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Mutagênese precisa de fagos com sistemas CRISPR-Cas assistidos por NgTET

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DOI:

10.3791/69022

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14 de outubro de 2025

 ,  , 
1Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology, 2Kavli Institute of Nanoscience, Delft University of Technology, 3Department of Bionanoscience, Delft University of Technology, 4Philipps-Universität Marburg, Department of Chemistry, Center for Synthetic Microbiology (SYNMIKRO), 5Institute of Pharmaceutical Biology and Biotechnology, Department of Pharmacy, Marburg University

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para reduzir as modificações de DNA em bacteriófagos usando a enzima NgTET, permitindo a mutagênese CRISPR-Cas eficiente e sem cicatrizes. Este método facilita a engenharia genética de fagos para aplicações em biotecnologia e terapia fágica.

Resumo

Os bacteriófagos, vírus que visam especificamente seus hospedeiros bacterianos, têm um potencial significativo para a biotecnologia e a medicina, especialmente no combate a infecções multirresistentes. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes à infecção por fagos permanecem amplamente pouco explorados. A mutagênese precisa e específica do local de fagos é uma ferramenta poderosa para elucidar as funções gênicas e as interações fago-hospedeiro.

No entanto, um grande desafio na mutagênese do genoma do fago é a presença de modificações no DNA do fago que interferem nas ferramentas convencionais de edição do genoma, como o CRISPR-Cas.

Embora os sistemas CRISPR-Cas tenham sido usados com sucesso para mutagênese direcionada em vários organismos, sua eficácia na mutagênese de fagos é frequentemente limitada por modificações no DNA, como glicosilação de citosina. Para superar essa barreira, desenvolvemos um método eficiente que reduz temporariamente a abundância de modificações no DNA do fago, permitindo o direcionamento eficiente do CRISPR-Cas e a introdução precisa de mutações nos genomas dos fagos. Especificamente, usamos a metilcitosina dioxigenase Ten Eleven Translocation (TET) de Naegleria gruberi (NgTET), que modifica iterativamente as citosinas metiladas e hidroximetiladas no DNA. Ao oxidar citosinas hidroximetiladas no DNA do fago, o NgTET previne a modificação subsequente da citosina, como a glicosilação, e aumenta significativamente a eficiência da clivagem do DNA mediada por Cas.

Em conclusão, a abordagem de edição de genoma sem cicatrizes e precisa apresentada aqui permite a introdução eficiente de mutações pontuais, mantendo a arquitetura do gene nativo nos genomas de fagos. Ao preservar estruturas transcricionais e translacionais intactas, esse método minimiza interrupções não intencionais em redes regulatórias complexas. Isso é particularmente importante para investigar proteínas de fagos essenciais ou multifuncionais. A capacidade de gerar modificações genéticas direcionadas sem introduzir sequências estranhas expande significativamente o kit de ferramentas experimentais para a biologia dos fagos. Essa estratégia não apenas facilita estudos funcionais detalhados, mas também aumenta o potencial de engenharia racional de fagos para aplicações terapêuticas e biotecnológicas.

Introdução

Os bacteriófagos são vírus que visam especificamente as bactérias. Eles têm atraído um interesse significativo de pesquisa devido ao seu imenso potencial em biotecnologia e medicina, particularmente na luta contra bactérias multirresistentes 1,2,3. Apesar disso, a biologia dos fagos permanece relativamente pouco estudada. Uma compreensão mais profunda de seus mecanismos moleculares de sequestro de seus hospedeiros bacterianos é essencial para aproveitar plenamente seu potencial terapêutico e biotecnológico4. Para investigar os mecanismos moleculares subjacentes à infecção eficiente por fagos e ainda mais projetar os fagos para aplicações específicas, a capacidade de modificar geneticamente os genomas dos fagos é essencial. No entanto, continua sendo um dos desafios mais significativos no campo da biologia dos fagos 3,5,6.

O DNA do fago é frequentemente modificado por alterações químicas específicas das bases purina e pirimidina, por exemplo, glicosilação e metilação da citosina. Essas modificações protegem o material genético do fago do reconhecimento e degradação pelas nucleases do hospedeiro6. Embora essas modificações sejam cruciais para a aptidão do fago, elas são um obstáculo significativo para as abordagens de engenharia do genoma do fago que dependem de sistemas de direcionamento de DNA 2,3,7.

