Indução de precisão e distinção dos reflexos de tosse e espirro em camundongos

Resumo

Este estudo estabeleceu modelos de tosse e espirro em camundongos aplicando estímulos específicos à traqueia e à cavidade nasal e desenvolveu um método baseado em áudio para distinguir entre tosses e espirros de camundongos, analisando diferenças em seus sinais acústicos.

Resumo

Tossir e espirrar, como reflexos defensivos respiratórios vitais, viram pesquisas sobre seus mecanismos restringidos pela estimulação inespecífica inerente aos modelos tradicionais. Os métodos existentes, como a nebulização com capsaicina ou ácido cítrico, podem ativar simultaneamente a tosse (mediada por fibras C traqueais) e o espirro (mediado pelos nervos do trigêmeo nasal), levando a observações comportamentais confusas. Embora estudos anteriores tenham tentado distinguir tosse e espirro analisando padrões respiratórios ou assinaturas acústicas, esses estudos carecem de modelos que possam estimular especificamente a traqueia e a cavidade nasal. Aqui, desenvolvemos um modelo murino empregando estimulação específica do local da traqueia (para induzir a tosse) e da cavidade nasal (para desencadear o espirro). Usando gravações multimodais sincronizadas, pletismografia de corpo inteiro (WBP), microfones ultrassônicos de banda larga (0-250 kHz) e videografia de alta velocidade (160 fps), quantificamos assinaturas fisiológicas distintas de tosse e espirro. Nossos achados revelaram que tanto a tosse quanto o espirro exibem padrões respiratórios de pico único e duplo, com diferenças significativas na composição de seus espectros de frequência de áudio. Ao construir um sistema de coordenadas baseado em recursos de áudio, fomos capazes de distinguir efetivamente tosse e espirros, mapeando-os para diferentes quadrantes do eixo de coordenadas. Este estudo, por meio de estimulação anatomicamente específica e análise de características acústicas, estabeleceu um modelo de camundongo capaz de distinguir quantitativamente entre tosse e espirro, fornecendo um método experimental de alta precisão para a investigação de reflexos de defesa das vias aéreas e desenvolvimento terapêutico direcionado.

Introdução

Tossir e espirrar são reflexos defensivos cruciais para o corpo eliminar substâncias estranhas do trato respiratório, e anormalidades em suas vias neurais relacionadas geralmente desencadeiam doenças crônicas, como tosse crônica e rinite. Ambos os reflexos envolvem uma fase inspiratória, uma fase compressiva e uma fase expiratória ^1,2. O reflexo da tosse é mediado principalmente por neurônios sensoriais das vias aéreas inervados pelo nervo vago ^3,4,5. Os neurônios vagos recebem estímulos mecânicos, químicos ou elétricos das vias aéreas e transmitem os sinais para o núcleo do trato solitário (NTS) na medula oblonga⁶. O NTS integra essas informações e, posteriormente, as projeta para os centros respiratórios na medula e na ponte⁷. Esses centros, em última análise, coordenam grupos musculares respiratórios relevantes (como diafragma, músculos intercostais e músculos laríngeos) para executar a ação da tosse, expelindo irritantes potencialmente nocivos e muco do trato respiratório através da cavidade oral ^8,9,10. O reflexo do espirro é mediado principalmente por neurônios sensoriais nasais dentro do gânglio trigêmeo^11,12. Seus estímulos mecânicos ou químicos são transmitidos ao núcleo espinhal do trigêmeo (SP5), que então retransmite as informações aos centros respiratórios 13,14,15,16. Esses centros regulam músculos relevantes (como músculos respiratórios, músculos palatinos e músculos faciais) para iniciar um espirro¹⁷. A poderosa explosão expiratória do espirro força a maior parte do ar pelo nariz para expelir os irritantes ^9,18. A pesquisa sobre tosse e espirro não apenas ajuda a elucidar os mecanismos neurais de defesa respiratória, mas também fornece alvos terapêuticos para tosse crônica e rinite. Para isso, estabelecer um modelo animal robusto e confiável é de suma importância.

Nos últimos anos, os camundongos surgiram como um organismo modelo fundamental para estudar as vias neurais da tosse e do espirro 19,20,21. A metodologia atual predominante ainda envolve a indução desses comportamentos reflexos por meio da inalação de compostos estimulantes aerossolizados ^8,20,22. Uma limitação significativa dessa abordagem inalatória é que os estímulos atuam simultaneamente na cavidade nasal e na traqueia, ativando de forma não específica os distintos sistemas aferentes sensoriais que mediam o espirro (pela via do trigêmeo) e a tosse (pela via vagal). Isso representa um desafio substancial para a diferenciação precisa do tipo de comportamento eliciado em experimentos. Essa discrepância é evidente na literatura: alguns estudos definem os reflexos respiratórios induzidos pela capsaicina em camundongos como espirros²¹, enquanto outros relatam que esses reflexos englobam os componentes da tosse e do espirro ^8,22.

