Detecção rápida de Staphylococcus aureus e Staphylococcus aureus resistente à meticilina por PCR fluorescente multiplex em tempo real

Summary

Este protocolo usa PCR multiplex em tempo real com primers/sondas direcionados aos genes nuc e MRSA mecA específicos de SA. Ele permite a detecção rápida (<1 h) e qualitativa de ácidos nucleicos SA/MRSA em amostras de escarro humano, superando as limitações dos métodos baseados em cultura.

Abstract

Staphylococcus aureus (S.aureus) é um patógeno humano Gram-positivo comum que causa infecções nosocomiais e adquiridas na comunidade, com diversas manifestações clínicas que vão desde lesões superficiais locais e intoxicação alimentar até infecções sistêmicas fatais. A descoberta de antibióticos reduziu significativamente a taxa de mortalidade, mas o problema da resistência aos medicamentos tornou-se cada vez mais proeminente. Desde a primeira identificação de MRSA em 1960, essa cepa emergiu como uma ameaça global à saúde pública. O MRSA é um dos principais patógenos das infecções nosocomiais, capaz de causar várias doenças graves, como endocardite, osteomielite crônica, pneumonia, artrite piogênica e bacteremia. Portanto, a detecção rápida e precisa de S. aureus e sua resistência a drogas é crucial para orientar o tratamento clínico.

Os métodos atuais de detecção de rotina para S. aureus e MRSA têm limitações significativas. O método tradicional de cultura bacteriana, servindo como "padrão ouro" por décadas, pode fornecer identificação definitiva de espécies e resultados de sensibilidade a medicamentos, mas o processo é demorado, levando de 48 a 72 horas. Além disso, este método é suscetível à contaminação e conta com instalações laboratoriais especializadas e técnicos qualificados. O teste sorológico alcança um diagnóstico não invasivo detectando anticorpos S.aureus no soro do paciente, mas não consegue distinguir entre infecções ativas e infecções passadas, nem pode identificar cepas resistentes a medicamentos (como MRSA).

Este estudo se concentra no desenvolvimento de um novo método de detecção de PCR de fluorescência multiplex em tempo real para superar as limitações acima mencionadas. Este método projeta primers específicos e sondas fluorescentes TaqMan direcionadas ao gene nuc específico da espécie de S.aureus e ao gene mecA que medeia a resistência à meticilina, permitindo amplificação e detecção simultâneas de S.aureus e MRSA em um único sistema de reação. Essa tecnologia reduz muito o tempo de detecção, fornecendo uma solução rápida, precisa e econômica para detecção de S.aureus e MRSA. Essa abordagem inovadora melhora muito a eficiência do diagnóstico clínico e facilita a implementação precoce da antibioticoterapia direcionada, fazendo contribuições importantes para o controle de infecções bacterianas resistentes a medicamentos.

Introduction

O S. aureus é um patógeno condicional Gram-positivo amplamente difundido que coloniza a mucosa nasal de indivíduos saudáveis ^1,2. Quando a imunidade do hospedeiro está comprometida, pode causar infecções cutâneas locais, invasão de tecidos profundos ou doenças sistêmicas (por exemplo, pneumonia, endocardite, osteomielite e bacteremia)³. A meticilina, uma penicilina semissintética, foi clinicamente aplicada para infecções por S. aureus em 1959 e, dois anos depois, o MRSA surgiu no Reino Unido, espalhando-se rapidamente para países europeus, incluindo Dinamarca, França e Suíça⁴. A resistência do MRSA aos antibióticos β-lactâmicos não apenas complica o manejo clínico, mas também eleva significativamente os riscos de infecção⁵. Vários fatores - incluindo colonização/disseminação incontrolável, altos custos de prevenção e uso excessivo de antibióticos - aumentaram coletivamente as taxas de infecção por MRSA⁶. Devido à sua rápida transmissão e complexos mecanismos de resistência, as infecções por MRSA estão associadas a altas taxas de letalidade, com quase 150.000 casos relatados e >7.000 mortes anualmente nos países da UE⁷. De acordo com dados de vigilância da CHINET, as taxas de infecção por MRSA na China permaneceram acima de 30% nos últimos cinco anos⁸. O alto risco de infecção cruzada nosocomial intensifica ainda mais os encargos de saúde pública e sobrecarrega os sistemas de saúde ^9,10. Portanto, o desenvolvimento de tecnologias eficientes e precisas de detecção rápida de MRSA é clinicamente urgente para alcançar o diagnóstico precoce, terapia personalizada, reduzir a mortalidade e interromper as cadeias de transmissão.

