Extração de RNA Baseada em Fenol Quente Otimizada de Micobactérias: Uma Abordagem Robusta para Análise Confiável de Expressão Gênica

Resumo

Este estudo otimiza um método de extração de RNA baseado em fenol quente para Mycobacterium, obtendo RNA de alta qualidade adequado para análises transcriptômicas. Quando comparado com TRIzol e RNeasy em condições idênticas, o método proporcionou maior rendimento, integridade comparável e melhor eficiência de custo, oferecendo uma alternativa prática para estudos de expressão gênica em larga escala.

Resumo

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) continua sendo uma grande ameaça à saúde global, destacando a necessidade de estudos transcriptômicos confiáveis para compreender sua biologia e mecanismos de resistência a medicamentos. Essas análises dependem da obtenção de RNA de alto rendimento e alta qualidade. Embora diversos métodos de extração de RNA estejam disponíveis, muitos exigem reagentes caros, grandes volumes de cultura ou equipamentos especializados, o que limita sua adequação para estudos em larga escala, especialmente em ambientes com recursos limitados. Aqui, apresenta-se um método otimizado de extração de RNA baseado em fenol quente, especificamente adaptado para micobactérias. O método utiliza volume mínimo de cultura e reagentes comumente disponíveis, gerando consistentemente RNA de alta qualidade, adequado para aplicações transcriptômicas de alto rendimento. A quantidade e integridade do RNA foram avaliadas por eletroforese em gel e análise de integridade do RNA (RIN), e sua adequação para aplicações posteriores foi confirmada por qPCR e Qubit 4. Para comparar o desempenho do método otimizado, realizou-se uma extração paralela de RNA utilizando TRIzol e RNeasy em condições experimentais idênticas, incluindo a mesma espécie de Mycobacterium, volume de cultura, fase de crescimento (logarítmica e estacionária) e condições de lise. Isso permitiu uma comparação direta de rendimento, qualidade, viabilidade e custo. O método otimizado de fenol quente demonstrou rendimento e qualidade de RNA comparáveis ou superiores, reduzindo significativamente o custo dos reagentes e a dependência de equipamentos especializados. Devido à sua eficiência, reprodutibilidade e baixo custo, este protocolo oferece uma alternativa prática para estudos em larga escala de expressão gênica e transcriptômica em Mtb e outras espécies de micobactérias.

Introdução

M. tuberculosis (Mtb), o agente causador da tuberculose (TB), continua sendo a principal causa de morte por um único patógeno infeccioso, superando o HIV/AIDS. Em 2024, a TB foi responsável por aproximadamente 1,3 milhão de mortes em todo o mundo¹. Esse ônus é agravado pelo aumento da prevalência de cepas resistentes a múltiplas drogas (RMD) e resistentes a drogas extensivamente (XDR). Portanto, há uma necessidade urgente de compreender a base molecular da patogênese da TB e identificar novos alvos terapêuticos².

O perfilamento transcricional de Mtb tornou-se uma ferramenta importante para elucidar elementos funcionais envolvidos nas interações hospedeiro-patógeno³, adaptação ao estresse ambiental⁴ e mecanismos subjacentes à resistência a medicamentos⁵. Metodologias avançadas, como PCR em tempo real, microarranjos e sequenciamento de RNA (RNA-seq), aumentaram significativamente a capacidade de analisar o transcriptoma micobacteriano⁶. No entanto, o sucesso desses métodos depende fortemente da disponibilidade de RNA de alta qualidade, o que, por sua vez, depende da lise celular eficiente durante a extração. A parede celular complexa de Mtb, composta por micolil–arabinogalactana–peptidoglicano, torna a extração de RNA particularmente difícil⁷. Técnicas de lise existentes, incluindo hidrólise enzimática⁸, sonicação⁹ e batimento com esferas¹⁰, frequentemente exigem equipamentos caros e grandes volumes de cultura, limitando sua praticidade em muitos laboratórios BSL-3. Além disso, a taxa de crescimento lenta de Mtb exige tempos prolongados de cultivo para obter biomassa suficiente¹¹.