Para enfrentar esse desafio, metodologias avançadas foram desenvolvidas, incluindo a análise de padrões e trajetórias respiratórias para classificar comportamentos reflexos distintos⁸. Outro estudo demonstra que tosses e espirros apresentam diferenças marcantes nas características temporais e espectrais, como duração, modulação de frequência²². Seu trabalho destacou que a tosse exibe concentração de energia em faixas de frequência de pico mais baixas (20-80 kHz), enquanto os espirros exibem componentes que se estendem além de 90 kHz²². Essas divergências acústicas oferecem uma nova estrutura não invasiva para discriminação comportamental, complementando as análises tradicionais de formas de onda respiratórias. Apesar dessas inovações, persiste uma lacuna crítica: os modelos existentes carecem de especificidade anatômica na entrega de estímulos, muitas vezes confundindo as vias do reflexo traqueal e nasal. Essa limitação mostra que precisamos de melhores maneiras de direcionar e estudar os reflexos respiratórios.

Pesquisas sobre os mecanismos subjacentes à tosse e espirro induzidos por estimulação mecânica e química das vias aéreas têm sido extensivamente conduzidas em modelos animais de grande porte (por exemplo, gatos)¹⁷. No entanto, em modelos de pequenos animais (por exemplo, porquinhos-da-índia, ratos e camundongos), as limitações técnicas normalmente exigem a dependência de compostos aerossolizados (como capsaicina ou ácido cítrico) para obter estimulação química.

Este protocolo propõe um novo método para induzir comportamentos semelhantes à tosse e espirros em camundongos e estabelece um novo conjunto de métodos para quantificar e caracterizar esses reflexos respiratórios. Essa abordagem estabelece uma estratégia para diferenciar comportamentos semelhantes à tosse e espirros em camundongos, identificando vocalizações características e analisando suas características espectrais e intensidade acústica. Essa nova metodologia tem o potencial de padronizar a quantificação dos reflexos respiratórios murinos, melhorar a reprodutibilidade experimental e aprofundar a compreensão mecanicista da neurofisiologia da tosse e do espirro.

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes do Protocolo de Uso e Cuidados com Animais do Guangzhou Lab (GZLAB-AUCP- 2024-04-A10). Camundongos fêmeas e machos, camundongos C57BL/6 livres de patógenos específicos, com idades entre 8 e 10 semanas, foram utilizados neste estudo.

1. Preparação experimental

1. Preparação de animais para experiências
   1. Alojar ratos em gaiolas com livre acesso a comida e água e mantê-los a 22 ± 1 °C num ciclo normalizado de 12 horas de luz/escuridão.
2. Preparação da solução de capsaicina
   1. Dissolva 30,5 mg de capsaicina em pó em PBS contendo 10% de etanol e 10% de Tween-80 para preparar uma solução estoque de 10 mM.
   2. Diluir a solução-mãe 1:100 em soro fisiológico para preparar a solução de trabalho a 100 μM.
3. Preparação de Tribromoetanol (Avertina)
   1. Pesar 0,5 g de tribromoetanol em um tubo Eppendorf de 1,5 mL. Adicione 1 mL de 2-metil-2-butanol.
   2. Incubar a 55 °C com agitação (400-600 rpm) no escuro até dissolver completamente (~20 min).
   3. Colocar 40 ml de soro fisiológico num copo. Enquanto mexe, adicione a solução de tribromoetanol dissolvida gota a gota. Continue mexendo até que os cristais dissolvidos se dissipem completamente (~40 min).
   4. Ajuste o pH para 7,0-7,3 usando NaOH.

