Artigo de método

Um ensaio LIVE/DEAD otimizado acoplado à citometria de fluxo para quantificar a sobrevivência pós-estresse em células de levedura

DOI:

10.3791/69005

⸱

29 de agosto de 2025

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1Department of Biology, University of Iowa, 2Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar a sobrevivência pós-estresse em amostras de leveduras. O ensaio emprega dois corantes fluorescentes, SYTO 9 e iodeto de propídio (PI), para quantificar a integridade da membrana plasmática. Ele usa citometria de fluxo para fornecer estimativas quantitativas e reprodutíveis das frações de células vivas, mortas e danificadas para amostras de estresse pós-oxidativo.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Quantificar a sobrevivência é uma tarefa comum e crítica na pesquisa de leveduras. As colorações VIVAS/MORTAS baseadas na integridade da membrana plasmática fornecem um ensaio rápido e de alto rendimento para a sobrevivência da levedura quando combinadas com citometria de fluxo. No entanto, variações no tampão de coloração, concentração de corante, tempo de incubação e configurações de citometria de fluxo podem afetar a qualidade e a reprodutibilidade dos dados. Este protocolo apresenta um ensaio padronizado LIVE/DEAD para quantificação de sobrevivência pós-estresse em leveduras usando citometria de fluxo. Após o tratamento de Candida glabrata, um patógeno oportunista de leveduras, com diferentes doses de peróxido de hidrogênio, as amostras pós-estresse foram coradas com uma coloração LIVE/DEAD de dois componentes consistindo de SYTO 9 e iodeto de propídio (PI). A citometria de fluxo foi usada para distinguir populações de células vivas, danificadas e mortas e quantificar suas porcentagens em cada amostra. As estimativas de sobrevivência baseadas na estatística de porcentagem ao vivo foram comparadas com o resultado da Unidade Formadora de Colônias (UFC) na mesma amostra. Os dois métodos produziram resultados consistentes para as amostras tratadas com dose simulada e letal (1 M, H, 2, O, 2). Na dose subletal de 100 mM H2O2, o SYTO 9/PI estimou uma taxa de sobrevivência maior do que a UFC, refletindo uma diferença fundamental entre os dois, onde o protocolo aqui apresentado avalia a sobrevivência celular imediatamente após o estresse, enquanto a UFC quantifica a porcentagem de células capazes de se recuperar e se reproduzir. Portanto, este protocolo mede a viabilidade em um estágio inicial do processo de morte celular. Em resumo, o protocolo descrito aqui fornece uma alternativa rápida e escalável à UFC para quantificação de sobrevivência pós-estresse em leveduras. Seus resultados fornecem informações complementares à UFC, avaliando a sobrevida em um estágio inicial e distinguindo entre células mortas e danificadas.

Introdução

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O subfilo de leveduras em brotamento contém muitos modelos biológicos e biotecnológicos importantes. Uma tarefa comum e crítica na pesquisa de leveduras é quantificar o efeito de perturbações genéticas ou ambientais, incluindo estresse ou tratamentos medicamentosos. Na fermentação industrial, por exemplo, os produtores devem monitorar a viabilidade das culturas de levedura para garantir a eficiência e a qualidade do processo de fermentação 1,2. Ao estudar espécies de leveduras patogênicas, medir sua sobrevivência após estresse ou tratamento antifúngico é fundamental para entender a base genética e mecanicista de características relacionadas a infecções, como resistência antifúngica. Medir a sobrevida em cateteres e superfícies também é uma tarefa importante em ambientes clínicos3. Todos esses diversos cenários exigem abordagens quantitativas que possam medir com rapidez e precisão o resultado dos tratamentos medicamentosos e de estresse.

Os métodos existentes para atingir o objetivo acima se enquadram em três categorias principais com base no que eles medem. A primeira categoria mede a clonogenicidade, ou a capacidade de células de levedura individuais de formar uma única colônia após o estresse. O método representativo nesta categoria é o ensaio da Unidade Formadora de Colônias (UFC). A segunda categoria mede a vitalidade, que se baseia na detecção de atividades enzimáticas em células vivas. Exemplos incluem sondas químicas, como o corante FUN-14. A terceira categoria de métodos mede a integridade da membrana plasmática - uma perda irreversível da integridade da membrana plasmática é considerada o "ponto sem retorno" para a morte celular5. Exemplos desta categoria incluem corantes fluorescentes, como iodeto de propídio (PI).