Para superar essas limitações, foi desenvolvido um método otimizado de extração de RNA baseado em fenol quente que é rápido e econômico. Utilizando apenas 3 mL de cultura na fase logarítmica média, o método fornece 45–60 µg de RNA de alta qualidade adequado para análises transcritômicas subsequentes. A lise celular é realizada usando um moinho de tecidos compacto e de uso manual, juntamente com reagentes facilmente disponíveis, eliminando a necessidade de instrumentos caros. Embora o método de fenol quente já tenha sido descrito anteriormente^11,12, a versão otimizada melhora a praticidade, a relação custo-benefício e o rendimento de RNA. A otimização foi realizada utilizando M. smegmatis mc²155 (Msmeg) e validada com sucesso com Mtb H37Rv.

Protocolo

Os reagentes e o equipamento utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Cultivo de Mycobacterium

1. Inocule 1 mL do estoque glicerinado de Msmeg ou Mtb em 10 mL de meio Middlebrook 7H9 suplementado com 0,2% de glicerol, 0,05% de Tween 80 e 10% de ADC a 37 °C com agitação a 150 rpm até que a DO atinja 1–1,5.
2. Cultive a cultura secundária adicionando 1% da cultura primária em 10 mL de meio 7H9 até a fase logarítmica média, com DO_600nm = 0,6–0,7.
3. Divida em alíquotas de 3 mL e centrifugue as culturas a 2000 x g por 5 min à temperatura ambiente (23–25 °C).
4. Armazene os pellets a -80 °C até a extração de RNA.
   CAUTION: Para culturas de Mtb, siga as diretrizes adequadas de BSL3 e inative o pellet por calor a 95 ˚C por 20–25 min.
   NOTE: Figura 1 mostra o fluxograma das etapas básicas seguidas durante a extração de RNA pelo método do fenol quente.

Figura 1: Representação esquemática do método de Fenol Quente e sua análise. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