2. Estabelecimento e registro de modelo de comportamento semelhante à tosse

1. Preparação da cânula de implantação
   1. Corte uma agulha de 28 G (ID: 0,19 mm, OD: 0,35 mm) em uma cânula de ~ 5 mm. Alise ambas as extremidades com papel abrasivo usando uma pinça. Prenda uma extremidade ao tubo de silicone (ID: 0.3 mm, OD: 0.8 mm). Conecte a uma seringa de 1 mL e lave a cânula com água para verificar a permeabilidade.
   2. Cânula de curvatura a 90° com proporção de braço de 2:3. Insira o braço mais longo no tubo de silicone (ID: 0,3 mm, OD: 0,8 mm, 5 cm de comprimento; Figura 1A). Designe a extremidade dobrada para implantação traqueal. Estenda o tubo de silicone da traqueia até o crânio para fixação (Figura 1B).
2. Preparação da configuração do equipamento de controlo
   1. Prepare o sistema de pletismografia de corpo inteiro (WBP), gravador ultrassônico, câmera de alta velocidade, bomba de microinjeção.
3. Atribuição de grupo de mouse
   1. Atribua aleatoriamente os camundongos a três grupos (n = 6/grupo): i) Grupo de controle: Mantenha o status normal de não tratamento. ii) Grupo simulado: Implantar a cânula traqueal sem estimulação. iii) Grupo de estimulação: Implantar a cânula traqueal e administrar capsaicina para induzir a tosse.
4. Procedimento cirúrgico
   1. Anestesiar os camundongos por injeção intraperitoneal de tribromoetanol (125-250 mg / kg) e confirmar a anestesia completa pela ausência de resposta a uma pinça do dedo do pé.
   2. Prenda o rato anestesiado em decúbito dorsal. Depile os pelos cranianos e cervicais. Desinfete com iodóforo. Usando uma tesoura cirúrgica, apare uma seção circular do couro cabeludo com aproximadamente 5 mm de diâmetro para expor o crânio.
   3. Sob microscópio: Incisar a pele cervical por aproximadamente 1 cm. Dissecar tecidos e músculos sem rodeios para expor a traqueia. Perfure o tecido mole entre as cartilagens cricóide e traqueal usando agulha 32 G. Crie uma abertura traqueal mínima com tesoura oftálmica.
      NOTA: Mantenha o tamanho da abertura grande o suficiente para o diâmetro da cânula para evitar danos aos tecidos.
   4. Insira a cânula de metal (revestida com silicone) ~ 1 mm no lúmen traqueal. Fixe a junção cânula-traqueia com sutura 7-0.
      NOTA: Limite a profundidade de inserção a 1 mm para evitar comprometimento respiratório.
   5. Túnel bruscamente subcutâneo do pescoço ao crânio. Encaminhe o tubo de silicone para o crânio e fixe-o com cimento dentário.
   6. Incisão cervical de sutura. Coloque o mouse em uma almofada de aquecimento até que esteja consciente. Casa em gaiola por 5 dias.
   7. Lave a cânula/tubo traqueal diariamente com seringa de ar de 1 mL.
      NOTA: Omita o rubor dentro de 24 horas antes da indução da tosse.
5. Gravação de tosse
   1. Encaixe a sonda ultrassônica com um anel de vedação compatível com a porta. Insira a sonda na porta da câmara WBP para garantir um contato hermético.
   2. Conecte a câmara WBP, o sensor de fluxo e o fluxo de polarização. Calibre via software.
   3. Prenda um tubo de silicone fixado no crânio a um tubo de extensão de 30 cm. Coloque o mouse na câmara WBP. Estenda o tubo pela porta superior. Sele a porta com massa de modelar. Verifique a estanqueidade da câmara confirmando que os picos da forma de onda respiratória estão entre 4 ± 2.
   4. Carregue 1 mL de seringa com 5 mL de solução de capsaicina. Elimine bolhas de ar. Conecte ao tubo de extensão. Monte a seringa na bomba de microinjeção e ajuste o fluxo para 10 μL ^min-1.
      NOTA: O fluxo excessivo pode transportar capsaicina para a cavidade nasal.
   5. Posicione uma câmera de alta velocidade voltada para a câmara. Ajuste a distância e o foco. Defina a taxa de amostragem para 160 fps (máximo).
   6. Inicie simultaneamente o WBP, o ultrassom e o software da câmera; acione a bomba para infundir a capsaicina. Registre a contagem de tosse por 10 min.

