Efeitos anticancerígenos dos principais constituintes de Pileostegia tomentella via apoptose clássica mediada por ROS em células de câncer de pulmão de células não pequenas

Resumo

Este protocolo apresenta um método para avaliar a apoptose mediada por espécies reativas de oxigênio (ROS) induzida por compostos naturais em células de câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC).

Resumo

Este estudo explora o potencial anticancerígeno de Pileostegia tomentella, com foco particular em sua capacidade de induzir apoptose clássica em células de câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) H1299 por meio de vias mediadas por espécies reativas de oxigênio (ROS). Usando uma abordagem de isolamento guiada por bioatividade, dois compostos ativos, umbeliferona (UMB) e epi-Vogeloside, foram identificados como os principais constituintes citotóxicos. Ambos os compostos exibiram efeitos inibitórios significativos na viabilidade celular e efetivamente desencadearam a morte celular apoptótica em células H1299. Investigações mecanísticas demonstraram que o tratamento com UMB e epi-Vogeloside levou a um aumento acentuado nos níveis de ROS intracelulares, implicando o estresse oxidativo como um mediador chave. A análise de Western blot revelou níveis aumentados de caspase-3 clivada e diminuição da expressão da proteína antiapoptótica Bcl-2, indicando ativação da via apoptótica mitocondrial intrínseca. Além disso, o perfil transcriptômico mostrou alterações generalizadas na expressão gênica, apoiando ainda mais a interrupção da homeostase celular. Esses resultados sugerem que Pileostegia tomentella e seus constituintes ativos são promissores como potenciais agentes terapêuticos para o câncer de pulmão.

Introdução

O câncer representa um formidável desafio de saúde pública global, caracterizado por uma taxa de mortalidade anual substancial. O câncer de pulmão de células não pequenas (CPCNP) é o principal fator global de fatalidades relacionadas ao câncer, constituindo aproximadamente 85% das incidências de câncer de pulmão¹. A carcinogênese, uma interação inerentemente complexa de processos moleculares e celulares, é criticamente influenciada por interrupções na homeostase das espécies reativas de oxigênio (ROS). As EROs, que incluem oxidantes instáveis, como ânions superóxido, radicais hidroxila e peróxido de hidrogênio, são subprodutos do metabolismo celular normal e executam funções essenciais na sinalização, proliferação, diferenciação e apoptose². Um desequilíbrio nas concentrações de EROs pode precipitar o estresse oxidativo, potencialmente ativando as vias de morte celular programada, notadamente autofagia e apoptose, impedindo assim a proliferação e sobrevivência de células cancerígenas³. Consequentemente, as EROs exibem um papel duplo na oncologia, atuando como promotores e supressores da progressão tumoral. Na última década, as estratégias terapêuticas para NSCLC avançaram significativamente, com o desenvolvimento de novos agentes anticancerígenos projetados para explorar essa natureza dicotômica das ROS representando uma área de investigação particularmente vibrante⁴.

Numerosos agentes anticancerígenos sintetizados quimicamente, como adriamicina (doxorrubicina), cisplatina e ciclofosfamida, são conhecidos por induzir a apoptose em células cancerígenas, promovendo a produção de ROS⁵. Apesar dos avanços em terapias direcionadas e anticorpos imunoterapêuticos, a quimioterapia à base de platina continua a ser a pedra angular do tratamento para pacientes com NSCLC. No entanto, o surgimento de resistência e efeitos colaterais adversos da quimioterapia requer o desenvolvimento de novos medicamentos anti-NSCLC. Consequentemente, a exploração de fontes naturais de compostos anticancerígenos é cada vez mais reconhecida por sua importância e potencial. Pesquisas recentes destacaram que certos extratos de plantas e seus componentes ativos exibem propriedades anticancerígenas potentes, caracterizadas por baixa toxicidade, alta especificidade e capacidade de atingir várias vias⁶. Notavelmente, alguns desses compostos naturais podem modular os níveis de ROS e a sinalização⁷, induzindo autofagia ou apoptose em células cancerígenas e exercendo efeitos terapêuticos ^8,9.