2. Extração de RNA

1. Método do fenol quente (método FQ)
   1. Adicione 200 µL de tampão TES (100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 5 mM EDTA, pH 8,0; 0,1 M NaCl; % SDS; 1% β-mercaptoetanol) ao pellet celular e ressuspenda o pellet por vortex.
   2. Adicione aproximadamente 0,1 g de esferas de sílica de 0,1 mm à amostra. Use um homogeneizador manual de tecidos por 10–15 s até que o pellet esteja completamente descongelado em gelo. Repita este passo por mais 2 ciclos, seguido por congelamento rápido em nitrogênio líquido após cada repetição.
   3. OU use um ruptor de esferas de bancada de alta velocidade por 1 min a uma velocidade de 5 (5,0 m/s) à temperatura ambiente. Repita este passo por 3 ciclos e incube a amostra em gelo para evitar aquecimento após cada ciclo.
      NOTA: Repita a lise de células de Mtb por 6–8 ciclos (cada ciclo por 1 min) com um homogeneizador manual de tecidos ou um ruptor de esferas, resfriando intermitentemente em gelo após cada ciclo. Use água tratada com DEPC (diethylpirocarbonato) para a preparação de todos os tampões e reagentes necessários para a extração de RNA.
   4. Adicione 200 µL adicionais de tampão TES (pré-aquecido a 65 °C) a cada amostra para completar o volume até 400 µL. A cada amostra, adicione 200 µL de fenol ácido (fenol equilibrado com tampão de citrato 100 mM, pH 4,5) e 200 µL de clorofórmio (misture o fenol ácido e o clorofórmio em proporção igual antes de adicioná-los à amostra).
   5. Incube a amostra a 65 °C em um bloco térmico com agitação a 900 rpm por 30 min e centrifugue a 12000 x g por 15 min à temperatura ambiente. Assegure uma separação adequada de fases após a centrifugação (uma fase aquosa superior clara contendo RNA, uma interfase distinta de DNA e uma fase orgânica inferior contendo proteínas e lipídios será observada).
   6. Remova a camada superior da fase aquosa e transfira-a para um novo tubo microcentrífugo de 1,5 mL. Adicione novamente um volume igual de fenol ácido:clorofórmio. Centrifugue a 12.000 x g por 15 min à temperatura ambiente. Assegure uma separação adequada de fases.
   7. Transfira a camada aquosa superior para um tubo microcentrífugo novo de 1,5 mL, então adicione 30 µL de tampão de acetato de sódio 3 M, pH 5,3, e 240 µL de isopropanol gelado. Incube a −80 °C por 30 min a 1 h.
      NOTA: O tubo microcentrífugo pode ser armazenado durante a noite a -80 °C nesta etapa. Sobreponha o tubo microcentrífugo com várias camadas de parafilm para evitar que se abra a 65 °C durante a incubação.
      CAUTELA: Fenol e clorofórmio são substâncias químicas perigosas; portanto, devem ser seguidos os equipamentos de proteção individual (EPI) adequados, controles de engenharia como capelas de exaustão e procedimentos específicos de descarte de resíduos.
   8. Centrifugue a 12.000 x g por 1 h à temperatura ambiente. Assegure a formação do pellet e remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet.
   9. Ressuspenda o pellet em 1 mL de etanol 75% e centrifugue a 12.000 x g por 1 min à temperatura ambiente. Realize este passo duas vezes e seque o pellet ao ar.
   10. Ressuspenda o pellet em 50 µL de água livre de nucleases.
       ​NOTA: Para dissolver o RNA, incube-o em água livre de RNase por 10–30 min à temperatura ambiente.
2. Método TRIzol
   1. Adicione 200 µL do reagente TRIzol ao pellet celular.
      CAUTELA: O TRIzol é uma substância química perigosa; portanto, devem ser seguidos os equipamentos de proteção individual (EPI) adequados, controles de engenharia como capelas de exaustão e procedimentos específicos de descarte de resíduos.
   2. Siga o método de lise celular conforme os passos 2.1.2 - 2.1.3.
   3. Adicione 200 µL adicionais de reagente TRIzol, seguido por 200 µL de clorofórmio, e vortex por 1 min. Centrifugue a 13.400 x g por 15 min a 4 °C. Assegure a separação adequada de fases após a centrifugação.
   4. Transfira cuidadosamente a fase aquosa para um novo tubo microcentrífugo de 1,5 mL.
   5. Precipite o RNA adicionando 500 µL de isopropanol à fase aquosa e incube a −80 °C por 30 min a 1 h.
   6. Pelotize o RNA por centrifugação a 15.000 x g por 20 min a 4 °C. Observe cuidadosamente o pellet e remova o sobrenadante sem perturbá-lo.
   7. Ressuspenda o pellet com 1 mL de etanol 75% e centrifugue a 13.400 x g por 1 min a 4 °C. Repita este passo duas vezes, seque o pellet ao ar por 30 min à temperatura ambiente e ressuspenda em 50 µL de água livre de nucleases.
3. Método com kit comercialmente disponível para extração de RNA
   1. Ressuspenda o pellet celular em 200 µL de tampão de ressuspensão (fornecido no kit).
   2. Siga o método de lise celular conforme os passos 2.1.2 - 2.1.3.
   3. Realize o experimento subsequente conforme as instruções do fabricante.

3. Tratamento com DNase, quantificação e visualização

1. Para remover a contaminação por DNA genômico, adicione 1 µL de DNase I (10 unidades) e 5 µL de tampão RDD (1x) a cada amostra de RNA e incube à temperatura ambiente por 30 min.
2. Quantifique a amostra de RNA espectrofotometricamente usando Nanodrop e a integridade do RNA usando um Qubit4. O valor aceitável de RIN está entre 7,5 e 10. Os valores aceitáveis de A₂₆₀/A₂₈₀ e A₂₆₀/A₂₃₀ estão na faixa de 1,8–2,0 e 2,0–2,2, respectivamente.
3. Visualize o RNA em gel de agarose a 1% utilizando corante de carregamento de RNA 1X.