As estratégias de mutagênese existentes, incluindo sistemas de modificação de restrição e tecnologias baseadas em proteínas associadas a CRISPR (Cas), enfrentam desafios significativos ao modificar o DNA do fago devido a modificações epigenéticas protetoras, como a glicosilação da citosina8. A edição do genoma mediada por CRISPR-Cas, que é altamente eficaz em células bacterianas e eucarióticas, depende de duas etapas principais: a clivagem precisa do DNA em loci genômicos direcionados pela nuclease Cas, seguida pelo reparo do DNA por meio de recombinação homóloga com o DNA do doador carregando a mutação desejada1. No entanto, em fagos, as modificações no DNA geralmente impedem que as nucleases Cas se liguem ou clivem o genoma de forma eficiente. Além disso, a natureza rápida e transitória da replicação do fago pode limitar ainda mais a eficiência da recombinação homóloga. Essas barreiras tornam particularmente difícil aplicar a tecnologia CRISPR-Cas direcionada ao DNA para mutagênese de fagos. Foi demonstrado que as modificações no DNA do fago prejudicam o direcionamento do DNA do fago com CRISPR-Cas tanto in vitro quanto in vivo 6,7.

Para enfrentar os desafios impostos pelas modificações protetoras do DNA em fagos, introduzimos uma estratégia de mutagênese do genoma que aproveita a atividade da metilcitosina dioxigenase de translocação ten-onze (TET), especificamente NgTET. Em eucariotos, as enzimas TET catalisam a oxidação gradual da citosina metilada por meio de processos iterativos: a metilcitosina (5mdC) é primeiro convertida em hidroximetilcitosina (5hmdC), depois em formilcitosina (5fdC) e, finalmente, em carboxicitosina (5cadC) (Figura 1).

Em nossa abordagem de mutagênese de fagos, o NgTET é usado para reduzir temporariamente a abundância de modificações protetoras do DNA, aumentando assim a acessibilidade do DNA do fago a ferramentas de edição de genoma, como as enzimas Cas9. NgTET, foi selecionado para modular o genoma do bacteriófago devido a relatos anteriores de sua expressão bem-sucedida na forma solúvel ativa em um hospedeiro bacteriano heterólogo, particularmente E. coli. Essa propriedade é essencial, pois o NgTET deve permanecer ativo durante a infecção porfagos 10.

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Figura 1: Oxidação gradual da 5-metilcitosina pela TET dioxigenase1. A TET dioxigenase catalisa a oxidação sucessiva de 5-metil-2'-desoxicitidina (5mdC) em 5hmdC, 5-formil-2'-desoxicitidina (5fdC) e, finalmente, em 5-carboxil-2'-desoxicitidina (5cadC). O produto final, 5cadC, reverte espontaneamente ou enzimaticamente para citosina não modificada (dC), contribuindo assim para a regulação epigenética dinâmica. Este processo de várias etapas é central para a metilação ativa do DNA em eucariotos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Como a metilcitosina e a hidroximetilcitosina são precursores comuns de hipermodificações no DNA do fago, incluindo estruturas protetoras volumosas como glicosilações, a atividade oxidativa da TET dioxigenase pode ser explorada para prevenir a formação dessas hipermodificações de DNA9. Nesta abordagem de mutagênese do genoma baseada em TET, expressamos heterologicamente NgTET recombinantemente em E. coli para oxidar citosinas hidroximetiladas no genoma do fago após a infecção, evitando assim a formação de glicosilação volumosa. Ao diminuir a abundância dessas modificações volumosas do DNA, nossa abordagem pode aumentar a acessibilidade do DNA do fago às nucleases CRISPR-Cas. Essa acessibilidade aprimorada facilita o reconhecimento eficiente do alvo, a clivagem precisa do DNA e a introdução de mutações pontuais sem cicatrizes no genoma do fago, distinguindo-o dos métodos tradicionais de mutagênese de fagos que dependem de deleções de genes, inserções de genes repórteres ou a integração de junções artificiais para seleção de mutantes baseada em PCR 1,11. Essas estratégias convencionais têm sido até agora as únicas ferramentas disponíveis para mutagênese direcionada em genomas de fagos e, portanto, representam uma base importante para o método apresentado aqui. No entanto, proteínas de fago único podem possuir múltiplas funções. A deleção de todo o gene que codifica uma proteína de interesse interrompe todas as funções associadas. Em contraste, a introdução direcionada de mutações pontuais permite a inativação seletiva de funções específicas, permitindo uma análise detalhada de seus papéis. Até o momento, as funções de muitas proteínas de fagos permanecem em grande parte descaracterizadas; assim, podemos ignorar atividades adicionais ligadas a um determinado gene. Portanto, uma abordagem minimalista que visa remover apenas uma única função, causando alterações mínimas na proteína geral, é preferida12,13. O método descrito aqui permite modificações genéticas precisas sem interromper a organização ou função genômica geral. Outro grande desafio dos métodos anteriores de mutagênese de fagos tem sido sua baixa eficiência, que normalmente produzia taxas de mutação de cerca de 0,1%1,11. Com esta técnica, apresentamos a primeira estratégia de mutagênese capaz de introduzir mudanças de códon único, alcançando um notável aumento de sete vezes na eficiência de direcionamento. Ao combiná-lo com um método de triagem de alto rendimento baseado em ONT, a detecção de mutações pontuais é simplificada, eliminando a necessidade de rastrear grandes populações de fagos para isolar um mutante. A estratégia de mutagênese baseada em TET descrita aqui aborda uma limitação de longa data no campo e permite uma edição de genoma mais confiável14.