3. Estabelecimento e registro de modelo de comportamento semelhante ao espirro

1. Preparação de equipamentos experimentais
   1. Prepare um tubo de PE estéril (ID: 0,5 mm, OD: 1 mm) para fixação como cânula de estimulação no osso nasal murino.
   2. Prepare um filamento de nylon esterilizado de 0,25 mm de diâmetro para estimulação nasal transcânula. Com base no método de calibração de Vonfrey, quando o filamento de 5 cm de comprimento é pressionado verticalmente em uma balança até dobrar a aproximadamente 45°, a força medida é de 0,6 g.
2. Configuração do equipamento de gravação
   1. Pronto um sistema de pletismografia de corpo inteiro (WBP), um gravador de ultrassom e uma câmera de alta velocidade.
3. Atribuição de grupo de mouse
   1. Atribua aleatoriamente camundongos a três grupos (n = 6/grupo): i) Grupo de controle: Mantenha o status basal não tratado. ii) Grupo simulado: Fixar cânula nasal sem estimulação. iii) Grupo de estimulação: Fixar cânula nasal + evocar espirro via estimulação de filamento.
4. Procedimento cirúrgico
   1. Anestesiar os camundongos por injeção intraperitoneal de tribromoetanol (125-250 mg / kg) e confirmar a anestesia completa pela ausência de resposta a uma pinça do dedo do pé.
   2. Raspe os pelos do crânio craniano e da ponte nasal.
   3. Prenda o mouse em um quadro estereotáxico. Desinfete com iodóforo. Incisar a pele sobre o crânio e o osso nasal. Exponha o osso nasal.
   4. Crie um orifício de 0,5 mm na junção entre o osso nasal e o processo lateral da cartilagem septal nasal usando uma microbroca. Exponha a mucosa nasal.
      NOTA: Limite o tamanho do orifício a 0,5 mm para evitar danos aos tecidos.
   5. Levante suavemente a mucosa nasal com agulha 32 G. Exponha a cavidade nasal.
   6. Monte o tubo PE no braço estereotáxico. Posicione a ponta do tubo nivelada com o orifício da rebarba. Prenda o tubo ao osso nasal com cimento dentário.
   7. Coloque o mouse em uma almofada de aquecimento até que a consciência retorne.
5. Gravação de espirros
   1. Conecte a câmara WBP, o sensor de fluxo e o fluxo de polarização de acordo com o manual. Calibre usando software.
   2. Instale a sonda ultrassônica com uma junta adaptada à porta. Insira a sonda na câmara. Verifique uma vedação hermética.
   3. Transfira o mouse para a câmara WBP. Estenda o tubo PE pela porta superior. Sele a porta com massa de modelar ao redor do tubo. Verifique a estanqueidade da câmara confirmando que os picos da forma de onda respiratória estão entre 4 ± 2.
   4. Posicione uma câmera de alta velocidade voltada para a câmara. Ajuste a distância e o foco. Defina a taxa de amostragem para 160 fps (máximo).
   5. Avance um filamento de náilon de 0,25 mm de diâmetro através de um tubo macio para a cavidade nasal até profundidades de 0-3 mm. A parte do filamento que se projeta do tubo portátil tem 5 cm de comprimento. Durante a estimulação, pressione esta extremidade livre até que ela se dobre a 45°, fornecendo ~0,6 g de força à mucosa nasal por 1 s, repita uma vez a cada 30 s. Registre as respostas dos espirros por 10 min.

4. Tosse e espirro induzidos por capsaicina em camundongos

1. Atribuição em grupo
   1. Divida os camundongos em cirurgia simulada e grupos de cirurgia (n = 5 / grupo). Grupo simulado: Exponha os nervos etmoidais e infraorbitais anteriores bilaterais. Grupo de cirurgia: Transecto bilateral dos nervos etmoidais anteriores e infraorbitais.
2. Nebulização ultrassônica
   1. Prepare a câmara comportamental (20 cm × 14 cm × 17 cm).
   2. Posicione o gravador ultrassônico e a câmera para um monitoramento ideal.
   3. Carregue o nebulizador com 100 μM de solução de capsaicina. Forneça pulsos de aerossol de 30 s a cada 2 minutos por 10 minutos.
   4. Registre comportamentos continuamente usando o gravador ultrassônico e a câmera.

5. Processo de análise de dados

1. Pletismografia de corpo inteiro (WBP) análise do traçado respiratório
   1. Importe os arquivos de texto gravados WBP para o software Spike2 e sincronize-os com os sinais de áudio.
   2. Analise os sinais de áudio correspondentes aos padrões respiratórios de pico único e duplo e registre a duração da fase de compressão para cada padrão.
   3. Selecione o ponto mais baixo da fase expiratória como ponto médio e pegue os dados de meio segundo antes e depois para calcular o valor médio.
2. Análise de forma de onda de áudio
   1. Importe arquivos de áudio para o software Spike2, selecione o áudio individual de tosse ou espirro e exporte-os no formato TXT (com uma taxa de amostragem definida para 100 kHz e duração de 0,1 s).
   2. Importe os arquivos TXT para o Excel e converta-os nos valores absolutos dos sinais de áudio.
   3. Use o software GraphPad Prism para suavizar os valores absolutos das formas de onda de áudio usando uma spline de suavização com 50 pontos.
      NOTA: Para garantir que a curva se aproxime dos dados originais, evitando pontos de inflexão excessivos, selecionar uma spline de suavização de 50 pontos é ideal; As curvas geradas com valores maiores que 50 pontos mostram um desvio insignificante da curva de 50 parâmetros.
   4. Com base nas formas de onda de áudio suavizadas, calcule a inclinação k do ponto inicial ao ponto mais alto.
3. Análise espectral de áudio
   1. Importe arquivos de áudio para o software Spike2.
   2. Selecione os pontos de tempo de início e término do áudio individual de tosse ou espirro para análise espectral e exporte os resultados da análise espectral.
   3. Use o GraphPad Prism para gerar curvas de análise espectral e calcular a área sob as curvas.
   4. Calcule a proporção da área sob a curva entre as bandas de frequência de 30-60 kHz e 0-30 kHz para distinguir entre tosse e espirro.
4. Cálculo do índice composto
   1. Realize uma transformação logarítmica natural (ln) na inclinação k e na razão da área sob a curva de análise espectral para aumentar a discriminabilidade dos dados.