4. Síntese de cDNA e PCR quantitativa em tempo real

1. Prepare uma reação de 20 µL para a preparação de cDNA utilizando o kit de Transcrição Reversa de cDNA e 1 µg de RNA, seguindo as instruções do fabricante em um termociclador.
2. Prepare uma reação de PCR em tempo real de 10 µL utilizando 50 ng de cDNA, 0,4 µM de cada par de primers e SYBR de acordo com as instruções do fabricante. Execute a amostra no termociclador de PCR em Tempo Real.
   OBSERVAÇÃO: Os seguintes primers foram utilizados para análise de qPCR:
   Mtb sigA Fw 5' cctcaaacagatcggcaagg 3', Mtb sigA Rv 5' cagatccacatcatgtcgcg 3'
   Mtb hsp70 Fw 5’ gctggtggacaagttcaagg 3', Mtb hsp70 Rv 5' ggtcagctgctcgtctaaga 3'
   Mtb16srRNA Fw 5' gcgatacgggcagactagag 3', Mtb16srRNA Rv 5' aaggaaggaaacccacacct 3'
   Ms. sigA Fw 5' gaagacaccgacctggaact 3', Ms.sigA ms Rv. 5' gactcttcctcgtcccacac 3'
   Ms. sigH Fw 5' gaagggttcccgtacaagg 3', Ms sigH Rv. 5' tcatgacgtcacctcctcg 3'
   Ms. sigE Fw 5' caccaccaaccttttcctcg 3', Ms. sigE Rv. 5' accctcgatgtcacacagg 3'

5. Análise estatística

1. Realize um teste t de Student com todas as réplicas biológicas utilizando o Graph Pad Prism; valores de P ≤ 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. As barras de erro representam o erro padrão de pelo menos três réplicas biológicas.

Resultados

Qualidade e rendimento do RNA

A qualidade e quantidade do RNA foram avaliadas por eletroforese em gel de agarose (Figura 2). Bandas distintas e nítidas correspondentes ao rRNA 23S e 16S foram observadas em todos os métodos de extração, confirmando o isolamento bem-sucedido de RNA total. Os métodos Hot Phenol e TRIzol apresentaram três bandas claras representando o rRNA 23S (~2900 pb), 16S (~1500 pb) e 5S (~120 pb), indicando RNA i...

Discussão

Para desenvolver um método simples e robusto de extração de RNA para Mycobacterium, o método do fenol quente foi otimizado. Posteriormente, o RNA extraído foi comparado com duas abordagens amplamente utilizadas: TRIzol e um método baseado em coluna em kit^12,13. Essas técnicas foram comparadas com base no rendimento, pureza, integridade, custo e tempo de processamento do RNA, a fim de avaliar sua praticidade para aplicações moleculares subsequentes. Tanto...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
esferas de sílica de 0,1 mm	MP Biomedicals	MP116911050
2-propanol	Sigma	278475
Bead Ruptor 4	revvity
clorofórmio	Sigma	288306
centrífuga fria	ThermoScientific	42541217
DNase I	qiagen	79254
EDTA	sigma	E02SS
HCl	SRL	62889
bloco térmico	MIULAB	MU-E02-1049
kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidade	Thermo Fischer Scientific	4368814
moinho de tecidos motorizado G10	Coron	G22616008
NaCl	sigma	S5886
Nanofotômetro N50	IMPLEM	T51601
fenol equilibrado com tampão de citrato 0,1 M, pH 4,5	Sigma	P4682
PowerUP SYBR	Applied Biosystems	A25742
fluorímetro Qubit 4	Invitrogen	2.32262E+12
ciclador térmico de PCR em tempo real	Analytik Jena AG	844-00503-2
kit RNA easy	Qiagen	74104
SDS	Sigma	S9888
acetato de sódio	Sigma	S2889
ciclador térmico	Biorad	621BR29739
Reagente TRI	Sigma	T9424
base de Tris	Himedia	MB029
β-mercaptoetanol	Sigma	516732