Estudo experimental sobre Muscone reduzindo a atividade da via NF-κB visando IL-1R1 para atenuar a lesão por estresse oxidativo em células de Schwann

Resumo

Este artigo estuda o efeito do muscone, o principal componente do almíscar, na proliferação e apoptose das células de Schwann. Os resultados ilustram preliminarmente o mecanismo potencial do almíscar reduzindo a atividade da via NF-κB inibindo a IL-1R1 para atenuar a lesão por estresse oxidativo na paralisia de Bell.

Resumo

O mecanismo subjacente de como o almíscar natural trata a paralisia de Bell não é claro. Este estudo tem como objetivo revelar o potencial mecanismo do almíscar no tratamento da lesão de nervos periféricos in vitro. Para isso, foi estabelecido um modelo de lesão por estresse oxidativo em células de Schwann (SCs) utilizando cloreto de cobalto (CoCl₂). Para avaliar os efeitos protetores do Muscone (Mus) sobre essa lesão e explorar seu mecanismo, foram empregados ensaios de viabilidade celular, transfecção de siRNA, ensaios de imunoadsorção enzimática (ELISA), reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR), western blotting, coloração por imunofluorescência e análise ultraestrutural de células. Como resultado, é indicado que a intervenção com Mus aumentou a proliferação de SC e o mRNA de S-100b sob hipóxia, ao mesmo tempo em que reduziu as espécies reativas de oxigênio (ROS) e elevou os níveis de superóxido dismutase (SOD). Mus melhorou o estresse oxidativo e a inflamação em SCs hipóxicos, reduzindo IL-1β e TNF-α. Além disso, Mus modulou indicadores-chave envolvidos no metabolismo do oxigênio, reparo celular e neurometabolismo, incluindo C-JUN e GDNF. A IL-1R1, localizada na membrana SC, foi regulada positivamente pela hipóxia, mas significativamente regulada negativamente após a intervenção de Mus. Mus também inibiu a expressão dos componentes da via NF-κB (IRAK1, IKK, p65, p50) e aumentou o IκB-α. Criticamente, a abolição da expressão de IL-1R1 via knockdown de siRNA mostrou um efeito consistente com Mus. Conclui-se que, ao suprimir a IL-1R1, Mus atenuou a inflamação em SCs hipóxicas por meio da inibição da via NF-κB. Este estudo indicou o papel da IL-1R1 na disfunção SC induzida por hipóxia. Além disso, Mus pode ser um medicamento potencialmente eficaz para o tratamento da paralisia de Bell.

Introdução

Muscone (Mus), 3-metilciclopentadecanona, foi isolado do extrato natural de almíscar de veado já em 1906¹. O almíscar, uma medicina tradicional chinesa (MTC) valiosa e eficaz, tem extensos efeitos curativos, como detumescência, anti-inflamação, ressuscitação e promoção da circulação sanguínea². A MTC contendo almíscar tem sido utilizada para uma variedade de doenças comuns, incluindo doença do sistema nervoso central³, desintoxicação⁴, tumores gastrointestinais⁵, hepatite viral⁶ e doença cardíaca coronária⁷, etc. Como ingrediente farmacêutico ativo do Musk, Mus mostrou excelentes efeitos biológicos envolvendo anti-inflamação⁸, anti-oxidação ^8,9, reparo de danos neuronais e alívio do infarto do miocárdio¹⁰, etc. Mecanicamente, estudos demonstraram que Mus pode reduzir a liberação de citocinas inflamatórias, como Interleucina (IL)-1β, IL-6, fator de necrose tumoral (TNF)-α, espécies reativas de oxigênio (ROS)^1,8 e regular a proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK), fator nuclear kappa-intensificador de cadeia leve de células B ativadas (NF-κB), AKT/alvo mecanicista da rapamicina (mTOR) e CaN/Erk1/2 via^{1, 8,11}, etc.