No geral, esse método não pode ser aplicado apenas para avançar nossa compreensão dos mecanismos de infecção por bacteriófagos, mas também é uma promessa significativa para a biologia sintética. Ao permitir a engenharia precisa e eficiente do genoma do fago, ele abre caminho para adaptar os fagos a aplicações específicas, aumentando assim seu potencial para aplicações biotecnológicas e médicas.

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Protocolo

Um esquema demonstrando a geração de fagos T4 tratados com NgTET é mostrado na Figura 2.

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Figura 2: Visão geral esquemática do fluxo de trabalho estabelecido para mutagênese de fagos T4 e triagem de mutantes. O fluxo de trabalho inclui a geração do fago T4 hipomodificado usando NgTET, que pode ser validado por análise LC-MS ou, alternativamente, por meio do ensaio de clivagem CRISPR-Cas. Posteriormente, a mutação de interesse é introduzida no genoma do fago por meio de mutagênese dirigida ao local mediada por CRISPR-Cas e identificada por contra-seleção. A presença da mutação desejada pode então ser confirmada usando o sequenciamento de nanoporos. Após a validação, o fago mutante pode ser propagado para restaurar as hipermodificações do DNA. Isso permite o uso do fago projetado em aplicações downstream, incluindo a análise de fenótipos de infecção por meio de ensaios de lise e medições de tamanho de explosão. Cada etapa da figura é anotada com o número do protocolo correspondente entre parênteses para facilitar a vinculação das etapas do protocolo com as respectivas partes da figura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Redução das modificações do DNA do fago usando o pré-tratamento com NgTET (~ 2 dias)

NOTA: Esta etapa é crítica para permitir o direcionamento eficiente da nuclease Cas durante a mutagênese, reduzindo a abundância de modificações no DNA do fago.

  1. Inocular a cepa de E. coli BL21 (DE3) transformada com pET28a_NgTET transferindo material de um estoque de glicerol para 10 mL de meio LB suplementado com 30 μg / mL de canamicina. Incubar durante a noite a 37 °C com agitação a 160 rpm.
  2. No dia seguinte, use a cultura noturna para inocular uma cultura principal até uma DOinicial de 600 de 0,1 em 50 mL de meio LB contendo 30 μg / mL de canamicina. Induzir a cultura com 50 μM IPTG quando for atingido um OD600 de 0,4.
  3. Cultive a cultura a 37 °C com agitação a 160 rpm até atingir um OD600 de 0,8.
  4. Infectar a cultura com o fago de interesse a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,1 e incubar por 4 h à temperatura ambiente com agitação a 120 rpm.
  5. Colher as células por centrifugação a 4000 × g durante 20 min a 4 °C.
  6. Passe o sobrenadante por um filtro de 0,45 μm para obter fagos tratados com NgTET com DNA hipomodificado. Conservar os fagos filtrados a 4 °C para utilização futura.
    NOTA: (PONTO DE PAUSA) Os fagos filtrados são estáveis por vários meses a 4 ° C, armazenados em meio LB em um frasco de vidro.

2. Validação

NOTA: O objetivo desta etapa é verificar experimentalmente a abundância reduzida de modificações no DNA do fago.