Este trabalho apresenta um ensaio LIVE/DEAD otimizado acoplado à citometria de fluxo para obter quantificação rápida e escalável da sobrevivência de leveduras após o tratamento de estresse. Este ensaio baseado em permeabilidade de membrana é mais rápido que o UFC, levando 15-30 minutos de coloração em comparação com 24-48 h de incubação para a formação de colônias. Além disso, as amostras coradas com uma coloração VIVA/MORTA podem ser prontamente analisadas usando citometria de fluxo, além da microscopia, que mede dezenas de milhares de células em poucos segundos e pode processar facilmente amostras de 96 poços para ensaios de alto rendimento. Como resultado, este ensaio é rápido, quantitativo e escalável. Neste protocolo, uma coloração LIVE/DEAD de dois componentes consistindo em SYTO 9 e PI é usada para obter maior poder de resolução. O SYTO 9 marca todas as células, vivas ou mortas, enquanto o IP só entra nas células com membranas plasmáticas comprometidas 6,7. Portanto, as células vivas acumulam apenas SYTO 9, enquanto as células mortas acumulam SYTO 9 e PI. Como o PI tem uma afinidade maior do que o SYTO 9 para o ácido nucléico, ele exclui competitivamente este último na célula8. Além disso, os dois corantes formam um par de transferência de energia de ressonância de Förster (FRET), onde a emissão de SYTO 9 é absorvida por PI como sua excitação. Como resultado, as células mortas exibem fluorescência verde e vermelha forte. Em contraste, as células vivas exibem fluorescência verde brilhante8. Essa diferença permite uma melhor diferenciação entre células vivas e mortas na presença de variações na intensidade de fluorescência dentro de cada grupo.

Desde um relatório inicial de sua aplicação em leveduras em 2004, o uso de SYTO 9 / PI em estudos de leveduras tem sido irregular e amplamente limitado a avaliações qualitativas usando microscopia7 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 . Uma grande limitação à sua adoção como ensaio quantitativo para a sobrevivência de leveduras é a falta de caracterização sistemática e comparação com métodos amplamente utilizados, como o UFC. Este protocolo descreve um ensaio padronizado incluindo o tampão de coloração, a concentração do corante, o tempo de coloração e as configurações de citometria de fluxo, que minimizam os artefatos e geram resultados reprodutíveis quando aplicados a C. glabrata e duas outras espécies de leveduras16. Como a coloração SYTO 9 / PI revela uma população intermediária "danificada" de células que diferem das células vivas e mortas em seu padrão de coloração, ela pode complementar a UFC, revelando informações mais sutis sobre os efeitos do tratamento do estresse nas células de levedura, potencialmente permitindo novas aplicações.

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Protocolo

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Os detalhes dos reagentes e dos equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Aplicação de estresse de peróxido de hidrogênio