Pileostegia tomentella Mão. Zucc, uma erva perene do gênero Clematis dentro da família Buttercupaceae, é encontrada predominantemente em regiões como Japão, Coréia do Norte e China. Os vários componentes da planta, incluindo raízes, caules, folhas e flores, são conhecidos por suas propriedades medicinais, oferecendo benefícios como eliminação de calor, desintoxicação, redução do inchaço, alívio da dor e efeitos antibacterianos e antiinflamatórios. Pesquisas recentes lançaram luz sobre as atividades anticancerígenas dos extratos ou ingredientes ativos da videira peluda Hoshi, demonstrando efeitos supressores de tumor em uma variedade de cânceres, incluindo glioma, mama, cólon e câncer cervical¹⁰. No entanto, os mecanismos anticancerígenos específicos de Pileostegia tomentella, particularmente seu papel potencial na modulação de ROS para induzir autofagia ou apoptose em células cancerígenas, permanecem amplamente inexplorados.

Apesar do interesse emergente em compostos naturais para a terapia do câncer, os mecanismos pró-apoptóticos dos principais constituintes de Pileostegia tomentella no câncer de pulmão permanecem inexplorados. Este estudo é pioneiro na identificação e dissecção mecanicista de umbeliferona e epi-Vogeloside como indutores seletivos de apoptose dependentes de ROS em NSCLC.

Protocolo

Os reagentes e equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Composição química da predição de alvos de Pileostegia tomentella e NSCLC

Os constituintes químicos de Pileostegia tomentella foram analisados por cromatografia líquida de alta eficiência combinada com espectrometria de massas linear de armadilha de íons-Orbitrap (HPLC-LTQ/MS). Os extratos foram dissolvidos em solventes apropriados e filtrados antes da injeção. A separação cromatográfica foi obtida usando uma coluna de fase reversa sob um programa de eluição de gradiente adaptado para as classes de compostos. Os dados de espectrometria de massa foram coletados no modo de ionização por eletrospray positivo em uma faixa de massa de 100-1500 m / z. As estruturas moleculares dos compostos identificados foram desenhadas usando um software genérico de desenho químico e salvas no formato SDF. Esses arquivos estruturais foram submetidos a uma ferramenta de previsão de alvos on-line para identificar potenciais alvos biológicos, com os 20 principais alvos selecionados para validação posterior. Os alvos associados ao NSCLC foram recuperados de um banco de dados de genes acessível ao público. Os alvos sobrepostos de ambos os conjuntos de dados foram identificados como potenciais alvos terapêuticos de Pileostegia tomentella.

2. Construção de rede componente-alvo

Os dados de interação proteína-proteína para alvos previstos foram obtidos de um banco de dados de interação proteica de acesso aberto. Os dados de interação foram importados para o software geral de visualização de rede para construir a rede de interação composto-alvo. As propriedades topológicas da rede, incluindo centralidade de grau, intermediação e proximidade, foram analisadas usando ferramentas analíticas integradas para identificar os principais nós regulatórios.

3. Análise de enriquecimento da via KEGG

O enriquecimento funcional das proteínas-alvo previstas foi realizado usando a análise da via KEGG por meio de ferramentas de enriquecimento disponíveis publicamente e software estatístico. Vias com valores de p ajustados menores que 0,05 foram consideradas significativas. Caminhos significativos foram integrados com dados composto-alvo para construir uma rede de interação "composto-alvo-caminho" usando software genérico de visualização de rede. A análise da topologia da rede destacou os principais centros regulatórios biológicos, ilustrando os mecanismos multicomponentes e multi-alvo de Pileostegia tomentella.

4. Extração de constituintes de Pileostegia tomentella

Caules secos de Corydalis spinosa foram moídos em um pó fino. O material em pó foi extraído com etanol a 70% sob tratamento ultrassônico à temperatura ambiente por um período definido. O extrato bruto foi filtrado e concentrado sob pressão reduzida. A partição líquido-líquido foi realizada usando solventes de polaridade crescente, incluindo éter de petróleo, acetato de etila e n-butanol. A fração acetato de etila, que apresentou a maior atividade biológica nos ensaios preliminares, foi coletada, concentrada, liofilizada e armazenada a -20 °C até uso posterior.