Na China, foi relatado que alguns médicos trataram com sucesso a paralisia de Bell com almíscar natural, de acordo com registros anteriores da literatura e experiência clínica 12,13,14,15. Mus não é um medicamento recomendado nas diretrizes de diagnóstico e tratamento, mas em áreas médicas subdesenvolvidas ou para algumas pessoas que não podem usar esteróides ou medicamentos antivirais, Mus pode ser outra opção preferida. A análise da literatura nos últimos anos também mostra que o almíscar é a medicina chinesa mais frequentemente usada nas prescrições de adesivos de medicina chinesa publicadas e nos estudos de pontos de acupuntura para o tratamento da paralisia facial periférica¹⁶. Embora existam muitos estudos farmacológicos e médicos sobre Mus, como o almíscar curou exatamente a paralisia de Bell e quais são os mecanismos neuroquímicos e biológicos celulares subjacentes ainda é desconhecido.

A paralisia de Bell, uma paralisia facial idiopática aguda, resulta da disfunção do nervo facial periférico, que inerva todos os músculos faciais. O sinal mais perceptível dos sintomas de paralisia de Bell é a fraqueza e queda dos músculos faciais de um lado. Embora a paralisia facial de Bell não seja fatal, ela pode afetar a qualidade de vida do paciente e até causar ansiedade e depressão. O que é particularmente preocupante é que até 30% dos pacientes sofrem sequelas a longo prazo, incluindo sincinesia, contratura, paresia facial permanente e assimetria facial, mesmo com tratamento adequado. Portanto, encontrar a resolução da paralisia de Bell e diminuir o risco de paralisia são nossos principais objetivos. O conhecimento atual sobre o mecanismo patogênico da paralisia de Bell permanece obscuro. Pesquisas recentes demonstraram que a reativação de vírus pode ser a principal causa da paralisia de Bell, e esses vírus podem causar um edema neuronal e inflamação para desencadear o ataque da paralisia de Bell.

Com base em evidências recentes, levantamos a hipótese de que Mus alivia os sintomas da paralisia de Bell, melhorando os danos do estresse oxidativo no nervo facial. Este estudo indicou experimentalmente os efeitos terapêuticos de Mus, revelando que a IL-1R1 regulada positivamente em SCs ativa a via NF-κB, causando dano celular. Crucialmente, demonstramos que Mus inibe a sinalização NF-κB regulando negativamente IL-1R1. Nossos resultados identificaram o papel da regulação positiva de IL-1R1 em SCs expostos ao estresse oxidativo in vitro e posicionaram a administração de Mus como uma nova estratégia terapêutica.

Protocolo

Esta pesquisa experimental foi conduzida com a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (Número de Aprovação: LL-240077).

Cultura celular e intervenção medicamentosa
As células de Schwann de rato (SCs) foram cultivadas em meio celular de Schwann, consistindo de meio basal, 5% de soro fetal bovino, 1% de suplemento de crescimento de células de Schwann, 1% de penicilina e 1% de estreptomicina. Todas as células foram mantidas em atmosfera de CO₂ a 5% a 37 °C. Quando permitido crescer até uma densidade de 70-80%, os SCs foram divididos em quatro grupos (n = 5 por grupo): (1) grupo NC; (2) grupo NC+CoCl₂ ; (3) grupo NC+CoCl₂+Mus; (4) Grupo NC+CoCl₂+siIL-1R1+Mus.

O cloreto de cobalto (CoCl₂), um agente frequentemente empregado para mimetizar a hipóxia, é conhecido por desencadear respostas semelhantes às da hipóxia, como impedir a degradação e estabilização de fatores induzíveis por hipóxia e o acúmulo da proteína HIF-1α¹⁵. De acordo com o método modificado baseado em Osuru et ^al.17, no grupo NC+CoCl₂ e no grupo NC+CoCl₂+Mus, as SCs foram cultivadas em meio celular de Schwann suplementado com 240 μM de CoCl₂ por 8 h, em condições atmosféricas de 95% de ar e 5% de CO₂ a 37 °C em uma incubadora umidificada (21% O₂). Em seguida, nos grupos Mus, foi aplicada a intervenção de 1,25 μg/mL de Mus por mais 24 h. Enquanto isso, no grupo NC+CoCl₂+siIL-1R1+Mus, os SCs foram tratados primeiro com 24 h de infecção por siRNA, depois cultivados continuamente com 240 μM de CoCl₂ por 8 h, seguido pela intervenção de 1,25 μg/mL de Mus por mais 24 h, como nos primeiros grupos. O fluxograma do processo experimental é mostrado na Figura 1.

