Visualizando o Gatekeeper: Avaliação Baseada em Corante Azul de Evan da Permeabilidade da Barreira Hematoencefálica em Peixe-Zebra Adulto

Resumo

Este protocolo apresenta um método confiável para avaliar a integridade da barreira hematoencefálica (BHE) em modelo de peixe-zebra adulto (Danio rerio) usando a avaliação baseada em corante azul de Evan, permitindo a análise qualitativa e quantitativa da desregulação neurovascular.

Resumo

A barreira hematoencefálica (BBB) é uma interface semipermeável que mantém a homeostase do sistema nervoso central (SNC) regulando o movimento de substâncias para dentro e para fora do cérebro, protegendo assim o tecido neural de agentes potencialmente nocivos. A interrupção da BHE é uma característica bem estabelecida em muitas doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Parkinson (DP) e a doença de Alzheimer (DA), onde o aumento da permeabilidade contribui e exacerba a progressão da doença. Embora o peixe-zebra adulto (Danio rerio) seja cada vez mais reconhecido como um modelo valioso para o estudo de doenças neurodegenerativas, os métodos padronizados para avaliar a integridade da BHE nesta espécie permanecem limitados. Este protocolo descreve uma abordagem simples, reprodutível e econômica para avaliar a permeabilidade da BHE em peixes-zebra adultos, analisando o extravasamento do corante Azul de Evan (EB) da neurovasculatura para o tecido cerebral. O método combina visualização qualitativa com análise quantitativa de imagem da distribuição de EB para detectar a interrupção da BBB. As principais etapas incluem injeção intraperitoneal adequada de corante EB, confirmação da circulação sistêmica do corante, dissecção cerebral cuidadosa e imagem consistente e medição da intensidade em escala de cinza. Controles positivos e negativos são incorporados para validar a penetração do corante e apoiar a interpretação precisa. Resultados representativos demonstram maior extravasamento de EB em cérebros de peixe-zebra parkinsonianos em comparação com controles injetados com solução salina, indicando aumento da permeabilidade à BHE. Esta técnica requer equipamento especializado mínimo e é adequada para laboratórios com recursos limitados. No geral, este protocolo oferece uma ferramenta prática para investigar a integridade da BHE em modelos adultos de peixe-zebra e pode ser adaptado para diversas aplicações, incluindo estudos de mecanismos de doenças e avaliação de intervenções terapêuticas direcionadas à função neurovascular.

Introdução

A Barreira Hematoencefálica (BHE) é uma interface fisiológica seletiva e semipermeável formada principalmente por células endoteliais cerebrais especializadas, suportadas por pericitos e astrócitos, que regula a troca molecular entre a corrente sanguínea e o espaço intersticial do cérebro para preservar o microambiente do Sistema Nervoso Central (SNC). Sua integridade é essencial para preservar a homeostase do SNC e proteger o tecido neural de substâncias nocivas ou tóxicas¹. A interrupção da BHE é uma característica patológica bem reconhecida em várias doenças neurodegenerativas, incluindo doença de Parkinson (DP), doença de Alzheimer e esclerose lateral amiotrófica ^2,3. O comprometimento da função da BHE leva ao aumento da permeabilidade, permitindo que compostos neurotóxicos e mediadores inflamatórios se infiltrem no tecido cerebral, exacerbando assim a progressão da doença⁴. Como tal, avaliar a integridade da BHE é fundamental para obter insights mais profundos sobre os mecanismos neurovasculares e inflamatórios subjacentes a esses distúrbios.

Embora os modelos in vivo de roedores e in vitro continuem sendo os padrões ouro para a pesquisa de BBB⁵, o peixe-zebra (Danio rerio) emergiu como um modelo valioso de vertebrados na neurociência devido à sua tratabilidade genética, custo-benefício, facilidade de manuseio e características neuroanatômicas e BBB conservadas com mamíferos⁶. Apesar de seu uso crescente em estudos neurodegenerativos, os métodos para avaliar a integridade da BHE em peixes-zebra adultos ainda são limitados ^7,8. Técnicas como injeções de traçadores fluorescentes ou repórteres transgênicos têm sido amplamente utilizadas em larvas ^9,10, mas representam desafios significativos em adultos devido à pigmentação e diminuição da transparência. Portanto, o objetivo do presente estudo é estabelecer um protocolo simples, reprodutível e visualmente demonstrável para avaliar a permeabilidade da BHE em peixes-zebra adultos usando o extravasamento do corante Azul de Evan (EB). Este método incorpora observação qualitativa e medição quantitativa do vazamento de corante no tecido cerebral, fornecendo uma ferramenta prática para avaliar a integridade neurovascular em condições patológicas.