  1. Validação do tratamento via LC-MS (~ 2 dias)
    1. Purificação de fagos via gradiente de sacarose
      1. Para remover o ácido nucleico residual do lisado, trate 500 μL da suspensão de fagos (>1010 PFU/mL) com 20 U de DNase I e 2 μL de RNase A/T1 Mix (4 μg de RNase A, 10 U de RNase T1).
      2. Incubar a mistura a 37 °C durante 30 min.
      3. Prepare um gradiente de sacarose de 0-45% em tampão TM (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, pH 7,5). Prepare o gradiente usando um misturador de gradiente ou manualmente.
        NOTA: Para preparação manual, comece pipetando 5 mL de tampão TM em um tubo de gradiente. Em seguida, usando uma cânula de ponta romba, pipetar lentamente 5 mL da solução de sacarose a 45% do fundo do tubo, permitindo que a solução a 0% suba gradualmente.
      4. Carregue 500 μL da solução de fago tratada no topo do gradiente.
      5. Centrifugar a 70.000 × g durante 20 min a 4 °C.
      6. Acenda o tubo de centrifugação por baixo. Isso permitirá a visualização do fago, que aparece como uma faixa turva no gradiente. Remova a fração contendo fagos cuidadosamente usando uma cânula romba.
      7. Transferir a fracção de fago extraída para um novo tubo de ultracentrifugação.
      8. Adicione 30 mL de tampão TM gelado e centrifugue a 100.000 × g por 1 h a 4 °C.
      9. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 500 μL de tampão TM.
      10. Conservar os fagos ressuspensos num frasco para injetáveis de vidro a 4 °C durante a noite.
    2. Isolamento de DNA de fago
      1. Adicione 1 μg de proteinase K aos fagos ressuspensos.
      2. Incubar durante 30 min a 37 °C.
      3. Adicione 1 volume da mistura de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (P/C/I). Misture por inversão. Separe as fases por centrifugação a 15.000 x g por 1 min a 4 °C. Transferir a fase aquosa para um novo tubo de reacção. Repita a extração três vezes.
        CUIDADO: O fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (P/C/I) é altamente tóxico, corrosivo e volátil. Sempre manuseie-o dentro de uma hotte usando equipamento de proteção adequado, incluindo jaleco, óculos de segurança e luvas duplas de nitrilo. Evite o contato com a pele e os olhos e armazene em um recipiente hermeticamente fechado em um armário químico designado. Descarte os resíduos por meio de canais de resíduos perigosos aprovados. Em caso de contato, enxágue imediatamente com água e procure atendimento médico.
      4. Para remover o fenol residual, execute três extrações de clorofórmio com 1 volume de clorofórmio.
      5. Precipitar o ADN durante a noite com 0,1 volume de NaOAc 3 M (pH 5,5) e 2,5 volume de etanol a -20 °C.
      6. No dia seguinte, pulverizar o DNA por centrifugação a 15.000 × g por 1 h a 4 ° C.
      7. Lave o pellet de DNA duas vezes com 200 μL de etanol a 70%, agitando suavemente, centrifugando a 15.000 × g por 15 min a 4 ° C e removendo cuidadosamente o sobrenadante.
      8. Ressuspenda o DNA purificado em água ultrapura.
      9. Conservar o ADN a -20 °C até nova utilização.
        NOTA: (PONTO DE PAUSA) O DNA precipitado pode ser armazenado a -20 °C durante vários meses.
    3. Preparação de DNA de fago para análise de LC-MS
      1. Digerir o ADN purificado em nucleósidos únicos utilizando uma Mistura de Digestão de Nucleósidos.
      2. Análise da composição do DNA via LC-MS.
        NOTA: Esta etapa permite a validação da eficácia do tratamento com NgTET. O protocolo é adaptado ao equipamento específico e à coluna disponível no laboratório, mas pode ser ajustado com base nos recursos e condições disponíveis.
      3. Use DNA digerido isolado de fago purificado (etapa 2.1.10).
      4. Inclua os seguintes padrões comercialmente disponíveis para as medições: dA, dT, dG, dC, 5hmdC, 5fdC, 5cadC. Se disponível, inclua o padrão da hipermodificação da citosina presente no DNA do fago.
      5. Utilizar um sistema de HPLC equipado com uma coluna C18 (150 × 2,1 mm, 100 Å, 3 μm) e uma coluna de proteção de 20 × 2,1 mm.
      6. Defina a temperatura da coluna para 40 °C e a vazão do eluente para 0.2 mL/min.
      7. Preparar os eluentes do seguinte modo:
        Eluente A: 10 mM de acetato de amônio em água (pH 4,5).
        Eluente B: 0,1% de ácido fórmico em metanol.
        CUIDADO: O ácido fórmico a 0,1% no metanol é inflamável e pode irritar a pele, os olhos e o trato respiratório. Utilizar sempre numa área bem ventilada ou exaustor. Use equipamento de proteção adequado, incluindo jaleco, óculos de segurança e luvas de nitrilo. Mantenha longe do calor, faíscas e chamas abertas. Armazene em um armário de armazenamento inflamável. Descarte por meio de protocolos de resíduos perigosos aprovados.
      8. Aplique o seguinte perfil de fase móvel: 0-1 min: Constante a 5% B; 1-5 min: Gradiente de 5% a 90% B; 5-7 min: Constante a 90% B; 7-7,1 min: Gradiente de 90% a 5% B; 7,1-12 min: Constante a 5% B.
      9. Utilizar um espectrómetro de massa nos modos de ionização negativa e positiva (injecções separadas) com uma fonte de ionização por electrospray de alta temperatura (H-ESI) nas seguintes condições:
        Tensão de pulverização H-ESI: 3400 V (+), 2400 V (-), Gás de bainha: 35 unidades arbitrárias, Gás auxiliar: 7 unidades arbitrárias, Gás de varredura: 0 unidades arbitrárias, Temperatura do tubo de transferência de íons: 300 °C, Temperatura do vaporizador: 275 °C, Modo de detecção: Varredura completa usando o analisador de massa Orbitrap, Resolução de massa: 120.000, Faixa de massa: 200-450 (m/z).
      10. Extraia cromatogramas de íons das formas [MH]- (dA, dT, dC, 5hmdC, 5fdC, 5cadC) e [M+H]+ (5ghmdC) usando o software Tracefinder.
      11. Calcule a abundância relativa de cada modificação normalizando a área de pico de cada sinal para a área de pico de dG dentro da amostra, usando dG como um padrão interno específico da amostra.
  2. Validação com ensaio de clivagem CRISPR-Cas (~2,5 dias)
    NOTA: Esta etapa permite a avaliação fenotípica do sucesso do tratamento com NgTET e seu impacto na clivagem do CRISPR-Cas. Se o NgTET estiver ativo, nenhuma placa deve se formar a partir do DNA do fago tratado, ou o título do fago deve ser reduzido, pois a remoção de modificações protetoras do DNA torna o genoma suscetível à clivagem CRISPR-Cas12 ou 9. Em contraste, se o DNA do fago não for tratado, o número de placas formadas corresponderá ao título dos fagos, indicando que o genoma do fago T4 hipermodificado é resistente à clivagem CRISPR-Cas12 ou 9.
    1. Inocular E. coli BL21 (DE3) a partir de uma cultura durante a noite, transformada com o plasmídeo pET28a_NgTET e um plasmídeo de expressão Cas12 ou Cas9 (por exemplo, DS-spCas ou pCpf1 sem espaçador). Todos os plasmídeos com informações adicionais podem ser encontrados na Tabela 1.
      1. Cultivar as células em meio LB suplementado com os antibióticos apropriados a 3 °C com agitação, a partir de um OD600 de 0,1. Quando a cultura atingir um OD600 de aproximadamente 0,4, induza a expressão de NgTET adicionando 0,05 mM de IPTG e incube por mais 2 h a 3 °C.
      2. Como controle, compare cepas de E. coli BL21 (DE3) com e sem superexpressão de NgTET. Na ausência de atividade de NgTET, espera-se um número maior de unidades formadoras de placas, indicando eficiência reduzida de CRISPR-Cas devido à presença de 5ghmdC glicosilada no DNA do fago.
    2. Transfira 300 μL das culturas de E. coli para um tubo estéril.
    3. Infecte a cultura com fago tratado com T4 WT ou NgTET com MOI 0,01. Para este experimento, aplique um MOI baixo para garantir que as bactérias sejam infectadas por apenas um fago por vez. Isso maximiza a eficiência da triagem de clivagem CRISPR-Cas e simplifica a interpretação dos resultados. Misture delicadamente para garantir uma distribuição uniforme dos fagos.
    4. Incubar a suspensão de fagos bacterianos a 37 °C durante 7 min.
    5. Adicione a mistura bactéria-fago a 4 mL de ágar mole LB (0,75%) suplementado com antibióticos. Misture bem, mas delicadamente, para evitar a introdução de bolhas.
    6. Despeje a mistura de ágar macio em um prato de ágar LB pré-aquecido.
    7. Deixe as placas solidificarem brevemente à temperatura ambiente. Incubar as placas a 37 °C durante a noite.
    8. No dia seguinte, conte as placas resultantes para determinar as unidades formadoras de placas (UFP).