As tecnologias atuais de detecção para S. aureus e MRSA abrangem vários campos, incluindo detecção fenotípica, detecção genômica, detecção transcriptômica, detecção proteômica, tecnologia de espectrometria de massa e análises baseadas em bioinformática¹¹.

Métodos de detecção fenotípica, como o método de difusão em disco (método KB) e o método de concentração inibitória mínima (método MIC), são recomendados como "padrões ouro" pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) e pelo Comitê Europeu de Testes de Suscetibilidade Antimicrobiana (EUCAST). Esses métodos têm as vantagens de não necessitar de instrumentos especializados, sendo amplamente utilizados para vigilância do espectro de resistência e investigação epidemiológica. No entanto, suas desvantagens também são evidentes: longos períodos de cultura (acima de 24 h) e os resultados do método KB para alguns novos antibióticos requerem validação por valores de MIC, com resultados para cepas de breakpoint sendo suscetíveis a fatores humanos^12,13.

Dentre os métodos de detecção em nível genômico, a PCR convencional apresenta as características de alta sensibilidade e forte especificidade, possibilitando o julgamento preliminar da resistência e encurtando o tempo experimental, com baixo custo e alta eficiência. Mas suas limitações residem em ser capaz de detectar apenas genes de resistência conhecidos e contar com instrumentos especializados¹⁴. O mecanismo de resistência microbiana é altamente complexo, tornando crucial o desenvolvimento de métodos técnicos que possam cobrir fenótipos resistentes desconhecidos e permitir uma rápida identificação. A emergente tecnologia GoPhAST-R (AST genotípica e fenotípica combinada por meio de detecção de RNA) determina fenótipos de resistência detectando níveis de expressão de mRNA, permitindo a detecção simultânea de diferentes genes relacionados à resistência em vários patógenos, reduzindo o tempo de resposta experimental e alcançando 94-99% de precisão quando combinada com aprendizado de máquina¹⁵.

Dentre os métodos de detecção em nível proteômico, o método de aglutinação em látex PBP2a é baseado na ligação antígeno-anticorpo específico, com operação simples e resultados rápidos, possuindo alta especificidade e sensibilidade para MRSA. No entanto, não consegue diferenciar entre diferentes espécies de estafilococos, e a sensibilidade de detecção dos kits comerciais tem alguma diminuição, exigindo novos testes após a indução com oxacilina⁸.

Os métodos de detecção baseados em MALDI-TOF MS, como o método DOT-MGA (DNA Oligonucleotide Tag-Microarray Detection of Genomic Amplification), alcançam um desempenho analítico ideal em 6-8 horas de incubação, com uma taxa de detecção de até 96,4%, e tanto a sensibilidade quanto a especificidade são de 100%. Mas o custo é alto e as posições limitadas na placa-alvo dificultam a detecção simultânea de centenas de amostras ^16,17.

Entre as tecnologias de análise de bioinformática combinadas com dados ômicos para previsão de resistência, a tecnologia de sequenciamento do genoma completo se destaca por seus recursos de análise de informações abrangentes e de alta resolução. Combinado com bancos de dados de análise de genes de resistência como o Resfinder, ele pode analisar se as cepas carregam genes de resistência específicos, prever o potencial de resistência, detectar polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) e mutantes de genes associados à resistência, ao mesmo tempo em que suporta o armazenamento e a reanálise de dados do genoma completo¹⁸. No entanto, esse método requer operação por profissionais com formação em bioinformática, raramente é usado em testes diários e é comumente usado para análise epidemiológica ou vigilância molecular de patógenos¹⁹.