Ensaio de viabilidade celular
A viabilidade das SCs foi determinada usando o reagente de ensaio kit de contagem de células-8 (CCK-8) de acordo com as instruções do fabricante. As SCs cultivadas a uma densidade de 5 × 10⁵ células/poço foram semeadas em uma placa de cultura de células de 96 poços com 100 μL de meio de crescimento completo a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO₂ . Quando a confluência atingiu 70-80%, 10 μL de solução de CCK-8 foram adicionados a cada poço, e as placas foram incubadas por 1 h a 37 °C. A densidade óptica (DO) das placas de 96 poços foi medida a 450 nm usando um leitor de microplacas, e a viabilidade celular foi calculada. As células foram divididas em quatro grupos: grupo NC, grupo NC+CoCl₂ , grupo NC+CoCl₂+Mus e grupo NC+CoCl₂+siIL-1R1+Mus. Os resultados experimentais foram corrigidos usando um poço em branco (meio + solução CCK8). Taxa de sobrevivência celular = [(grupo experimental - poço em branco)/(grupo NC - poço em branco)] × 100%.

transfecção de siRNA
A transfecção foi conduzida de acordo com as instruções do fabricante de um reagente comercial de transfecção in vitro de siRNA/miRNA usando duplexes sintéticos de siRNA de siIL-1R1 (AUAGUCUUGGAUUUUCUCCAA, GGAGAAAAUCCAAGACUAUGA) com uma concentração de 100 ng/μL por 24 h. Após a transfecção de siIL-1R1, as expressões de siIL-1R1 foram avaliadas por meio da realização de análise de RT-qPCR após 24 h de transfecção¹⁸, e a eficiência deve ser garantida para ser superior a 80%

Ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA)
Os sobrenadantes pós-cultura foram coletados e centrifugados em condições específicas do grupo (2950 g, 20 min, 25 °C). Os níveis extracelulares de IL-1β, TNF-α, ROS e SOD foram testados via ELISA seguindo as instruções do kit. As leituras finais de absorbância a 450 nm foram obtidas usando um leitor de microplacas.

Isolamento de RNA e PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR)
Seguindo as instruções do fabricante, o RNA total foi extraído das células cultivadas usando o reagente TRizol. Os genes-alvo (IL-1β, TNF-α, S-100b, IL-1R1) foram amplificados em 20 μL de reações mistas de SYBR qPCR por 40 ciclos em um instrumento de PCR. A normalização dos dados utilizou β-actina, com especificidade de PCR verificada por análise de curva de fusão. O método 2^−ΔΔCt quantificou a expressão relativa de cinco amostras independentes analisadas em triplicata. Os primers estão listados na Tabela 1.

Western blot
Após o tratamento, as CCs de todos os grupos experimentais foram incubadas por 24 h e colhidas. A proteína total foi extraída usando um kit de extração de proteína total. Os lisados de proteínas foram combinados com tampão de carga de eletroforese em gel de poliacrilamida dodecil-sulfato de sódio (SDS-PAGE) desnaturado a 98 ° C por 5 min e separado (20 μg por pista) em géis de poliacrilamida SDS a 10-12%. As proteínas resolvidas foram transferidas eletroforeticamente para membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF). As membranas foram bloqueadas com leite em pó desnatado a 5% por 60 min em temperatura ambiente e, em seguida, incubadas durante a noite a 4 °C em um volume de 6 mL com os seguintes anticorpos primários: anticorpo anti-HIF-1α (1:1000), anticorpo anti-GAPDH (1:1000), anticorpo anti-IL-1R1 (1:1000), anticorpo anti-C-JUN (1:1000), anticorpo anti-GDNF (1:1000), anticorpo anti-IRAK1 (1:1000), anticorpo anti-IKK (1:1000), anticorpo anti-p65 (1:800), anticorpo anti-p50 (1:900), anticorpo anti-IκB-α (1:900) e anticorpo anti-β-actina (1:1000). Após a lavagem, as membranas foram sondadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano (HRP) por 60 min a 25 °C. Os sinais de proteína foram detectados usando o Image Studio Digits Ver 4.0. As intensidades das bandas foram quantificadas com o software ImageJ e normalizadas para a expressão de β-actina e GAPDH. Foram realizados três experimentos independentes.