3. Mutagênese CRISPR-Cas (~ 1 semana)

NOTA: A mutagênese CRISPR-Cas é baseada no princípio de que um local específico dentro do genoma do fago é alvo de uma nuclease Cas durante a infecção do fago, resultando em uma quebra de fita dupla. Essa quebra é reparada por meio de recombinação homóloga usando DNA do doador, que é fornecido em um segundo plasmídeo presente na cepa hospedeira infectada durante a mutagênese. O plasmídeo que contém o DNA do doador também codifica o NgTET, que é essencial para manter a acessibilidade do DNA do fago para a nuclease Cas, reduzindo a abundância de citosinas modificadas, conforme descrito anteriormente. Nesta etapa, as mutações-alvo são introduzidas no genoma de fagos T4 tratados com NgTET após a infecção de E. coli15. Para garantir níveis consistentemente baixos de modificações de DNA no genoma T4, a NgTET dioxigenase é expressa pela adição de 50 μM IPTG (analogamente à etapa 1.2) ao longo do processo de mutagênese.

  1. Geração de plasmídeos de DNA pET28a_NgTET_donor via clonagem Golden Gate15
    1. Para a geração do DNA do doador, solicite a sequência desejada como um gene inteiro ou amplifique a partir de um genoma, por exemplo, do genoma do fago, e introduza a mutação desejada.
      NOTA: Para o desenho do DNA do doador, inclua regiões homólogas flanqueando o local-alvo (≈200 pb de cada lado para mutações pontuais; regiões mais longas para inserções maiores). O fragmento doador linear deve carregar locais de reconhecimento de BsaI que gerem saliências compatíveis com o plasmídeo após a clivagem. A clonagem in silico é recomendada para verificar o design da construção. Nos resultados representativos, todos os componentes críticos para o DNA do doador são ilustrados em um exemplo.
    2. Introduza o fragmento de DNA do doador a jusante da sequência de codificação e terminador do NgTET no backbone pET28a_NgTET usando o conjunto Golden Gate.
      1. Prepare as reações de montagem combinando 70 fmol de plasmídeo pET28a_NgTET, 140 fmol de inserção de DNA do doador, 1 μL de BsaI (20 U / μL), 5 U de T4 DNA ligase e 2 μL de tampão 10× ligase, com água livre de nuclease adicionada a um volume final de 20 μL.
      2. Execute reações em 25 ciclos em um ciclador de PCR com as seguintes configurações: 1) Restrição, 37 ° C por 1,5 min, 2) Ligadura, 16 ° C por 3 min, 3) Restrição final, 37 ° C por 5 min e 4) Desnaturação, 60 ° C por 10 min.
    3. Adicionar 6 μl da mistura de reacção (do passo 3.1.2) a 100 μl de E. coli DH5α quimicamente competente, incubar em gelo durante 10 min e choque térmico a 42 °C durante 45 s. Coloque imediatamente as células no gelo por 1 min e, em seguida, adicione 750 μL de meio LB. Recuperar a 37 °C com agitação (500 rpm) durante 1 h. Colocar em placa em ágar LB contendo canamicina (30 μg/ml) e incubar durante a noite a 37 °C.
    4. Escolha uma única colônia e inocule 20 mL de meio LB suplementado com canamicina (30 μg/mL). Incubar durante a noite a 37 °C com agitação a 160 rpm.
    5. A partir de 5 mL da cultura noturna, pelete as células e isole o DNA do plasmídeo usando um método padrão de extração de plasmídeo. Eluir o plasmídeo em 40 μL de água livre de nuclease.
    6. Confirme a clonagem correta sequenciando o local de inserção do plasmídeo usando o sequenciamento Sanger.
  2. Construção de plasmídeos CRISPR-Cas contendo espaçadores (pCpf1-sp como modelo)15
    NOTA: O plasmídeo descrito neste capítulo permite a primeira etapa da mutagênese introduzindo uma quebra de fita dupla específica do local no genoma do fago. Embora o procedimento seja demonstrado aqui com o sistema CRISPR-Cas12 (plasmídeo pCpfl-sp), nucleases alternativas como CRISPR-Cas9 (plasmídeo DS-spCas) também podem ser empregadas15 .
    1. Projete um espaçador de 20 nt visando o local da mutagênese (PAM: TTTV). Identificar e projetar protoespaçadores adequados e espaçadores correspondentes usando ferramentas de bioinformática.
    2. Sintetize dois oligonucleotídeos 5'-fosforilados. Certifique-se de que cada um carregue 10 nt da sequência espaçadora desejada (juntos formando o espaçador completo de 20 nt) e uma região adicional de 10 nt complementar ao local de inserção dentro do plasmídeo pCpf1-sp.