6. Análise estatística

1. Os dados são apresentados como média ± EPM. As comparações estatísticas entre os dois grupos foram realizadas por meio do teste t e ANOVA de duas vias, com P < 0,05 considerado estatisticamente significativo. Todas as análises foram realizadas com o software GraphPad Prism.

Resultados

Neste estudo, realizamos uma análise detalhada dos padrões respiratórios dos comportamentos de tosse e espirro de camundongos usando pletismografia de corpo inteiro (WBP) e técnicas de registro de ultrassom. Os resultados mostraram que os camundongos submetidos à cirurgia traqueal ou nasal demonstram capacidade de resposta comparável à tosse e ao espirro aos controles ingênuos. No entanto, a capsaicina (química) e a estimulação mecânica evocam efetivamente reflexos de tosse e espirro nesses animais preparados cirurgicamente (Figura 2A, B). Os resultados da WBP revelaram que ambos os comportamentos exibiram padrões de pico único e duplo, com seus sinais sonoros aparecendo durante o estágio expulsivo do padrão respiratório (Figura 3A, C, E, G). Uma análise ultrassonográfica adicional revelou perfis acústicos distintos: os sons da tosse exibiram início abrupto com pico de intensidade ocorrendo instantaneamente, predominantemente na faixa de frequência de 0-30 kHz e duração mais curta (Figura 3B,D; Vídeo de apoio S1). Os sons dos espirros demonstraram aumento progressivo de intensidade até a amplitude máxima, distribuição de frequência de banda larga (0-80 kHz) e duração prolongada (Figura 3F,H; Vídeo de apoio S2). A análise estatística revelou que a fase média de compressão do comportamento de tosse de pico único foi de 32,39 ± 0,73 ms, significativamente menor do que a do comportamento de tosse de pico duplo em 53,17 ± 2,29 ms (Figura 4A, B, C). A fase média de compressão do comportamento de espirros de pico único foi de 44,03 ± 1,84 ms, inferior ao valor médio do comportamento de tosse de pico duplo, enquanto a fase média de compressão do comportamento de espirros de pico duplo foi de 74,24 ± 1,29 ms, significativamente mais longa do que a do comportamento de espirros de pico único (Figura 4E, F, G). Além disso, a razão de ocorrência do padrão de pico único no comportamento de tosse foi de 77,55 ± 2,10% (Figura 4D), enquanto no comportamento de espirro, o padrão de pico único foi responsável por apenas 32,42 ± 5,88%, com o padrão de pico duplo representando 67,58 ± 5,88% (Figura 4H). A análise estatística da duração do áudio indicou diferenças significativas entre os tempos de áudio de tosse e espirro, mas houve considerável sobreposição entre os dois (Figura 5A). Por meio da análise espectral do áudio ultrassonográfico de tosse e espirro, descobrimos que o espectro de frequência do áudio da tosse concentrou-se principalmente na faixa de 0-30 kHz, enquanto o áudio do espirro teve uma proporção maior na faixa de 0-60 kHz (Figura 5B). Embora o áudio da tosse também apresentasse frequências na faixa de 30-120 kHz, a proporção de frequências baixas sempre foi maior do que a de frequências altas. Portanto, usamos a inclinação da intensidade sonora do ponto inicial até o valor máximo (Figura 5C) como a coordenada vertical e a razão de energia de 30-60 kHz a 0-30 kHz (Figura 5D) como a coordenada horizontal para estabelecer um sistema de coordenadas, que poderia efetivamente distinguir o áudio de tosse e espirro. Além disso, não houve diferenças significativas entre tosse de pico único e duplo, bem como espirros de pico único e duplo nesse sistema de coordenadas (Figura 5E).

Em seguida, empregamos os métodos de classificação acima mencionados para categorizar os comportamentos de tosse e espirro induzidos pela nebulização da capsaicina em camundongos. Descobrimos que os comportamentos de tosse e espirro induzidos pela nebulização da capsaicina se sobrepõem aos evocados por estimulação específica nas mesmas posições de coordenadas (Figura 5F,G). Após a transecção dos nervos aferentes sensoriais nasais (nervos etmoidais e infraorbitais anteriores), a nebulização com capsaicina reduziu significativamente os sinais acústicos associados ao espirro, enquanto os perfis de áudio relacionados à tosse permaneceram inalterados (Figura 5H, I).