Imunofluorescência
A localização de IL-1R1 em SCs foi avaliada seguindo Zhao et ^al.19. Colha as células durante a fase de crescimento logarítmico por tripsinização, ressuspenda-as em meio fresco e completo e triture completamente para obter uma suspensão unicelular uniforme. Semeie as células em placas de cultura contendo lamínulas estéreis. Assim que as células atingirem a confluência total, enxágue-as 1-2 vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS), remova cuidadosamente as lamínulas e fixe as células aderentes com paraformaldeído a 4% em PBS por 10 min, permeabilize com Triton X-100 a 0,05% (10 min) e bloqueie com soro de cabra a 5% (1 h). A incubação primária utilizou mAb de IL-1R1 anti-rato de coelho. Após as lavagens com PBS, as amostras foram incubadas com IgG anti-coelho de cabra conjugada com FITC por 2 h à temperatura ambiente. Adicione agentes de montagem solúveis em água à lamínula para montagem. As células imunomarcadas foram visualizadas e quantificadas usando um microscópio de fluorescência com o comprimento de onda de excitação de 492 nm e o comprimento de onda de emissão de 520 nm.

Análise de ultraestrutura
Seguindo o protocolo de Zhao et al.¹⁹, as SCs foram fixadas em glutaraldeído a 2,5% e pós-fixadas durante a noite a 4°C em tetróxido de ósmio a 1%. As amostras foram submetidas a uma série de desidratação com etanol/acetona. Cortes ultrafinos (80 nm) foram corados com acetato de uranila e citrato de chumbo antes do exame ultraestrutural usando um microscópio eletrônico de transmissão.

Eliminação de reagentes químicos perigosos
O meio e as soluções contendo CoCl₂ são coletados em um recipiente designado para resíduos de metais pesados. Todos os materiais descartáveis que entraram em contato com os líquidos acima mencionados, incluindo pontas de pipeta, tubos de centrífuga e luvas, são classificados como resíduos perigosos de metais pesados e são transferidos para uma empresa licenciada de gerenciamento de resíduos perigosos aprovada pelas autoridades competentes para descarte adequado. Descarte a solução de paraformaldeído residual em um recipiente de resíduos de aldeído dedicado. Os consumíveis usados devem ser coletados como resíduos de aldeído e processados pela mesma empresa licenciada de gerenciamento de resíduos perigosos.

Análise estatística
As comparações multigrupos foram analisadas por ANOVA one-way com teste post-hoc de Tukey no GraphPad Prism 8.0. A significância estatística foi definida como P < 0,05. Os dados são apresentados como média ±± desvio padrão (DP).

Resultados

Efeitos protetores do Mus na lesão por estresse oxidativo de células de Schwann in vitro
A expressão de HIF-1α exibiu alterações em resposta a variações nas circunstâncias hipóxicas²⁰. Para modelar a hipóxia, os SCs foram expostos ao CoCl₂, que induziu com sucesso a hipóxia, confirmada por níveis elevados de proteína HIF-1α, um marcador de hipóxia canônica, via western blotting (Figura 2A). A intervenção subsequ...