As metodologias acima mencionadas são de alto custo, demoradas ou ainda em fase de pesquisa e desenvolvimento. Clinicamente, há uma necessidade urgente de uma solução que equilibre "imediatismo" e "precisão" - uma nova tecnologia de PCR fluorescente multiplex preenche essa lacuna amplificando simultaneamente os genes nuc/mecA em um único tubo, comprimindo o ciclo de detecção para 1 h. Ele preenche com precisão a lacuna da janela de tempo no processo tradicional de "triagem de emergência - digitação por resistência", fornecendo uma ferramenta de diagnóstico molecular mais eficiente em termos de tempo para prevenção e controle de infecções nosocomiais. Este ensaio de PCR específico é utilizado principalmente para a detecção de amostras respiratórias, com amostras de escarro como um exemplo típico. Apresenta sensibilidade de 500 cópias/mL e alta especificidade, sem ser afetado por agentes antibacterianos. Devido a essas características de desempenho favoráveis, este ensaio de PCR possui um valor de aplicação substancial para o diagnóstico de infecções do trato respiratório e a vigilância de infecções nosocomiais causadas por MRSA.

Protocol

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Popular da Província de Guangdong (Nº de Ética: KY2025-510-01). Informações detalhadas sobre os materiais utilizados nesta pesquisa (reagentes, produtos químicos, equipamentos e softwares) podem ser encontradas na Tabela de Materiais.

1. Protocolo de coleta e preservação de amostras

1. Critérios de inclusão: Com exceção dos materiais de controle de qualidade, identificar todas as amostras coletadas como espécimes positivos usando o método padrão-ouro (ensaio baseado em cultura).
2. Coleta de escarro humano
   1. Colete 1-3 mL de expectoração de tosse profunda do trato respiratório inferior de indivíduos usando tubos de amostragem estéreis. Selar os tubos imediatamente e transportá-los para análise. Processe as amostras imediatamente para teste.
3. Armazenamento de amostras:
   1. Analise as amostras coletadas pelo método acima imediatamente. O armazenamento de curto prazo é permitido nas seguintes condições:
      2-8 °C: ≤7 dias
      -20 °C ± 5°C: ≤6 meses
      -70 °C ± 5°C: ≤24 meses
      NOTA: Neste estudo, as amostras de escarro não foram tratadas com conservantes (como caldo BHI + glicerol, etc.). Após a coleta, eles foram armazenados nas condições descritas acima, e o congelamento e descongelamento repetidos foram estritamente evitados. Evite ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. Ciclos máximos permitidos de congelamento e descongelamento: ≤3.

2. Extração de ácido nucleico

NOTA: Conclua todos os procedimentos dentro de um gabinete de biossegurança para evitar contaminação.

1. Para pré-tratamento de amostra de escarro, misture a amostra com solução de NaOH a 4% na proporção de 1:4 (amostra de escarro: solução de NaOH a 4%) para liquefazer amostras de escarro viscoso e eliminar impurezas interferentes, depois vórtice completamente (30 s) e incubar em temperatura ambiente (22-25 °C) por 30 min para obter a liquefação.
2. Preparação de reagentes de extracção de ácidos nucleicos
   1. Retire a placa pré-embalada de 96 poços do kit. Agite levemente a placa de 96 poços para concentrar os reagentes e as esferas magnéticas no fundo da placa de 96 poços.
   2. Rasgue cuidadosamente o filme de vedação de folha de alumínio, evitando vibrar a placa de 96 poços para evitar respingos de líquido.
   3. Nas soluções da Coluna 1 e Coluna 7 da placa de 96 poços: Primeiro, adicione 20 μL de proteinase K e, em seguida, adicione 200-300 μL de amostra a ser extraída.
3. Extração automatizada de ácidos nucleicos (método baseado em esferas magnéticas)
   1. Coloque a placa pré-embalada de 96 poços com amostras adicionadas no slot correspondente do instrumento automatizado de extração de ácido nucleico.
   2. Siga o processo de extração de ácido nucleico conforme descrito abaixo.
      1. Usando o bastão magnético na câmara do laboratório, transfira as esferas magnéticas adsorvidas com ácido nucléico para diferentes orifícios de reagente.
      2. Use o conjunto de agitação para misturar o líquido rápida e repetidamente, de modo que o líquido e as esferas magnéticas se misturem uniformemente.
      3. À medida que os grânulos líquidos e magnéticos se combinam harmoniosamente, a máquina automatizada de extração de ácido nucleico progride através dos estágios sucessivos de lise celular, adsorção de ácido nucleico (70 °C, 15 min, 3 vezes de adsorção magnética), lavagem (3 vezes, misture por 2 min de cada vez, depois execute a adsorção magnética duas vezes (15 s cada) e eluição (2 vezes, misture por 5 min de cada vez, 3 vezes de adsorção magnética), eventualmente, obtém ácido nucléico de alta pureza.
      4. Validar a concentração e a pureza do ácido nucleico utilizando um espectrofotómetro. O volume da amostra de ácido nucleico foi de 50 μL, com a concentração variando de 50 a 100 ng/μL, e a relação A260/A280 sendo de 1,8 ± 0,2.
   3. Após o término do programa, aspire diretamente a solução de eluição contendo ácido nucleico da coluna 6 e da coluna 12 para testes subsequentes. Se necessário, armazene as amostras de ácido nucleico extraídas restantes a -20 °C para preservação a longo prazo e utilização futura.

