de preparação celular para técnicas robustas de SCMS.

Protocolo

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Realize todas as etapas dentro de um laboratório de biossegurança certificado Classe II e condições estéreis. Neste estudo, a linhagem celular HCT-116 foi utilizada como sistema modelo, e as células foram cultivadas em meio de cultura completo. Os regentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Cultura de células

  1. Prepare o meio completo. Suplemento 5A de McCoy Aquecê-lo a 37 °C.
  2. Incubar as células a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2. Monitore a confluência diariamente e a passagem quando as culturas atingirem ~ 80% de confluência.
  3. Passe as células (a cada ~ 2 dias).
    1. Aspire o meio e enxágue uma vez com 5 ml de 1x PBS.
    2. Adicione 2 mL de tripsina-EDTA a 0,25% à placa de cultura e incube a 37 ° C por 3 min para facilitar o descolamento celular.
    3. Neutralize a tripsina adicionando 8 mL de meio completo pré-aquecido e pipetando suavemente para dispersar as células.
    4. Transfira 1 mL da suspensão para 9 mL de meio completo fresco.
    5. Conte as células.
      NOTA: As células foram contadas usando um contador de células automatizado TC20 de acordo com as instruções do fabricante. Azul de tripano ou outros agentes de coloração não foram usados.
  4. Células-semente nas lamínulas.
    1. Dilua as células até uma concentração final de ~ 1 × 106 células / mL.
    2. Coloque as lamínulas de vidro individuais de 18 mm em poços de uma placa de 12 poços.
      NOTA: As lamínulas de vidro precisam ser autoclavadas antes de serem usadas para cultura de células.
    3. Adicione 2 mL do meio completo e 200 μL da suspensão celular (~ 2 × 105 células / poço).
    4. Incube as células durante a noite para permitir a fixação celular.
      NOTA: Para garantir que as células estejam em estado normal de crescimento, verifique rotineiramente a morfologia das células e seu status de crescimento (usando um microscópio), bem como examine a contaminação potencial por micoplasma (usando um kit de detecção de micoplasma).

2. Lavagem celular com solução de formiato de amónio (AF)

NOTA: Prepare uma nova solução AF a cada vez.

  1. Prepare o tampão de lavagem AF. Pesar 0,45 g de formiato de amônio e dissolver em 50 mL de água de grau LC/MS. A concentração final de formiato de amônio é de 0,14 M (0,9% p/p).
    NOTA: Mantenha a solução gelada (0-4 °C) até o uso.
  2. Adicione 2 mL de solução AF fria a cada poço da placa de 12 poços.
  3. Enxágue as lamínulas. Usando um par de pinças estéreis para levantar suavemente cada lamínula contendo células aderentes de seu poço e, em seguida, coloque-a brevemente (por 2-3 s) em um poço separado pré-preenchido com 2 mL de solução fria de formiato de amônio (AF) a 0,9%. Repita o processo de enxágue.
    NOTA: Para evitar perturbar as células durante a etapa de lavagem, execute o enxágue das células com muito cuidado.

3. Têmpera celular por nitrogênio líquido (LN2)

  1. Coloque cada lamínula enxaguada com AF (células voltadas para cima) na placa de Petri dentro do recipiente de papel alumínio.
    NOTA: Use luvas com classificação criogênica, óculos de segurança e jaleco. Execute todo o manuseio do LN2 em uma área bem ventilada. A folha de alumínio pode ser usada para dobrar um recipiente para têmpera em LN2 .
  2. Despeje lentamente 10-20 mL de nitrogênio líquido sobre as lamínulas, garantindo uma cobertura completa.
  3. Incline imediatamente a placa de Petri com uma pinça para decantar qualquer nitrogênio líquido restante.
    NOTA: Conclua esta ação em alguns segundos para evitar a formação de grandes cristais de gelo devido à umidade residual da lavagem.

4. Liofilização celular no vácuo

  1. Liofilizar imediatamente após a têmpera do LN2 para evitar o descongelamento.
    NOTA: Remova o rotor do SpeedVac para criar uma plataforma plana que acomode uma placa de Petri de 100 mm.
  2. Usando luvas criogênicas e pinças isoladas, coloque a placa de Petri contendo as lamínulas resfriadas LN2 na câmara do concentrador de vácuo.
  3. Processe usando suas configurações de vácuo padrão e continue por 5-7 min até que o LN2 visível tenha evaporado e as lamínulas pareçam secas. As lamínulas secas não devem conter nenhum LNresidual e cristais de gelo.