  1. Pelo menos um dia antes do experimento, inocular uma cultura noturna de C. glabrata de uma única colônia em uma placa recém-listrada em 3 mL de meio sintético completo (SC) (1,7 g / L de base de nitrogênio de levedura, mistura completa de aminoácidos, 2% p / v de glicose, água) e cultive-o colocando o tubo de vidro em um tambor de rolo e cresça a 30 ° C. Alternativamente, um agitador orbital pode ser usado colocando o tubo de vidro em um ângulo inclinado e agitando a cultura a 200 rpm.
    1. Meça a densidade óptica (OD600) da cultura durante a noite na manhã seguinte e dilua-a com meio SC fresco para OD600 ~ 0,2 em um volume total de 10 mL. Deixe crescer por duas duplicações, o que leva cerca de 4 h, para atingir a fase intermediária (OD600 ~ 1).
      EXEMPLO: Se uma cultura noturna tiver um OD600 = 10, adicione 200 μL dessa cultura a 9,8 mL de meio SC.
  2. Dentro de 30 minutos antes do tratamento de estresse, prepare o meio de estresse de peróxido de hidrogênio. Dilua em série o peróxido de hidrogênio do estoque de 30% (9,798 M) em meio sintético completo (SC) até a concentração desejada. Inclua um tratamento simulado (SC sem adição de peróxido de hidrogênio) e uma dose letal (1 M é adequado para C. glabrata).
    EXEMPLO: Para fazer um meio de estresse de peróxido de hidrogênio de 100 mM, adicione 10,3 μL do estoque de peróxido de hidrogênio de 9,798 M a 1 mL SC. Pipete suavemente para misturar. Para fazer um meio de estresse de peróxido de hidrogênio de 10 mM, dilua 500 μL do meio de estresse de peróxido de hidrogênio de 100 mM em 4,5 mL de SC.
  3. Meça o OD600 da cultura mid-log e padronize-o para, por exemplo, OD600 = 1, adicionando meio SC.
    EXEMPLO: A cultura mid-log está em OD600 = 1,2. Adicione 0,2 mL de meio SC por 1 mL de cultura.
  4. Transfira 600 μL de cultura mid-log por condição de teste para uma placa de 96 poços profundos. Células de pellets por centrifugação a 3.000 x g por 5 min à temperatura ambiente. Remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração sem perturbar o pellet celular.
  5. Adicione 600 μL de meio de estresse simulado ou de peróxido de hidrogênio preparado na etapa 1.2 a cada poço e pipete suavemente para ressuspender as células.
  6. Incubar a placa durante 120 min a 30 °C com agitação a 300 rpm.
    NOTA: O tempo de incubação depende da questão biológica de interesse.

2. Aplicação da coloração SYTO 9/PI

  1. Antes do experimento, prepare pelo menos 10 mL de tampão salino estéril a 0,85%.
    NOTA: Encontramos tampão salino a 0,85% para produzir artefatos de coloração mínimos, ou seja, células não coradas e mortas em amostras tratadas simuladas, em comparação com água deionizada ou meio de crescimento16.
  2. Preparar uma solução de stock de PI a 0,2 mM utilizando água desionizada estéril.
    NOTA: Este estoque de trabalho de PI pode ser armazenado por até 6 meses a 4 °C.
  3. Imediatamente antes do experimento, prepare uma solução de estoque SYTO 9 funcional a 33,4 μM com água deionizada estéril.
    NOTA: Prepare o estoque de trabalho SYTO 9 fresco para cada experimento. Não armazene e reutilize.
  4. Pipete suavemente para misturar as células em cada poço da placa de tratamento. Meça o OD600 de cada condição de tratamento e calcule a quantidade de tampão necessária para ressuspender as células para um OD600 de 1.
    NOTA: As pipetas multicanal podem ser usadas para uma mistura eficiente e uniforme. Evite misturar demais as amostras.
  5. Colete as células de levedura após o tratamento simulado ou de estresse por centrifugação a 3.000 x g por 5 min. Remova o sobrenadante cuidadosamente por aspiração. Ressuspenda as células em tampão salino estéril a 0,85% para OD600 = 1 (calculado na etapa 2.4).
    NOTA: Use uma pipeta multicanal para ressuspender as células. Manuseie todas as culturas pós-tratamento com cuidado e evite misturar demais.
  6. Reserve 50 μL de cada amostra para servir como controles de coloração sem coloração e corante único.
    NOTA: Autofluorescência mínima foi encontrada para C. glabrata do tipo selvagem em ambos os canais para SYTO 9 e PI. No entanto, sempre verifique se há autofluorescência em amostras não coradas e execute a subtração de fundo adequada ou use meios de crescimento de baixa autofluorescência.
  7. Alíquota de 16 μL de amostra pós-tratamento ressuspensa em tampão salino a 0,85% para um tubo de PCR de 50 μL. Adicione 2 μL do estoque de trabalho de 0,2 mM de PI à suspensão da célula. Em seguida, adicione 2 μL do material de trabalho de 33,4 μM de SYTO 9 ao mesmo tubo para um volume final de 20 μL.
    1. As concentrações finais de PI e SYTO 9 serão de 20 μM e 3,34 μM, respectivamente. Pipete suavemente para misturar e incubar por 30 min no escuro (uma caixa preta pode ser usada) em temperatura ambiente.