3. qPCR Detecção de ácidos nucleicos S. aureus e ácidos nucleicos MRSA

1. Preparação de reagentes de amplificação
   1. Retirar a solução de reação de amplificação de ácidos nucleicos e a solução de reação nuc/mecA do kit (iniciadores/sonda específicos do gene nuc para S. aureus e mecA para MRSA). Após o descongelamento a 22-25 °C, oscile totalmente e misture uniformemente, depois execute a centrifugação instantânea (~6000 g, 15 s, 22-25 °C).
   2. De acordo com o número de amostras a serem testadas, N, prepare reagentes com base na quantidade total de N+2 (N é o número de amostras e 2 são os controles de qualidade negativos e positivos). As etapas específicas são as seguintes:
      1. Preparar a mistura do sistema de reação (16 μL de solução de reação de amplificação de ácidos nucleicos (tampão, dNTPs, DNA polimerase, enzima UDG) + 4 μL de solução de reação nuc/mecA (primers e sondas para os genes de detecção de alvos nuc, mecA e a referência interna do GAPDH).
      2. Adicione-o a um tubo de centrífuga de tamanho apropriado, oscile totalmente e misture uniformemente e execute a centrifugação instantânea (~ 6000 g, 15 s, 22 ° C-25 ° C). Em seguida, dispense 20 μL por tubo em tubos de reação de PCR.
2. Adicione amostras de ácido nucleico e controle de qualidade:
   1. Nos tubos de reação de PCR preparados acima (20 μL), respectivamente, adicione 5 μL de ácido nucleico das amostras testadas, controle positivo e controle negativo, atingindo um volume final de 25 μL por tubo.
   2. Tampe bem os tubos e execute a centrifugação instantânea (~ 6000 × g, 15 s, 22-25 ° C) e, em seguida, coloque os tubos no instrumento de PCR.
3. Amplificação por reação em cadeia da polimerase (PC
   1. Defina o programa de ciclismo da seguinte forma: Pré-desnaturação: 97 °C, 90 s, 1 ciclo; as 2 etapas seguintes para 42 ciclos: desnaturação a 97 °C por 2 s e recozimento a 55 °C por 15 s.
   2. Defina os parâmetros de detecção do sinal de fluorescência da seguinte forma: use a marcação fluorescente FAM de genes nuc ; Marcação fluorescente VIC de genes mecA ; e marcação fluorescente CY5 do gene GAPDH como controle interno do kit. Recolha os dados a 55 °C. Após a conclusão da reação, certifique-se de que os dados sejam salvos para análise futura.
   3. Analise os dados usando software específico para qPCR (SLAN 96P):
      1. Informações da amostra: No diagrama de layout da placa do poço do software, rotule os tipos de amostra (por exemplo, controle positivo, controle negativo, amostra desconhecida, gene de referência interno, etc.) correspondentes às posições de carregamento da amostra.
      2. Colocação dos tubos de reação: Abra a tampa do módulo de aquecimento do instrumento, coloque a placa/tubos PCR selados firmemente dentro, certifique-se de que eles se encaixem perfeitamente no módulo de aquecimento e feche bem a tampa do módulo (para evitar irregularidades de temperatura)
      3. Iniciando a reação: depois de confirmar que as configurações do programa no software estão corretas, clique em Iniciar execução e registre a ID do experimento para referência futura.
      4. Parando a execução e removendo os tubos: Após o término da execução do programa, espere que a temperatura do módulo de aquecimento caia abaixo de 50 °C, abra a tampa para remover a placa/tubos PCR e manuseie as amostras adequadamente.
4. Análise de dados
   1. Antes da análise dos dados, confirme três resultados visuais: 1) As curvas de amplificação de todas as amostras (incluindo controle interno) mostram uma forma típica de S, sem curvas ascendentes planas ou anormalmente atrasadas; 2) A linha do limiar de fluorescência cruza a fase exponencial das curvas, e os valores de Ct do controle interno (por exemplo, GAPDH) estão dentro de ≤ 38 ciclos (coeficiente de variação < 5%); 3) Controles negativos/positivos são incluídos ao longo de todo o experimento para monitorar a possibilidade de contaminação.
      1. Se o experimento estiver fora de controle, verifique novamente todo o lote. Se uma amostra mostrar amplificação anormal (como uma curva S atípica ou um valor Ct dentro da faixa crítica), verifique novamente essa amostra específica.
   2. Chame os dados experimentais no software, defina o limite e a linha de base e calcule os valores de Ct automática ou manualmente, pois o instrumento seleciona automaticamente o limite da linha de base. Fixar o valor final de determinação positiva em Ct ≤ 36; o intervalo de referência para o gene de referência interno requer Ct ≤ 38. Confirme se suas curvas de amplificação exibem perfis característicos em forma de S.