5. Armazenamento de células em um freezer de -80 °C

  1. Embrulhe o recipiente com uma toalha de papel e transfira-o para um freezer a -80 ° C por 48 h.
  2. Após o armazenamento, transfira imediatamente as lamínulas contendo a placa de Petri para um dessecador em temperatura ambiente por ~ 10 min. Certifique-se de que o gelo condensado ou a água nas lamínulas desapareçam completamente antes de retirá-las do dessecador.
    NOTA: A transferência rápida das lamínulas para o dessecador minimiza a condensação; Mesmo um umedecimento superficial menor pode dissolver metabólitos secos.
  3. Após a lavagem da FA, dividir as amostras em dois grupos (Grupo 1 e Grupo 2). Aplique os seguintes protocolos de processamento.
    Grupo 1: Têmpera LN2 → liofilização → análise SCMS (sem armazenamento).
    Grupo 2: Têmpera de LN2 → liofilização → armazenamento de -80 °C 48 h → análise SCMS.
  4. Prossiga com a análise do SCMS conforme descrito abaixo.
    NOTA: Mais grupos de células podem ser preparados usando diferentes condições. O Grupo 1 e o Grupo 2 são usados para ilustrar os protocolos gerais.

6. Fabricação de sonda única e configuração SCMS

NOTA: A sonda única é fabricada de acordo com os procedimentos estabelecidos 21,24,60,61, e apenas breves protocolos são fornecidos aqui.

  1. Puxe a agulha de quartzo de furo duplo usando um extrator a laser e gere uma ponta de ~ 10 μm. Monte uma sonda única inserindo o capilar de sílica fundida e o emissor de nano-ESI na agulha de quartzo de furo duplo. Prenda todos os componentes a uma lâmina de vidro com epóxi de secagem rápida.
  2. Monte a sonda única no estágio XYZ. Fixe a sonda única em um manipulador XYZ motorizado posicionado sob um microscópio digital.
  3. Acople a configuração a um espectrômetro de massa para análise SCMS.
  4. Utilizar acetonitrilo (≥99,9%) contendo 0,1% de ácido fórmico como solvente de extracção a um débito de 150 nL/min fornecido por uma bomba de seringa.
  5. Defina os parâmetros MS.
    Modo de íon positivo: m / z 200-1500, +2,9 kV, resolução de massa 120 k (em m / z 200).
    Modo de íon negativo: m / z 70-900, -2,1 kV, resolução de massa 120 k (a m / z 200).
    NOTA: Como os íons negativos geralmente são detectados na faixa m/z inferior à dos íons positivos, diferentes faixas m/z podem ser usadas para esses dois modos de íons. As configurações adicionais de MS incluem tempo máximo de injeção de 100 ms, um microscan, controle automático de ganho padrão (AGC), modo de varredura completa (para análise MS), dissociação colisional de alta energia (HCD) (para análise MS/MS) com 10-35 Energia de Colisão Normalizada (NCE) e 320 °C para a temperatura do tubo de transferência de íons. Um cromatograma de íons totais (TIC) foi gerado em cada varredura/ponto de tempo para monitorar a estabilidade do sinal e a detecção de célula única.

7. Experimentos SCMS de sonda única

  1. Coloque as duas lamínulas (Grupo 1 e Grupo 2) juntas no XYZ motorizado stage da configuração SCMS de sonda única 21,24,61.
  2. Para minimizar os efeitos do lote, selecione as células aleatoriamente ao microscópio.
  3. Adquira espectros de massa de modo iônico positivo e negativo. Analise várias células (por exemplo, ~30) por grupo com a mesma sonda única, taxa de fluxo de solvente e tensão de ionização.
    NOTA: Use as mesmas tensões de sonda única, taxa de fluxo de solvente e ionização para cada experimento para garantir a comparabilidade dos dados. Calibre o Orbitrap diariamente antes da aquisição. As análises de MS e MS/MS podem ser realizadas no nível de célula única. Colete dados de MS para obter valores m/z precisos para estudos de perfis de metabólitos e marcadores provisórios em análises não direcionadas. Realize análises MS/MS de íons selecionados para identificação molecular em análise direcionada. Os dados foram adquiridos usando um software de aquisição e interpretação de dados compatível.