O corante azul de Evan, que se liga à albumina sérica e normalmente não consegue atravessar a BBB¹¹ intacta, oferece uma alternativa viável para avaliar a ruptura da barreira¹². O extravasamento de EB tem sido amplamente aplicado em modelos de roedores para detectar vazamento de BBB em condições como lesão cerebral traumática, acidente vascular cerebral e neuroinflamação¹³. No entanto, sua aplicação em peixes-zebra adultos permaneceu amplamente inexplorada. Este estudo apresenta uma nova adaptação da técnica de corante EB otimizada para peixe-zebra adulto, permitindo uma avaliação qualitativa e quantitativa confiável da permeabilidade do BBB. O método é econômico, requer equipamento especializado mínimo e pode ser facilmente dimensionado para vários animais, oferecendo uma vantagem prática sobre abordagens baseadas em imagens mais complexas normalmente usadas em larvas.

Usando este protocolo, avaliamos a integridade da BBB em peixes-zebra adultos saudáveis e parkinsonianos. Para induzir parkinsonismo em peixe-zebra, a neurotoxina 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) foi administrada por via intraperitoneal, seguindo um método previamente descrito¹⁴. Os resultados revelaram um extravasamento EB significativamente maior no cérebro do peixe-zebra parkinsoniano, consistente com a interrupção bem documentada da BBB observada na DP. Esses achados validam a sensibilidade e a confiabilidade do método, apoiando sua utilidade em vincular a patologia vascular aos resultados moleculares e comportamentais. Esta técnica representa, portanto, uma ferramenta valiosa para pesquisadores que investigam contribuições neurovasculares para doenças neurodegenerativas e pode ser aplicada em modelos genéticos e induzidos por toxinas-zebra.

Protocolo

Este protocolo foi seguido e permitido pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade Islâmica Internacional da Malásia (IIUM), com referência à aprovação da ética animal (ref. nº: IIUM/504/14/2/IACUC).

1. Prepare a solução de estoque de corante azul Evans

1. Dissolva 0,1 g de corante EB em 10 mL de solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) para preparar uma solução estoque a 1% (p / v). Misture bem até que o corante esteja completamente dissolvido.
   CUIDADO: EB é categorizado como cancerígeno Categoria 1B. Evite o contato direto com a pele e os olhos. Use roupas de proteção, luvas, óculos de segurança e um respirador de poeira. Evite inalar poeira e siga as instruções de manuseio do fabricante. Não descarte o corante Evans Blue (sólido ou solução) na pia. Guarde os resíduos em recipientes originais rotulados. Descarte de acordo com os regulamentos nacionais e locais de resíduos perigosos.
2. Filtrar a solução com um filtro de seringa de 0,45 μm. Recolher o filtrado para um tubo de centrifugação estéril de 15 ml. Envolva o tubo em papel alumínio e guarde a 4 °C.
   NOTA: Um filtro de tamanho de poro menor (por exemplo, 0.2 μm) também pode ser usado. A solução estoque pode ser armazenada a 4 °C por até duas semanas, ou a -20 °C por até um mês, com alíquotas recomendadas para minimizar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento quando armazenadas congeladas.