Results

Detecção de S. aureus e MRSA usando qPCR
Com base no gene nuc específico da espécie de S. aureus e no gene mecA de resistência a medicamentos de MRSA, projetamos primers e sondas marcados com fluoróforos distintos para detecção de qPCR. Todos os resultados de controle de qualidade ao longo dos experimentos de qPCR caíram consistentemente dentro dos limites recomendados, confirmando a confiabilidade dos resultados de detecção (Fig...

Discussion

A detecção precisa e precoce da resistência à meticilina é fundamental para o prognóstico de infecções causadas por S. aureus. A identificação precoce de S. aureus e MRSA pode reduzir o uso indevido de antibióticos de amplo espectro e diminuir a pressão seletiva que leva ao surgimento e disseminação da resistência bacteriana.

Os métodos tradicionais de detecção fenotípica, como a difusão em disco de cefoxitina, requerem um período de cultivo ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Extrator de ácido nucleico automatizado	DAAN	Inteligente 32	Para extração de DNA
BSC-1500IIA2-X	BIOBASE	SEDA 20143222263	Gabinete de biossegurança
E-Centrífuga	WEALTEC		Centrifugue o líquido residual da parede do tubo
Kit de detecção de genes de resistência a medicamentos Staphylococcus aureus resistente à meticilina	BOJIE	ZC-HX-38-2	Detecção de genes de resistência a Staphylococcus aureus resistentes à meticilina
Kit de extração de ácido nucleico	BOJIE	TQ-BG-001-96B	Extrato de ácido nucleico
SLAN Sistema de análise de PCR médico totalmente automático	HONGSHI		Análise de dados
Máquina de PCR em tempo real SLAN-96S	HONGSHI	SLAN-96S	Amplificação de PCR quantitativa fluorescente
Thermo Scientific NanoDrop	Thermo Científico	NanoDrop Um	Análise quantitativa de DNA, RNA e proteínas
Congeladores de temperatura ultrabaixa (DW-YL450)	MELING	20172220091 SEDA	-20 & graus; C para armazenamento de reagentes
Vórtice-5	Kylin-bell		Para reagente de mistura