Figura 1: Diagrama esquemático da operação no modelo de traqueia estimulada e cavidade nasal. (A) Representação esquemática do cateter implantado na traqueia. (B) Os planos frontal (esquerdo) e coronal (direito) mostram a posição do cateter implantado na traqueia do camundongo. (C) O plano sagital mostra a posição de implantação do cateter na cavidade nasal e a posição de estimulação das fibras filamentares. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Quantificação de comportamentos semelhantes a tosse e espirro provocados por estimulação específica do local. (A) Quantificação do espirro do grupo controle normal, grupo simulado e grupo de estimulação nasal mecânica. O grupo simulado exibiu frequência de espirros comparável aos controles. A estimulação nasal mecânica evocou um aumento significativo nos eventos de espirros. (B) Quantificação da tosse do grupo controle normal, do grupo simulado e do grupo de provocação traqueal com capsaicina. O grupo sham não mostrou diferença significativa na frequência de tosse em comparação com os controles. A estimulação traqueal com capsaicina aumentou significativamente a contagem de tosse. Os dados são representados como a média ± EPM, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Os traços respiratórios e o oscilograma sonoro da tosse e do espirro. (A) Imagens representativas mostrando o traçado respiratório de pico único e a gravação de áudio durante uma tosse induzida por capsaicina. (B) O oscilograma sonoro (superior) e o espectrograma (inferior) da gravação de áudio da tosse em A. (C) Imagens representativas mostrando o traçado respiratório de picos duplos e gravação de áudio durante uma tosse induzida por capsaicina. (D) O oscilograma sonoro (superior) e o espectrograma (inferior) da gravação de áudio da tosse em C. (E) Imagens representativas mostrando o traço respiratório de pico único e gravação de áudio durante um espirro induzido por estimulação mecânica. (F) O oscilograma de som (superior) e o espectrograma (inferior) da gravação de áudio do espirro em E. (G) Imagens representativas mostrando o traçado respiratório de picos duplos e gravação de áudio durante um espirro induzido por estimulação mecânica. (H) O oscilograma sonoro (superior) e o espectrograma (inferior) da gravação de áudio do espirro em G. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Os picos simples e duplos dos traços respiratórios de comportamentos semelhantes à tosse e espirros. (A) Traços respiratórios médios (vermelho) e individuais (cinza) e médios (vermelho) de comportamentos semelhantes à tosse com um único pico respiratório (n = 52). (B) Traços respiratórios médios (vermelho) e individuais (cinza) e médios (vermelho) de comportamentos semelhantes à tosse com picos respiratórios duplos (n = 29). (C) Duração das fases compressivas de picos respiratórios simples e duplos para tosse induzida por capsaicina (pico único n = 52, picos duplos n = 29). (D) A proporção média de traços de pico respiratório simples e duplo na tosse (n = 6 camundongos). (E) Traços respiratórios médios (vermelho) e individuais (cinza) e médios (vermelho) de comportamentos semelhantes a espirros com picos respiratórios únicos (n = 40). (F) Traços respiratórios médios (vermelho) e individuais (cinza) e médios (vermelho) de comportamentos semelhantes a espirros com picos respiratórios duplos (n = 74). (G) Duração das fases compressivas de picos respiratórios simples e duplos para espirros induzidos por estimulação mecânica (pico único n = 40, picos duplos n = 74). (H) A proporção média de traços de pico respiratório simples e duplo no espirro (n = 6 camundongos). Os dados são representados como a média ± EPM, ****P < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: A frequência e a classificação da forma de onda do oscilograma sonoro de tosse e espirro. (A) Quantificação da duração do ultrassom de tosses e espirros. (B) A análise média do espectrograma de espirros induzidos por estimulação mecânica (n = 69, preto) e tosses induzidas por capsaicina (n = 140, vermelho). (C) Um diagrama esquemático representativo para calcular a inclinação de um oscilograma sonoro. A análise comparativa da spline de suavização revela que, em 25 pontos, a suavização excessiva obscurece as características originais dos dados, enquanto os valores que excedem 50 pontos (por exemplo, 75 pontos) mostram sobreposição substancial com a curva de 50 spline, mas introduzem pontos de inflexão adicionais. (D) Um diagrama esquemático representativo do cálculo da razão de área, usando os resultados da análise espectral para calcular a área sob diferentes curvas de frequência no GraphPad Prism. A razão de área é igual à área sob a curva de 30-60 kHz e a área sob a curva de 0-30 kHz. (E) A classificação da frequência e da forma de onda dos espirros induzidos por estimulação mecânica e do oscilograma sonoro de tosses induzidas por capsaicina, com o eixo y representando o expoente da inclinação da forma de onda sonora da linha de base ao pico, e o eixo x representando o expoente da proporção de ondas sonoras entre 30-60 kHz e 0-30 kHz. (F) A análise média do espectrograma de espirros induzidos por nebulização de capsaicina (n = 36, preto) e tosses induzidas por nebulização de capsaicina (n = 42, vermelho). (G) A classificação da frequência e da forma de onda dos espirros induzidos por nebulização de capsaicina (n = 36, preto) e tosse induzida por nebulização de capsaicina (n = 42, vermelho) oscilograma sonoro, com o eixo y representando o expoente da inclinação da forma de onda sonora da linha de base ao pico, e o eixo x representando o expoente da proporção de ondas sonoras entre 30-60 kHz e 0-30 kHz. (H) Dados estatísticos sobre o reflexo de espirro induzido por capsaicina em grupos com nervos etmoidais e infraorbitais anteriores seccionados versus o grupo de cirurgia simulada. (I) Dados estatísticos sobre o reflexo de tosse induzido por capsaicina em grupos com nervos etmoidais e infraorbitais anteriores seccionados versus o grupo de cirurgia simulada. Os dados são representados como a média ± EPM, **P < 0,01, ****P < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo Suplementar 1: Vídeo de comportamento semelhante à tosse sincronizado com seu espectrograma de áudio, exibido em velocidade normal e 0,1x. Clique aqui para baixar este arquivo.