8. Análise dos dados

  1. Pré-processe os dados brutos do SCMS usando um script R personalizado. As etapas de pré-processamento incluem remoção de fundo e ruído e normalização da intensidade de íons para TIC 11,12,23.
  2. Desisótopo dos dados SCMS usando o pacote Python ms_deisotope.
  3. Execute o alinhamento de pico usando um script Python60 interno. Use uma largura de compartimento de 0,01 m/z para compartimentalização. Use uma tolerância de massa de 0,01 m/z ou 5 ppm para alinhamento de pico.
  4. Realize a análise estatística de dados usando o MetaboAnalyst 6.062. Realize um teste t e gere um mapa de calor (para níveis relativos de metabólitos). Selecione Usar os 100 principais no teste T/ANOVA para gerar os 100 principais metabólitos, classificados por valores-p de baixo a alto, com uma diferença significativa (p < 0,05) da comparação. Trace um mapa de calor usando esses 100 principais metabólitos.
  5. Pesquise valores m/z precisos e espectros MS/MS no Banco de Dados de Metaboloma Humano (HMDB63). Use uma tolerância de massa de 10 ppm na pesquisa de banco de dados MS.
    NOTA: Outros bancos de dados, como o LipidMaps64, podem ser usados para pesquisa em banco de dados.

Resultados

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Este relatório descreve uma metodologia que integra lavagem celular, têmpera celular rápida, secagem a vácuo e armazenamento a -80 °C (Figura 1). Especificamente, essa abordagem é projetada para preservar o estado metabolômico das células antes da análise de SCMS. A eficácia deste protocolo foi testada preparando células sob duas condições diferentes: células recém-temperadas e secas (Grupo 1, servindo como controle) e células temperadas, secas e armazenadas a -80 ° C (Grupo 2). Cada grupo foi analisado usando o método SCMS de sonda única nos modos de íons positivos e negativos. A Análise de Componentes Principais (PCA) e a visualização do mapa de calor foram usadas para avaliar as diferenças nos perfis metabolômicos entre os grupos.

Os resultados da PCA no modo de íons positivos (Figura 2A) revelaram que os Grupos 1 e 2 tinham perfis de metabólitos gerais semelhantes. Os perfis quase idênticos do Grupo 1 e do Grupo 2 demonstram que o armazenamento de -80 ° C por 48 h não altera significativamente o metaboloma se as células forem devidamente extintas antes da secagem. No modo de íons negativos (Figura 2B), um padrão comparável é observado, embora o Grupo 2 pareça um pouco mais distinto - potencialmente devido a diferenças de ionização entre classes específicas de metabólitos, por exemplo, as fosfatidilcolinas são melhor detectadas no modo positivo, enquanto os ácidos graxos ionizam mais eficientemente no modo negativo60. Apesar dessa variação, o agrupamento consistente entre os Grupos 1 e 2 em ambos os modos apóia a conclusão de que o protocolo integrado de têmpera-secagem-armazenamento mantém a integridade metabólica.

A análise do mapa de calor validou ainda mais os achados do PCA, descrevendo abundâncias relativas dos 100 principais metabólitos em dois grupos. Conforme mostrado na Figura 3, os 100 principais metabólitos exibem padrões de abundância altamente consistentes entre o Grupo 1 e o Grupo 2 em ambos os modos iônicos. Não são observadas grandes mudanças ou agrupamento específico do grupo, embora pequenas variações em alguns grupos de metabólitos possam refletir diferenças na eficiência da ionização ou na estabilidade do metabólito. Esses resultados demonstram coletivamente que o fluxo de trabalho de têmpera-secagem-armazenamento preserva os perfis metabolômicos celulares com alta fidelidade, tornando-o adequado para aplicações SCMS ambientais.