5. Linhagem celular e condições de tratamento

A linhagem celular de câncer de pulmão humano H1299 foi cultivada em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino a 37 °C em atmosfera umidificada contendo 5% de CO₂. As células foram semeadas em uma densidade apropriada e deixadas aderir durante a noite antes do tratamento. As células foram expostas a concentrações variadas (500 μg/mL, 750 μg/mL e 1.000 μg/mL) de dois compostos de teste, UMB e epi-Vogeloside, conforme listado na Tabela 1. Após 24 h de incubação em condições padrão de cultivo, as células foram colhidas para análises subsequentes para avaliar os efeitos biológicos dos compostos.

6. Ensaio MTT para viabilidade celular

Os efeitos citotóxicos dos compostos foram avaliados por meio de um ensaio colorimétrico de MTT. As células H1299 foram semeadas em placas de 96 poços em uma densidade definida e deixadas aderir durante a noite. As células foram então tratadas com os compostos de teste por 72 h em condições de cultura padrão. Após o tratamento, uma solução de MTT foi adicionada a cada poço e incubada para permitir que as células viáveis convertessem o MTT em cristais de formazan roxo insolúveis. Após a incubação, o meio foi removido e os cristais de formazan foram dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO). A absorbância foi medida a 570 nm usando um leitor de microplacas. Os valores de absorbância correspondem à viabilidade celular, fornecendo uma avaliação quantitativa da citotoxicidade do composto.

7. Avaliação da integridade da membrana via liberação de LDH

A integridade da membrana celular foi avaliada medindo a liberação de lactato desidrogenase (LDH) como um indicador de citotoxicidade. As células H1299 foram tratadas com os compostos de teste por 24 h, 48 h ou 72 h. Em cada momento, os sobrenadantes da cultura foram coletados e submetidos a um ensaio de atividade de LDH de acordo com o protocolo do fabricante. Como o LDH é liberado apenas de células com membranas danificadas, os valores de absorbância medidos refletem a extensão do dano à membrana induzido pelos compostos ao longo do tempo.

8. Análise por citometria de fluxo da apoptose

A indução de apoptose foi avaliada por citometria de fluxo usando a coloração de Anexina V e 7-Aminoactinomicina D (7-AAD). Após o tratamento com os compostos de teste, as células H1299 foram coletadas por centrifugação, lavadas com solução salina tamponada com fosfato frio e ressuspensas em tampão de ligação. As células foram então incubadas com Anexina V conjugada a um corante fluorescente e 7-AAD de acordo com o protocolo de coloração. As amostras foram imediatamente analisadas por citometria de fluxo. Este método permitiu a diferenciação entre células viáveis (não coradas), células apoptóticas precoces (Anexina V positiva, 7-AAD negativa) e células apoptóticas tardias ou necróticas (positivas para ambas as colorações).

9. Quantificação de ROS intracelular

Os níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS) intracelulares foram medidos usando um ensaio baseado em fluorescência. As células H1299 foram semeadas em placas de 12 poços a uma densidade de 1 × 10⁵ células por poço e cultivadas até atingir aproximadamente 80% de confluência. As células foram então tratadas com os compostos designados por 72 h. Após o tratamento, as células foram incubadas com 1 μM da sonda fluorescente sensível a ROS 2',7'-diclorodihidrofluoresceína diacetato (DCFH-DA) a 37 ° C por 30 min no escuro. Após a incubação, as células foram colhidas e a intensidade de fluorescência foi medida em um comprimento de onda de emissão de 525 nm usando um leitor de microplacas de fluorescência. A intensidade de fluorescência corresponde aos níveis de ROS intracelulares.

10. PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR)

As células H1299 foram semeadas em placas de 6 poços a uma densidade de 2 × 10⁵ células por poço e cultivadas até atingir aproximadamente 80% de confluência. As células foram então tratadas com os compostos designados por 72 h. O RNA total foi extraído usando um método fenol-clorofórmio amplamente utilizado. A síntese de DNA complementar (cDNA) foi realizada usando um kit de transcrição reversa de acordo com as instruções do fabricante. A PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR) foi realizada usando um sistema de PCR em tempo real com primers específicos (listados na Tabela 2). Os níveis de expressão gênica relativa foram calculados usando o método comparativo de Ct, com genes de housekeeping usados como controles internos.

11. Immunoblotting para expressão de proteínas

A análise de Western blot foi realizada em células H1299 cultivadas e tratadas. A proteína total foi extraída usando um tampão de lise apropriado e os lisados foram clarificados por centrifugação a 10.000 × g por 15 min a 4 °C. As concentrações de proteína foram determinadas usando um ensaio espectrofotométrico. Quantidades iguais de proteína de cada amostra foram separadas por SDS-PAGE e transferidas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF). As membranas foram bloqueadas com leite em pó desnatado a 5% por 2 h em temperatura ambiente e, em seguida, incubadas durante a noite a 4 ° C com anticorpos primários específicos para Bcl-2, caspase-3, PARP1, BAX, GAPDH e tubulina em diluições otimizadas. Após a lavagem, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários apropriados por 2 h à temperatura ambiente. As bandas de proteínas foram visualizadas e fotografadas usando um substrato quimioluminescente. A análise densitométrica foi realizada com software de análise de imagem, e as intensidades das bandas foram normalizadas para GAPDH e Tubulina como controles de carga.

12. Microscopia de imunofluorescência da Caspase-3

A expressão e a localização subcelular da caspase-3, uma proteína apoptótica chave, foram avaliadas por coloração por imunofluorescência. Após o tratamento, as células H1299 foram fixadas com paraformaldeído, permeabilizadas com uma solução de detergente neutro e incubadas com um anticorpo primário contra a caspase-3. Um anticorpo secundário marcado com fluorescência foi então aplicado para detectar o sinal do anticorpo primário. Os núcleos das células foram contracorados usando um corante fluorescente de ligação ao DNA. As células coradas foram visualizadas em microscópio de fluorescência. A intensidade e a distribuição celular do sinal de fluorescência forneceram informações qualitativas e espaciais sobre a ativação da caspase-3, apoiando seu envolvimento na resposta apoptótica induzida pelo composto.

13. Sequenciamento transcriptômico

Para traçar o perfil da resposta transcricional celular aos compostos de teste, o RNA total foi extraído das células H1299 tratadas e avaliado quanto à integridade usando métodos padrão de controle de qualidade. As bibliotecas de sequenciamento foram preparadas seguindo protocolos estabelecidos e submetidas a sequenciamento de alto rendimento usando uma plataforma de sequenciamento de última geração. Os dados brutos de sequenciamento foram processados por meio de um pipeline de bioinformática convencional, que incluiu filtragem de controle de qualidade, alinhamento com o genoma de referência e quantificação da abundância de transcritos. A análise diferencial da expressão gênica foi realizada para identificar genes com alterações estatisticamente significativas na expressão após o tratamento. Análises de enriquecimento e vias dos genes diferencialmente expressos foram realizadas para elucidar os principais processos biológicos afetados pelos compostos, fornecendo assim uma visão geral transcriptômica abrangente de seus efeitos moleculares.

14. Análise estatística

Todos os dados são expressos como a média ± desvio padrão (DP) de pelo menos três experimentos independentes. A significância estatística entre os grupos foi determinada usando métodos padrão, incluindo teste t de Student ou ANOVA de uma via, quando apropriado. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas para valores de P menores que 0,05.

Resultados

Rastreio dos principais componentes da Pileostegia tomentella contra o cancro do pulmão
Uma visão geral do desenho experimental é apresentada na Figura 1. HPLC-LTQ/Orbitrap MS foi empregado para caracterizar sete principais constituintes bioativos presentes em Pileostegia tomentella (Tabela 3). Posteriormente, uma previsão de alvo in silico foi conduzida nesses compostos usando o banco de dados SwissTarg...