3. Configurando e calibrando o citômetro de fluxo

NOTA: Isso deve ser feito em cada novo instrumento e também em novas aplicações da coloração SYTO 9/PI, inclusive para uma espécie/cepa diferente, novo estressor ou protocolo de crescimento, etc. As configurações abaixo foram desenvolvidas em um citômetro de fluxo Attune NxT. Consulte o manual do usuário do instrumento em uso para obter instruções específicas.

  1. Escolha canais/filtros de fluorescência adequados para o citômetro de fluxo: um filtro passa-banda de 530 nm ± 30 nm (BL1) e um filtro passa-longo de 600 nm (> 600 nm, BL3) foram usados para coletar sinais nos canais verde (SYTO 9) e vermelho (PI e SYTO 9). Ambos estavam entusiasmados com um laser azul de 488 nm.
  2. Defina a taxa de fluxo para 200 μL/min e pare quando pelo menos 30.000 eventos forem coletados.
    NOTA: O número de eventos por amostra pode ser ajustado com o objetivo de obter estimativas robustas das porcentagens. Amostras com poucos eventos (células) devem ser excluídas. O próximo passo é ajustar as tensões nos canais FSC e SSC durante a configuração inicial.
  3. Dilua 16 μL de amostra não corada tratada com simulação em 200 μL de tampão salino estéril a 0,85%. Pipete suavemente para misturar imediatamente antes da citometria de fluxo. Execute este exemplo e ajuste as tensões dos canais FSC e SSC para que a população esteja no centro do FSC vs. Gráfico de densidade SSC.
    NOTA: Uma tensão de 345 mV e 399 mV foi usada para o FSC e SSC, respectivamente. Os próximos passos são ajustar as tensões nos canais de coleta (BL1 e BL3) durante a configuração inicial.
  4. Misture 24 μL de amostra tratada com simulação com 24 μL de amostra tratada com peróxido de hidrogênio 1000 mM ou morta pelo calor.
  5. Divida a amostra mista de células vivas e mortas em três tubos de 16 μL cada. Manchar os três tubos com (1) 2 μL de SYTO 9 e 2 μL de água por 30 min; (2) 2 μL PI e 2 μL de água por 30 min; (3) 2 μL SYTO 9 e 2 μL PI por 30 min. Siga o protocolo de coloração da seção anterior.
    1. Após a incubação, adicione 200 μL de tampão salino estéril a 0,85% a cada tubo. Eles agora estão prontos para citometria de fluxo.
  6. Passe o tubo (1) para ajustar a tensão do canal de fluorescência verde (BL1); em seguida, passe o tubo (2) para ajustar a tensão da fluorescência vermelha (BL3). O objetivo é fazer com que o modo de distribuição de intensidade de cada canal seja ~ 104-10 5 para utilizar toda a faixa dinâmica do instrumento.
    NOTA: Siga as instruções do seu citômetro de fluxo específico ao ajustar as tensões. Alguns citômetros de fluxo têm tensões fixas e esta etapa é omitida.
  7. Execute o tubo (3) para verificar se as populações de células vivas e mortas estão bem separadas. Ajuste as tensões do canal BL1 ou BL3, se necessário.
    NOTA: Um voltage de 200 mV foi usado para os canais BL1 e BL3 no Attune NxT.
  8. Execute a amostra não corada tratada com simulação sob as configurações de tensão estabelecidas para garantir que a amostra tenha autofluorescência mínima nos canais de interesse (<102).

4. Execução de amostras no citómetro de fluxo

  1. Aplique as configurações do citômetro de fluxo estabelecidas acima e execute a amostra não corada primeiro para garantir que os sinais de autofluorescência estejam abaixo de 102 nos canais BL1 e BL3.
  2. Adicione 200 μL de tampão salino a 0,85% a cada amostra corada e execute-a no citômetro de fluxo.
    NOTA: Se várias amostras forem analisadas, escalone a etapa de coloração de modo que cada amostra seja corada por 30 minutos antes de ser executada no citômetro de fluxo.
  3. Exporte a saída da citometria de fluxo como arquivos .fcs (padrão FCS 3.0 ou 3.1).