Vídeo Suplementar 2: Vídeo de comportamento semelhante ao espirro sincronizado com seu espectrograma de áudio, exibido em velocidade normal e 0,1x. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Neste estudo, induzimos com sucesso comportamentos de tosse e espirros em camundongos, estimulando especificamente a traqueia com capsaicina e estimulando mecanicamente a cavidade nasal ^8,17. Coletamos dados de pletismografia de corpo inteiro (WBP), gravações de áudio e vídeo e descobrimos que as taxas de frequência de áudio e as inclinações da intensidade do som podem efetivamente diferenciar entre comportamentos de tosse e espirro em camundongos ^8,23.

Dada a natureza delicada dos procedimentos cirúrgicos envolvidos, atenção especial deve ser dada a várias etapas críticas. Primeiro, durante a cirurgia traqueal, a cânula intratraqueal implantada deve ser o mais fina possível e inserida em uma profundidade rasa para evitar obstrução das vias aéreas, o que pode levar a desconforto respiratório ou até mortalidade. Além disso, como as secreções dentro da traqueia podem bloquear facilmente o cateter, a depuração diária do cateter é crucial. Ao administrar capsaicina, a velocidade de injeção deve ser cuidadosamente controlada para evitar o fluxo retrógrado para a cavidade nasal, o que pode desencadear reflexos de espirros. Em segundo lugar, durante a cirurgia de implantação do osso nasal, o tamanho do orifício perfurado é crucial para evitar danos excessivos ao camundongo. O cateter deve ser colocado ao nível do osso nasal sem ser inserido muito profundamente, para evitar irritação excessiva da cavidade nasal ou interferência na respiração normal. Em última análise, a implementação de procedimentos cirúrgicos precisos é essencial para o experimento. Ao minimizar os ferimentos no camundongo, não apenas a recuperação pode ser acelerada, mas também respostas comportamentais experimentais mais precisas podem ser registradas. Esses métodos cirúrgicos ajudam a aumentar a confiabilidade do modelo e garantir dados de alta qualidade, fornecendo assim uma base experimental sólida para o estudo de comportamentos reflexos respiratórios, como tosse e espirros.

Tradicionalmente, a modelagem do comportamento da tosse tem se baseado na nebulização de compostos como capsaicina e ácido cítrico para induzir a tosse^24,25. No entanto, essa abordagem carrega limitações notáveis: não apenas provoca tosse, mas também pode desencadear concomitantemente reflexos de espirros ^8,22. Além disso, foi observada uma variabilidade interindividual significativa na sensibilidade a estímulos aerossolizados²⁶, e um subconjunto de camundongos não exibiu nenhuma resposta à tosse. Em contraste, o novo paradigma de estimulação mecânica desenvolvido neste estudo alcança comportamentos estáveis semelhantes à tosse, permitindo a personalização flexível de estímulos por meio de atuadores intercambiáveis. Da mesma forma, os modelos convencionais de espirros que empregam agentes aerossolizados sofrem de baixa especificidade comportamental, pois frequentemente evocam tosse colateral²², dificultando a diferenciação entre esses reflexos respiratórios distintos.