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Figura 1: Fluxo de trabalho geral para análise de espectrometria de massa de célula única (SCMS) investigando como a têmpera de LN2 e o armazenamento de 48 h a -80 ° C afetam os perfis de metabólitos em células individuais. (A) As células foram semeadas, incubadas e enxaguadas usando solução de formato de amônio (AF). (B) Dois grupos de células foram preparados - Grupo 1: as células foram lavadas, temperadas e liofilizadas para experimentos imediatos de SCMS sem armazenamento; Grupo 2: as células foram lavadas, temperadas, liofilizadas e armazenadas a -80 °C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Análise de Componentes Principais (PCA) de dados SCMS de células HCT-116 em grupos experimentais em (A) modo de íon positivo e (B) modo de íon negativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Mapas de calor mostrando os níveis relativos dos 100 principais metabólitos detectados em células HCT-116 únicas preparadas sob várias condições, apresentadas para (A) modo de íon positivo e (B) modo de íon negativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

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Uma etapa crítica neste protocolo é a extinção imediata de células vivas usando LN2 após a lavagem com AF, o que reduz substancialmente a atividade enzimática e interrompe os processos metabólicos em andamento. Além disso, lavar as células com AF antes de extinguir aumentou a intensidade de íons e reduziu os efeitos da matriz, apoiando sua inclusão como uma etapa preparatória para melhorar a sensibilidade do SCMS. Nos estudos atuais, células em diferentes grupos (ou seja, Grupo 1 e Grupo 2) foram cultivadas usando o mesmo lote inicial para minimizar sua variação biológica. O tempo de armazenamento de 48 horas foi escolhido porque as células com tempo de crescimento adicional (Grupo 1) ainda podem manter densidades celulares adequadas (por exemplo, para evitar agregados celulares) para análise comparativa de SCMS com células armazenadas (Grupo 2). No entanto, é necessário cautela ao confiar no armazenamento refrigerado, mesmo por 48 h, pois alterações metabólicas significativas ainda foram observadas nas comparações entre amostras recém-secas e armazenadas (Grupo 1 vs. Grupo 2). Embora em estudos reais, as amostras de células e tecidos sejam comumente armazenadas por períodos mais longos (por exemplo, por semanas e meses) em um freezer de -80 ° C, sugere-se reduzir o tempo de armazenamento para minimizar as alterações nos metabólitos.

A solução de problemas deve, portanto, se concentrar em minimizar o tempo entre a secagem e a análise SCMS, garantindo que as condições de descongelamento evitem condensação ou reidratação parcial. O teor de água residual e a condensação de água durante as transições de amostra podem reidratar parcialmente as células e permitir reações enzimáticas e químicas, como hidrólise, oxidação e proteólise, que degradam os metabólitos65, levando a mudanças artificiais na composição dos metabólitos. Amostras completamente secas interrompem efetivamente esses processos e preservam a integridade molecular66. Garantir um ambiente de dessecação livre de umidade e uma transição rápida para SCMS é fundamental para evitar essas armadilhas.

Apesar do sucesso deste método na preservação de perfis de metabólitos, as limitações permanecem. O método requer acesso a um sistema de secagem a vácuo e um freezer de -80 °C, e não é totalmente eficaz para armazenamento de longo prazo. Além disso, embora a secagem rápida à temperatura ambiente preserve temporariamente os metabólitos, ela não substitui a têmpera do LN2 . Alterações relacionadas ao armazenamento ainda podem ocorrer devido à remoção incompleta de água e ao risco de reidratação durante o manuseio da amostra. Essas limitações destacam a necessidade de refinamento do método se for desejado um armazenamento mais longo ou um rendimento mais alto.