5. Análise de dados em R

NOTA: Um script de análise de amostra é fornecido como Arquivo Suplementar 1. Exemplos de estratégias de bloqueio são fornecidos na seção Resultados representativos.

  1. Instale e carregue os pacotes necessários: (1) flowCore (2) ggplot2 (3) ggcyto.
  2. Importe arquivos .fcs para o ambiente R atual.
  3. Ajuste os nomes dos arquivos e especifique as condições de tratamento.
  4. Faça um gráfico de densidade 2D para todos os eventos no FSC. H contra SSC.H. Use uma porta de polígono para excluir eventos que não sejam de célula. Nomeie este portão como "células".
    NOTA: Em determinados citômetros de fluxo, o parâmetro Área é recomendado sobre Altura. Verifique as recomendações específicas do instrumento.
  5. Para a população fechada de "células", faça um gráfico de densidade 2D no FSC. H contra FSC.W. Normalmente, dois clusters são visíveis com intervalos semelhantes de FSC. H, mas diferente FSC.W. O cluster com uma média mais baixa FSC. O nível W contém as células únicas ("singlets"). Desenhe uma porta poligonal para selecioná-los e nomeie a porta como "camisetas".
  6. Para a população fechada "singlets", faça um gráfico de densidade 2D em BL1. H contra BL3.H. Desenhe portas poligonais para populações vivas, danificadas e mortas com base nos controles de células vivas e mortas. Um exemplo é fornecido na seção Resultados representativos.
  7. Determine a sobrevivência usando as porcentagens de cada população e exporte as estatísticas.

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Resultados

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A coloração SYTO 9/PI distingue células vivas de levedura de células mortas com base em seus sinais de fluorescência nos canais verde (500 nm-560 nm) e vermelho (>600 nm). As células vivas, que acumulam apenas SYTO 9, fluorescem fortemente no canal verde, com sinais vermelhos mínimos. As células mortas acumulam SYTO 9 e PI e espera-se que fluorescam fortemente no canal vermelho, com sinais de fluorescência verde mais baixos em comparação com as células vi...

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Discussão

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Este protocolo descreve um ensaio LIVE/DEAD usando dois corantes fluorescentes, SYTO 9 e PI, e usando citometria de fluxo para quantificar a sobrevivência pós-estresse em leveduras. Embora essas duas colorações tenham sido aplicadas para avaliar a sobrevivência em várias espécies de leveduras na literatura e estejam disponíveis como um kit comercial, nem o manual do fabricante nem a literatura fornecem detalhes suficientes sobre o protocolo de coloração ou as configurações de citometria ...

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Divulgações

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Os autores não têm conflito de interesses.

Agradecimentos

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Gostaríamos de agradecer ao Dr. Michael Dailey e ao Carver Center for Imaging por seu treinamento e apoio à microscopia. Gostaríamos de agradecer aos membros anteriores e atuais do Laboratório Regulador de Genes pelo feedback inestimável sobre o protocolo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa de Poço Profundo de 96 PoçosThermo Fisher278606NUNC 96
Citômetro de fluxo Attune NxT com leitor de placasThermo Fisher A24858A24858Autosampler (A42901)
Candida glabrataCG99, cepa de laboratório derivada de isolado clínico (Cormack & Falkow, 1999)
FungaLight Yeast LIVE/DEAD KitThermo Fisher A24858L34952Contém SYTO 9 (3,34 mM) e iodeto de propidio (20 mM). Esses dois componentes também podem ser adquiridos separadamente de vários fornecedores.
Peróxido de hidrogénioSigma AldrichH1009
Microscópio Leica Confocal SP8LeicaTCS SP8 X
Cloreto de sódioSigma AldrichS9888Usado para fazer solução esterilizada de 0,85% de NaCl
Base de Nitrogênio de Levedura sem aminoácidosSigma AldrichY0626usado para fabricar o meio completo sintético com uma mistura de glicose e aminoácidos a 2%

Referências

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