Discussão

O câncer de pulmão de células não pequenas (CPCNP) continua sendo uma preocupação urgente de saúde global, caracterizada por sua biologia agressiva, rápida progressão clínica e alto potencial metastático, frequentemente resultando em resultados ruins para os pacientes¹². Embora as intervenções padrão, como ressecção cirúrgica, radioterapia e quimioterapia, ofereçam benefício terapêutico na doença em estágio inicial, sua eficácia diminui em estágios avançados devid...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anexo V– Kit de detecção de apoptose PE / 7-AAD	BD Biociências	556547	Detecção de apoptose baseada em citometria de fluxo
Anticorpo: BAX	Abcam	AB32503	Western blot para proteína pró-apoptótica
Anticorpo: Bcl-2	Abcam	ab182858	Western blot/imunofluorescência
Anticorpo: Caspase-3 clivada	Abcam	AB32042	Western blot / IF
Anticorpo: GAPDH	Abcam	AB8245	Controle interno em Western blot
Anticorpo: PARP1	Abcam	AB32064	Western blot para marcador de apoptose
Anticorpo: Tubulina	Abcam	AB78078	Controle interno em Western blot
ChemDraw	Informática PerkinElmer	CCG821391	Desenho da estrutura de pequenas moléculas
Sistema de imagem por quimioluminescência	Tanon Ciência & Tecnologia	Tanon 5200	Para visualizar bandas de proteínas
Cytoscape	Cytoscape.org	https://cytoscape.org	Construção e análise de redes
Mancha Nuclear DAPI	Sigma	D9542	Contracoloração nuclear azul para IF
DAVI	NIH	https://david.ncifcrf.gov	Anotação funcional e enriquecimento da via KEGG
DMSO	Sigma	MFCD00002089	Usado para dissolver cristais de formazan
Etanol (para extração)	Sigma	MFCD00003568	Solvente de extração assistida por ultrassom
Acetato de etila	Sigma	MFCD00009171	Usado para fracionamento bioativo
Anticorpo secundário conjugado com FITC	Abcam	AB6785	Usado em imunofluorescência
Citômetro de fluxo	Thermo Científico	A29001	Usado para detecção de apoptose e ROS
Microscópio de fluorescência	Corporação Olympus	BX53F	Para imagem em lâminas de imunofluorescência
Liofilizador	Corporação Labconco	7670520	Para liofilização e preservação de amostras
Cartões GeneCards	Instituto Weizmann	https://www.genecards.org	Banco de dados de genes para relevância da doença
HPLC-LTQ-Orbitrap Espectrometria de Massa	Thermo Científico	IQLAAEGAAVFACZMAIK	Identificação de compostos por MS
Plataforma de sequenciamento Illumina NovaSeq	Illumina Inc.	20012850	Usado para RNA-seq
Kit de ensaio de citotoxicidade LDH	Beyotime	C0016	Para medir a liberação de LDH como indicador de citotoxicidade
Leitor de microplacas	Thermo Científico	VL0000D0	Para medições de absorbância em ensaios de MTT e LDH
Kit de ensaio de viabilidade celular MTT	Beyotime	C0009S	Usado para ensaio de MTT para avaliar a viabilidade celular
Máquina de qPCR	Thermo Científico	4485701	Para análise de expressão gênica
Software R	Fundação R	https://www.r-project.org	Computação estatística e plotagem de caminhos
Kit de transcrição reversa (RT Kit)	Vazyme	MR201	Para síntese de cDNA
Kit de preparação para biblioteca RNA-seq	Illumina Inc.	20020594	Preparação da biblioteca para sequenciamento
Previsão do SwissTarget	Instituto Suíço	http://www.swisstargetprediction.ch	Ferramenta de previsão de alvos compostos
Mistura de qPCR verde SYBR	Vazyme	Q311-02	Para PCR quantitativo
Reagente de TRIzol (extração de RNA)	Sigma	T3934	Para extração total de RNA
Limpador ultrassônico	Branson	M1800-CPXH	Para extração assistida por ultrassom
Aparelho de Western Blot	Thermo Científico	Rolamento A56727	Eletroforese em gel e transferência de proteínas