2. Administre o corante Evans Blue ao peixe-zebra adulto

1. Anaestesie o peixe-zebra por meio de choque hipotérmico, baixando gradualmente a temperatura da água de 12 °C para 7 °C, até que o peixe não responda mais aos estímulos táteis.
   NOTA: A redução gradual da temperatura pode ser alcançada adicionando pequenas quantidades de gelo picado à água lentamente ao longo de vários minutos, permitindo que a temperatura diminua progressivamente. A imersão em tricaína também é um método anestésico alternativo adequado.
2. Injete 20 μL de corante EB a 1% na cavidade intraperitoneal (IP) usando uma seringa de insulina 31 G. Aplique uma leve pressão no local da injeção por 10 s para evitar o refluxo.
   NOTA: A cavidade intraperitoneal do peixe-zebra está localizada posteriormente à cintura pélvica. Para aumentar a taxa de sucesso da administração de EB, jejue o peixe por 24 horas antes da injeção. Isso esvaziará a cavidade abdominal para fornecer melhor acesso e precisão ao espaço intraperitoneal.
3. Transfira o peixe para um tanque de recuperação e deixe recuperar por 30 min. Monitore lesões, mortalidade ou alterações comportamentais.
   NOTA: Para ajudar o peixe-zebra na recuperação, use uma temperatura da água ligeiramente reduzida (20-24 °C) para o tanque de recuperação para fornecer um efeito anestésico leve e ajudar a anestesiar o potencial desconforto pós-injeção. Os peixes injetados exibirão uma tonalidade azul, indicando uma circulação bem-sucedida do corante (Figura 1).
4. Após 30 min, eutanasiar os peixes por meio de choque hipotérmico a 1 °C a 3 °C. Em seguida, decapite o peixe usando uma lâmina estéril ou uma tesoura cirúrgica.
   NOTA: Para ajudar na dissecção do cérebro mais tarde, deixe carne extra atrás da cabeça ao decapitar.
5. Enxágue a cabeça duas vezes em 1x PBS (proporção de 1:20 peixe para PBS) para remover o excesso de sangue e corante EB.
   NOTA: A lavagem insuficiente pode levar a resultados falso-positivos e comprometer a precisão da análise. Para evitar isso, lave bem o tecido cerebral pelo menos duas vezes com 1x PBS, garantindo que todo o sangue visível e corante de fluxo livre sejam removidos. Se algum corante residual permanecer, uma terceira lavagem é fortemente recomendada.
6. Fixe a cabeça em paraformaldeído (PFA) a 4% a 4 ° C durante a noite (proporção de 1:20 peixe para fixador). A agitação não é necessária durante a fixação, pois o pequeno tamanho da cabeça do peixe-zebra e o volume de fixação suficiente permitem uma penetração eficaz em condições estáticas.
   CUIDADO: O PFA é prejudicial se ingerido, inalado ou em contato com a pele. Preparar a solução de PFA sob uma hotte. Use equipamento de proteção individual adequado e evite a inalação de poeira. Siga todas as diretrizes de segurança de acordo com o fabricante. Trate o PFA como resíduo perigoso. Evite descartá-lo no ralo. Colete e rotule os resíduos em recipientes lacrados e descarte-os de acordo com os regulamentos locais e nacionais.
7. Dissecar o cérebro do peixe-zebra
   1. Coloque a cabeça fixa em uma placa de Petri limpa e disseque o cérebro conforme descrito anteriormente¹⁵, usando uma pinça de ponta pontiaguda. Adicione continuamente 1x PBS gota a gota durante a dissecção para manter o tecido hidratado e evitar o ressecamento.
   2. Prepare a placa de agarose dissolvendo 1 g de agarose em 100 mL de água destilada. Leve ao micro-ondas até derreter completamente, despeje em uma placa de Petri e deixe solidificar.
   3. Enxágue o cérebro dissecado duas vezes em dois banhos separados de 1x PBS. Em seguida, coloque o tecido em uma placa de agarose a 1% para reter a umidade e evitar o encolhimento.
      NOTA: A lavagem insuficiente pode levar a resultados falso-positivos e comprometer a precisão da análise. Para evitar isso, lave bem o tecido cerebral pelo menos duas vezes com 1× PBS, garantindo que todo o sangue visível e corante de fluxo livre sejam removidos. Se algum corante residual permanecer, uma terceira lavagem é fortemente recomendada.

Figura 1: Comparação da coloração da pele entre um peixe-zebra normal e um peixe-zebra injetado com EB. (A) Peixe-zebra normal exibindo um tom de pele acastanhado típico. (B) Peixe-zebra injetado com EB exibindo uma tonalidade azulada perceptível, indicando circulação sistêmica bem-sucedida do corante. Barra de escala = 1 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Estabeleça o controle positivo por meio de ferimento por arma branca (SWI)

NOTA: A lesão por arma branca quebra a BHE e permite o extravasamento de EB no local da lesão.

1. Anestesie o peixe usando o método de choque hipotérmico (consulte a etapa 2.1). Uma vez anestesiado, injetar 20 μL de corante EB a 1% e deixar o peixe recuperar durante 30 minutos, conforme descrito nos passos 2.2 e 2.3.
2. Após o período de recuperação de 30 minutos, prepare uma agulha estéril de 31 G conectada a uma seringa de insulina e execute um procedimento de ferimento por arma branca da seguinte forma:
   1. Anestesie o peixe novamente.
   2. Posicione o peixe na vertical em uma superfície plana e fria (por exemplo, pacote de gel de gelo). Insira a agulha em um lado do telencéfalo em um ângulo de 90° a uma profundidade não superior a 1.5 mm (Figura 2).
      NOTA: Para evitar o contato direto da pele com a bolsa de gel de gelo e evitar possíveis danos à pele, coloque uma camada de gaze ou toalha de papel entre o peixe e a superfície fria (Figura 2). Alternativamente, o peixe pode ser posicionado em uma placa de Petri rasa colocada em cima da bolsa fria para manter o resfriamento sem contato direto. Marque 1,5 mm na agulha para evitar penetração excessiva.
   3. Transfira o peixe para um tanque de recuperação e deixe recuperar por 30 min.
   4. Eutanasiar, decapitar, consertar e dissecar o cérebro conforme descrito nas etapas 2.4 a 2.7.
   5. Para controle negativo, repita as etapas 2.1 a 2.7 usando 20 μL de 1x PBS em vez de corante EB.