    3. Insira o espaçador CRISPR-Cas projetado no plasmídeo pCpf1-sp por amplificação por PCR usando os primers da etapa 2. Configure a reação da seguinte forma (volume final 50 μL): 5 μL 10× tampão GC, 1 μL 10 mM dNTPs, 1 μL de primer direto (10 μM), 1 μL de primer reverso (10 μM), 2,5 μL de DMSO, molde de plasmídeo correspondente a 2 fmol, 1 μL de Phusion DNA polimerase (2 U / μL) e água livre de nuclease a 50 μL.
    4. Colocar os tubos de reacção num termociclador e executar o seguinte programa: desnaturação inicial a 98 °C durante 30 s; 25 ciclos de 98 °C por 10 s, recozimento à temperatura apropriada (X °C) por 30 s e extensão a 72 °C por 6 min; seguido por uma extensão final a 72 °C por 10 min. Manter as amostras a 4 °C até ser processado de novo nível.
    5. Misture 5 μL da reação de PCR com tampão de carga de DNA (10×) e carregue em um gel de agarose a 1%. Execute o gel a 130 V por 20 min e visualize as bandas de DNA usando iluminação UV trans. Se a amplificação for bem-sucedida, purifique o produto de PCR usando um kit de limpeza adequado e elua em 20 μL de água livre de nuclease.
    6. Circularizar o plasmídeo por ligação utilizando 100 ng do produto amplificado misturado com tampão 1× T4 DNA ligase e 60 U T4 DNA ligase num volume total de reacção de 15 μL. Incubar durante 1 h à temperatura ambiente. Transformar 100 μl de E. coli quimicamente competente com o produto de ligação, conforme descrito no passo 3.1.3. Plaquear as células em ágar LB contendo 50 μg/ml de estreptomicina e incubar durante a noite a 37 °C.
    7. Pegue uma única colônia da placa e inocule-a em 20 mL de meio LB suplementado com 50 μg / mL de estreptomicina. Incubar durante a noite a 37 °C com agitação a 160 rpm. A partir de 5 mL da cultura noturna, colha as células por centrifugação e isole o DNA do plasmídeo usando um método de extração de plasmídeo de escolha. Eluir o plasmídeo em 40 μL de água livre de nuclease.
    8. Confirme a clonagem bem-sucedida sequenciando o plasmídeo no local de inserção usando o sequenciamento Sanger.
  3. Mutagênese de fagos
    1. Transforme as células BL21 (DE3) de E. coli com dois plasmídeos: pET28a_NgTET_donor-DNA e espaçador pCpf1-sp (Cas12)/DS-SPcas (Cas9) (gerado nas etapas 3.1 e 3.2). Misturar 1 μl de cada plasmídeo com 100 μl de E. coli BL21 (DE3) quimicamente competente. Siga o protocolo descrito na etapa 3.1.3. Colocar as células transformadas em ágar contendo 50 μg/ml de estreptomicina e 30 μg/ml de canamicina, e incubar durante a noite a 37 °C.
    2. Inocular a estirpe de E. coli transformada (E. coli BL21 (DE3) pET28a_NgTET_donor-DNA e pCpf1-sp(Cas12)/DS-SPcas(Cas9)_spacer) em 10 ml de meio LB suplementado com 30 μg/ml de canamicina e 50 μg/ml de estreptomicina. Incubar durante a noite a 37 °C com agitação a 160 rpm.
    3. No dia seguinte, diluir a cultura durante a noite para uma DO600 inicial de 0,1 em 50 mL de meio LB contendo 30 μg/mL de canamicina e 50 μg/mL de estreptomicina.
    4. Cultive a cultura a 37 °C com agitação a 160 rpm até atingir um OD600 de 0,8. Abaixe a temperatura para a temperatura ambiente (RT) e reduza a velocidade de agitação para 130 rpm.
      1. Para aumentar a adsorção de fagos e a injeção de DNA, adicione MgCl2 e CaCl2 a concentrações finais de 1 mM cada, pois esses cátions divalentes facilitam interações eficientes entre fago e hospedeiro.
      2. Infecte a cultura com fagos T4 pré-tratados com NgTET e, como controle negativo, com fagos T4 não tratados com NgTET em um MOI de 0,1. Continue a incubação em RT por 4 h.
    5. Após a incubação, transferir as culturas para um tubo cónico de 50 ml e centrifugar a 4000 × g a 4 °C durante 20 min para sedimentar as células. Filtrar os sobrenadantes através de um filtro de 0,45 μm para remover quaisquer células bacterianas residuais. Use os sobrenadantes filtrados para ensaios de placa (descritos na etapa 2.2) para determinar a concentração de fagos ou realizar a contra-seleção.