Discussão

A paralisia de Bell é uma paralisia idiopática do nervo facial periférico caracterizada por fraqueza facial unilateral. A bainha de mielina desempenha várias funções cruciais no funcionamento efetivo dos neurônios²³. Garante a condução suave dos impulsos nervosos, apoia os neurônios fornecendo fatores nutritivos e auxilia no processo de regeneração²⁴ . Assim, a perda de mielina no sistema nervoso periférico pode resultar em neuropatias desm...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução de digestão de tripsina a 0,25% (sem EDTA)	Biografia do serviço	G4002
10x TBS	Eubiotech	BF0153
10-180 KDPmarcador de proteína de cor remarcada	Eubiotech	Pág. 0069
5% de leite em pó desnatado	Beyotime Biotecnologia, China	Pág. P0216-300GR
anticorpo anti-C-JUN	Sinalização Celular, EUA	#9165T
anticorpo anti-GAPDH	abcam, Reino Unido	AB245355
anticorpo anti-GDNF	Sinalização Celular, EUA	#47808
anti-HIF-1 e alfa; anticorpo	Sinalização Celular, EUA	#14179
anticorpo anti-IKK	Sinalização Celular, EUA	#2682
anticorpo anti-IL-1R1	Sinalização Celular, EUA	#6775	para WB
anticorpo anti-IL-1R1	ProteinTech	84094-6-RR	para imunofluorescência
anticorpo anti-IRAK1	Sinalização Celular, EUA	#4395
anti-Iκ B-&alfa; anticorpo	Sinalização Celular, EUA	#8943
anticorpo anti-p50	abcam, Reino Unido	AB305263
anticorpo anti-p65	abcam, Reino Unido	AB16502
IL-1R1 mAb anti-rato;	Beyotime Biotecnologia, China	AF7212
anticorpo anti-β-actina	abcam	AB179467
Kit de quantificação de proteínas BCA	Eubiotech	WB2123
Kit de contagem de células-8 (CCK-8) reagente de ensaio	Beyotime Biotecnologia, China	C0048M
Cloreto de cobalto (CoCl2)	Macklin, China	C804815
EuECL Star	Eubiotech	WB2131
Soro fetal bovino (FBS)	Bergolin, China	PWL001
IgG anti-coelho de cabra com etiqueta Fitc	Biografia do serviço	GB22303
Microscópio de fluorescência	Nikon
Hieff Trans in vitro reagente de transfecção de siRNA/miRNA	YEASEN, China	Rolamento 40806ES01
Anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano (HRP) IgG anti-camundongo de cabra marcada com Hrp	Servicebio, China	GB23301
Kit ELISA IL-1β, TNF-&alfa;, ROS e SOD	BOSTER, China	BES1762K, BES0481K, BES5018K, BES2920K
Muscone (Mus)	Aladdin, China	M141496
Amortecedor PBS	Biografia do serviço	G4202
Solução de Penicilina-Estreptomicina, 100x	Procell	PB180120
Membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF)	Millipore, Estados Unidos	IPFL00010
Células de Schwann de rato (SCs)	Procell Ciências da Vida & Tecnologia China	CM-M111
Tampão de lise RIPA	Eubiotech	WB2116
Meio de Célula de Schwann	ScienCell, EUA	1701
Buffer de carregamento SDS-PAGE	Beyotime Biotecnologia, China	Pág. 0015
Tampão de carregamento de proteína l SDS-PAGE, 5x	Eubiotech	WB2122
si-IL-1R1	Gene Universal	RX0114371
Kit de preparação de geleletroforese de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE)	Eubiotech	WB2118
Mistura de SYBR qPCR	Beyotime Biotecnologia, China	D7260
Kit de extração de proteína total	Beyotime Biotecnologia, China	Pág. 123-01
Microscópio eletrônico de transmissão	Hitachi	HT7800
Trizol	Beyotime Biotecnologia, China	R0011
Interpolação-20	Eubiotech	WB2114
Agentes de montagem solúveis em água	Absinto, China	ABS9240
Buffer de transferência ocidental	Eubiotech	WB2129