Estudos anteriores estabeleceram modelos de tosse e espirro em camundongos usando capsaicina e diferenciaram os dois com base nas características dos padrões respiratórios (picos simples ou duplos) registrados pela pletismografia de corpo inteiro (PCI)⁸. Os dados de nossa pesquisa indicam que, no comportamento de tosse induzida, o padrão respiratório de pico único foi responsável por 77,55 ± 2,10% das ocorrências, enquanto no comportamento de espirro, o padrão de pico único foi responsável por 32,42 ± 5,88%. Esses resultados confirmam que o método de classificação baseado nos padrões respiratórios da PCI é eficaz na maioria dos casos, mas apresenta limitações e não permite a perfeita diferenciação entre os dois comportamentos. Além disso, alguns estudos tentaram distinguir tosse de espirro usando as características de duração e frequência dos sinais de áudio²². Embora a duração média dos sinais de áudio para o comportamento de espirro seja tipicamente maior do que para a tosse, existe uma sobreposição substancial entre as durações de eventos individuais. Portanto, confiar na duração do áudio como um indicador distintivo pode não ter discriminação suficiente. Além disso, a análise espectral de tosse e espirros não revelou um limite claro: tosses leves podem se manifestar apenas como sinais de baixa frequência, enquanto tosses vigorosas podem produzir sons que incluem componentes significativos de alta frequência, com características espectrais semelhantes às dos espirros. Notavelmente, os eventos de tosse exibem consistentemente uma proporção maior de energia de baixa frequência. Em contraste, a proporção de energia de alta frequência para baixa frequência (Razão de Energia de Alta para Baixa Frequência) pode fornecer uma característica acústica mais discriminativa para distinguir entre comportamentos de tosse e espirro.

Nossa inovação aborda essas limitações por meio de estimulação mecânica espacialmente restrita. O modelo comportamental refinado demonstra vantagens duplas: (1) precisão em nível milimétrico em sondas estabilizadas de aplicação de estímulo e (2) especificidade comportamental aprimorada. Além disso, nossa extensa análise da acústica de tosse e espirro revela que esses comportamentos exibem perfis distintos de intensidade sonora, com diferenças estatisticamente significativas em suas relações de energia de alta a baixa frequência. Além disso, nossa análise acústica abrangente de eventos de tosse e espirro revela perfis distintos de intensidade sonora entre esses comportamentos, acompanhados por diferenças estatisticamente significativas em suas relações de energia de alta para baixa frequência. Além disso, esse método de classificação também é viável nos registros acústicos dos comportamentos de tosse e espirro induzidos pela nebulização da capsaicina. Coletivamente, esses parâmetros acústicos permitiram o desenvolvimento de um espaço de recursos multidimensional que estabelece um padrão objetivo e quantificável para diferenciar tosse e espirro. O resultado estabelece um bom padrão para investigar os mecanismos de defesa das vias aéreas com redução de fatores de confusão e melhor reprodutibilidade. Isso não apenas resolve desafios de longa data na pesquisa de reflexos respiratórios, mas também abre caminhos para estudos precisos de neuromodulação dos circuitos neurais de tosse e espirro.

Embora esse método induza efetivamente comportamentos de tosse e espirros em camundongos, ele ainda tem algumas limitações. Em comparação com a indução de nebulização, a cirurgia pode causar algum grau de lesão em camundongos, embora nos esforcemos para minimizar os danos durante o procedimento. No entanto, a cirurgia ainda pode provocar comportamentos de tosse e espirros de forma estável, indicando que a cirurgia em si não diminui a sensibilidade dos camundongos a esses estímulos. Desafios técnicos também surgiram na fenotipagem comportamental. A fidelidade do sinal acústico exigia uma calibração precisa do posicionamento do microfone do sujeito para equilibrar as relações sinal-ruído, evitando a saturação de amplitude. Além disso, a integração de cateteres de entrega de estímulo com câmaras de pletismografia de corpo inteiro (WBP) exigiu projetos especializados: o cateter deve se estender do topo da câmara sem impedir os movimentos naturais do camundongo ou a entrega do estímulo. Em resumo, apesar das limitações do método cirúrgico, ele fornece um meio eficaz de induzir comportamentos de tosse e espirros de forma estável em camundongos e, com um processo experimental cuidadosamente projetado, as lesões no camundongo podem ser minimizadas para garantir a coleta precisa de dados comportamentais.

Em conclusão, por meio dessas delicadas manipulações cirúrgicas e desenho experimental rigoroso, estabelecemos um modelo que induz de forma estável comportamentos de tosse e espirros em camundongos, fornecendo uma base experimental confiável para um estudo mais aprofundado desses dois comportamentos reflexos respiratórios.

Materiais

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2-metil-2-butanol	Sigma-Aldrich	240486-100ML
Avisoft RECORDER USGH	Avisoft		Para gravação ultrassônica
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Capsaicina	MCE	HY-10448
Balanço Eletrônico	Shanghai ZhuoJing	BSM-220.4
GraphPad Prisma	GraphPadSoftware		Usado para gráficos e análise de dados
Sistema de Câmera de Alta Velocidade	Filr	20102748
Iodóforo	LIRCON		https://www.lircon.cn/products_details/218.html
Bomba de microinjeção	XIMAINANOTECH	XMSP-C
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UltraSoundGate 116Hme	Avisoft	116Hme/63
Software admiad WBP	TOW-INT-TECH		Usado para gravação WBP
Sistema de pletismografia corporal WBP	TOW-INT-TECH	2403-3204