Figura 2: Ferimento por arma branca para controle positivo. (A) Insira brevemente uma agulha 31G no telencéfalo (círculo vermelho) para facilitar a penetração do corante EB no tecido cerebral; Comparação lado a lado de um cérebro não lesionado e um cérebro esfaqueado, (B) vista dorsal do local da facada (círculo vermelho), (C) vista lateral do local da facada. Barra de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Análise qualitativa do extravasamento de EB

1. Observe os tecidos cerebrais dissecados sob um estereomicroscópio. Otimize as configurações de imagem (zoom, balanço de branco, exposição, contraste, etc.) para garantir a consistência.
2. Capture imagens usando uma câmera montada no microscópio e salve no . TIFF.
   NOTA: Use configurações de imagem idênticas para todas as amostras para garantir a validade comparativa.

5. Análise quantitativa do extravasamento de EB

1. Baixe e instale o Fiji (um link para baixar o software está disponível na Tabela de Materiais). Abra a imagem em Fiji.
2. Execute a deconvolução de cores clicando em: Imagem > Cor > Deconvolução de Cor > RGB, resultando em três imagens separadas representando tons de vermelho, verde e azul.
   NOTA: Esta etapa isola a tonalidade azul dos outros componentes de cor, garantindo que apenas a intensidade do corante azul seja medida.
3. Ative a imagem do canal azul (geralmente rotulada como "Color_3") clicando na imagem. Converta-o para escala de cinza de 8 bits clicando em: Imagem > Digite > 8 bits.
   NOTA: A conversão em tons de cinza minimiza os artefatos de cor e aprimora a análise baseada em intensidade.
4. Meça a intensidade de cinza da imagem de 8 bits.
   1. Defina as medidas selecionando: Analisar > Definir Medidas; selecione Área e Valor médio de cinza.
   2. Usando a ferramenta de seleção de retângulo, desenhe uma região de interesse (ROI) de tamanho uniforme e meça a intensidade do cinza selecionando Analisar > Medir ou pressionando Ctrl + M.
      NOTA: O mesmo tamanho de ROI deve ser usado em todas as amostras. As dimensões absolutas do ROI podem variar dependendo da ampliação e resolução da imagem adquirida, portanto, os pesquisadores devem padronizar o tamanho do ROI em seu conjunto de dados para garantir a comparabilidade. Cada pixel na imagem em tons de cinza de 8 bits tem um valor de intensidade que varia de 0 a 255, onde 0 representa preto puro, 255 representa branco puro e valores intermediários representam vários tons de cinza.
   3. Para reduzir o viés, desenhe de três a cinco ROIs em regiões anatomicamente consistentes do cérebro em todas as amostras. Evite regiões com artefatos ou manchas inconsistentes.
      NOTA: A consistência do posicionamento pode ser alcançada referenciando marcos anatômicos e garantindo que o posicionamento do ROI seja simétrico entre os grupos experimentais.
   4. Calcule a média dos valores médios de cinza das ROIs para cada imagem para obter um único valor de intensidade por cérebro. Use essa média para comparação estatística entre os grupos.

Resultados

Este protocolo foi testado em um modelo de peixe-zebra parkinsoniano. O comprometimento da BHE é um fenômeno bem documentado em pacientes com DP 16,17,18 e em vários modelos animais parkinsonianos 19,20,21. Para investigar a integridade da BBB no modelo parkinsoniano de peixe-zebra adulto, o extravasamento do corante EB para os tecido...

Discussão

Avaliar a integridade da BHE é essencial para entender a fisiopatologia das doenças relacionadas ao cérebro, pois uma BHE comprometida pode causar e piorar a progressão da doença⁴. Embora o peixe-zebra adulto tenha emergido como um modelo eficaz para o estudo de doenças neurodegenerativas, os métodos para avaliar a integridade da BHE nessa espécie permanecem subdesenvolvidos⁸. O protocolo apresentado aqui fornece uma abordagem direta e econ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pó de agarose	Vivantis	Rolamento PC0701
Corante azul de Evan	Sigma-Aldrich	E2129
Fiji ImageJ	Institutos Nacionais de Saúde, EUA		Link para download: https://imagej.net/software/fiji/downloads
Câmera para microscópio	Fornecedor verificado - ShenZhen Hayear Electronics Co., Ltd.	HY-500M
Paraformaldeído (PFA) em pó	Sigma-Aldrich	158127
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich	Pág. 4417
Cloreto de sódio (NaCl)	Produtos químicos HmbG	7647-14-5
Estereomicroscópio	Corporação Olympus	SZ40
Unidade de filtro de seringa, 0.45µ m	Merck Millipore	SLHV004SL