Os protocolos relatados neste trabalho oferecem uma abordagem simplificada e eficaz para preservar o metaboloma de célula única para SCMS ambiente. Ao contrário dos métodos que exigem crioprotetores elaborados ou congelamento in situ, nosso fluxo de trabalho é prontamente compatível com as técnicas de ionização ambiente existentes e permite cronogramas flexíveis de amostragem e análise. A integração de lavagem celular, têmpera, secagem e armazenamento de curto prazo sem perda substancial de fidelidade metabolômica oferece uma solução prática para laboratórios que não têm acesso sob demanda a espectrômetros de massa. Essa abordagem tem um forte potencial para o avanço da pesquisa em biologia de sistemas unicelulares, metabolismo do câncer, heterogeneidade de resposta a medicamentos e fenotipagem metabólica de populações de células raras. A ampla aplicabilidade desses protocolos, particularmente para plataformas SCMS baseadas em ionização ambiente, os torna uma contribuição importante para o campo das técnicas analíticas de célula única. Em estudos futuros, esses protocolos podem ser adaptados e refinados para acomodar uma variedade maior de tipos de células. Com etapas adicionais de preparação de amostras (por exemplo, aplicação de matriz), as células processadas podem ser potencialmente analisadas por outras técnicas de SCMS (por exemplo, MALDI e SIMS), oferecendo maior resolução espacial e rendimento para análise de um número maior de células (por exemplo, células altamente confluentes). Os resultados também sugerem que esses protocolos de têmpera-secagem-armazenamento podem ser potencialmente usados para preparar células para transporte (por exemplo, em contêineres de gelo seco), permitindo estudos colaborativos de SCMS em diferentes locais.

Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

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Este estudo foi apoiado pela National Science Foundation (2305182), National Institutes of Health (1R01AI177469) e Chan Zuckerberg Initiative. A Figura 1 foi criada no BioRender (https://BioRender.com/yqn5isk).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
-80 ° C freezerEppendorf New BrunswickU700Preparação da amostra
AcetontrilaThermoFisher Scientific240744Configuração do experimento SCMS
Formato de amônio ThermoFisher Scientific401152500Preparação da amostra
Lamínula 18 mmMicro vidro de cobertura VMR48380046Cultura de células
Estereomicroscópio digitalShenzhen D& F Co.Superolhos T004Análise
Tubo de quartzo de furo duplo, 1,120 "x0,005" x12 "Friedrich & Dimmock, Inc.MBT-005-020-2QFabricação de sonda única
Resina epóxiDevconNº da peça 20945Fabricação de sonda única
Ácido fórmicoCiência de Ward 470301-120 500mLConfiguração do experimento SCMS
Capilar de sílica fundida, ID: 40 µ m, OD: 100 µ mTecnologias PolymicroTSP040105Fabricação de sonda única
Capilar de sílica fundida, ID: 50 µ m, OD: 150 µ mTecnologias Polymicro1068150015Configuração do experimento SCMS
Lamínulas de vidro, 18mmVWR 48380046Cultura de células
Soro sintético HyClone (FBS)HycloneSH3006603Cultura de células
Incubadora HeraCell (Heraeus)Cultura de células
Extrator a laserSutter Instrument Co.Modelo P-2000Fabricação de sonda única
Lâmpada UV LEDFoshan Liang Ya Equipamento OdontológicoLY-C240Fabricação de sonda única
5A de McCoy Gibco 2537128Cultura de células
MicrouniãoIDEX Saúde & Ciência LLCM-539Configuração do experimento SCMS
Interface FAIMS pro modificada Thermo Fisher 98100-20046Análise
Kit de detecção de micoplasma MycoAlert PLUSLonzaLT07-703Cultura de células
Placa óptica Thorlabs Inc., NewtonAnálise
Água de grau Optima LC/MS (Fisher Chemical, EUA)ThermoFisher ScientificW6500Preparação da amostra
Espectrômetro de massa Orbitrap Exploris 240 ThermoFisher ScientificConfiguração do experimento SCMS
Penicilina/estreptomicinaGibco15140-122Cultura de células
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)VWR0780-50LCultura de células
Concentrador SpeedVac (Savant)ThermoFisher Scientific SPD111 VPreparação da amostra
Bomba de seringa (SKE10)Chemyx Inc.80561Configuração do experimento SCMS
Seringa, 250 µ LHamilton1725LTN250ULConfiguração do experimento SCMS
Contador de células automatizado TC20Laboratórios Bio-Rad 1450102EDUContagem de células
Placa de cultura de tecidos, 100 mmFisher científico FB012924Cultura de células
Tripsina-EDTAThermoFisher Scientific25200-072Cultura de células
Microscópio digital USB ("Scorpio" 500 Zoom)Chinavasion, Atacado Ltd.Análise
Resina de cura UVOdontológico PrimeItem nº 006.030Fabricação de sonda única
Software XcaliburThermoFisher Scientific
Estágio XYZ (CONEX- MFACC)Corporação Newport.Análise

Referências

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