4. Identificação de mutantes

NOTA: O objetivo da contra-seleção é diminuir a proporção de fagos do tipo selvagem remanescentes na população após a mutagênese. Para isso, fagos obtidos da etapa de mutagênese (etapa 3.3) são usados para infectar E. coli carregando o mesmo sistema CRISPR-Cas13, que é codificado por outro plasmídeo pBA560 (informações adicionais na Tabela 1) e a mesma sequência espaçadora aplicada durante a mutagênese. Nessa configuração, as nucleases Cas reconhecem e clivam seletivamente o DNA do fago do tipo selvagem, enquanto os fagos que carregam as mutações desejadas permanecem inalterados. Essa pressão seletiva suprime a replicação do tipo selvagem e enriquece a população de fagos mutantes14.

  1. Contra-seleção com Cas13
    1. Infecte E. coli Cas13a_spacer (plasmídeo pBA560) com os fagos para contra-seleção. Esta etapa facilita a contra-seleção degradando o RNA do fago que não sofreu a mutação pretendida.
    2. Execute a contra-seleção nas mesmas condições usadas durante a mutagênese (consulte as etapas 3.3.1 a 3.3.5). Use E. coli expressando um espaçador Cas13a não direcionado como controle negativo para confirmar que a redução da placa é específica do espaçador.
    3. Após a incubação, filtre o sobrenadante contendo fagos contra-selecionados através de um filtro de 0,45 μm para remover os detritos bacterianos.
      NOTA: (PONTO DE PAUSA) Os fagos filtrados são estáveis por vários meses a 4 ° C, armazenados em meio LB em um frasco de vidro.
    4. Use os fagos contra-selecionados e filtrados para um ensaio de placa em uma cepa de E. coli B para isolar placas individuais para validação a jusante.
  2. Sequenciamento de próxima geração (~ 1 semana)
    NOTA: O método para a abordagem de sequenciamento altamente multiplexado envolve um processo de PCR em duas etapas para gerar DNA de amplicon multiplexado adequado para sequenciamento de próxima geração de leitura longa16.
    1. Separe os fagos da mutagênese colocando-os como descrito na etapa 2.2. Inclua controles adequados usando fagos obtidos de mutagênese realizada na presença e ausência de expressão de NgTET. Como controle, o direcionamento de CRISPR-Cas9 e Cas12 sem NgTET não deve resultar na introdução de mutações pontuais. Em contraste, espera-se que a co-expressão de NgTET permita uma edição bem-sucedida, levando a maiores eficiências de mutagênese.
    2. Para isolar os fagos individuais, retire as placas individuais da placa e transfira-as para um tubo contendo 100 μL de tampão Pi-Mg (26 mM Na2PHO4, 68 mM NaCl, 22 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, pH 7,5) e 1 μL de CHCl3.
      CUIDADO: O clorofórmio é tóxico, volátil e suspeito de ser cancerígeno, mesmo em pequenos volumes. Manuseie apenas em um exaustor e use equipamento de proteção completo, incluindo jaleco, óculos de segurança e luvas de nitrilo. Evite a inalação e o contato com a pele. Armazene em um recipiente hermeticamente fechado em um armário químico ventilado e inflamável. Descarte os resíduos de clorofórmio por meio da coleta de resíduos perigosos.
    3. Use 1 μL de fago isolado T4 em tampão Pi-Mg como modelo para a triagem.
    4. Prepare a mistura de reação com 0,125 μM de cada primer (ao redor da posição de inserção) e 1x master mix de polimerase de alta precisão, ajustando o volume total da reação de amplificação para 10 μL. Execute uma reação de PCR com 30 ciclos de amplificação.
    5. Execute um segundo PCR para anexar os códigos de barras. Portanto, use 1 μL de uma diluição de 1:10 do produto da primeira PCR como molde.
    6. Preparar a mistura de reação com primers de código de barras de 0,3 μM e uma mistura de polimerase de partida a quente de alta fidelidade em um volume total de 7 μL. Realizar PCR com 20 ciclos de amplificação.
      NOTA: (PONTO DE PAUSA) PCR-Os produtos podem ser armazenados a -20 °C por várias semanas.
    7. Agrupe todos os produtos de PCR com código de barras e purifique-os usando limpeza baseada em esferas magnéticas de acordo com protocolos padrão para preparação de biblioteca de sequenciamento de última geração.
    8. Capture DNA usando esferas magnéticas, lave duas vezes com etanol a 80% e elua em 100 μL de tampão de eluição (5 mM Tris-HCl, pH 8,5).
    9. Medir a concentração de ADN utilizando métodos espectrofotométricos e fluorométricos, aplicando ensaios de grande alcance ou de alta sensibilidade, conforme adequado.
      NOTA: (PONTO DE PAUSA) O DNA pode ser armazenado a -20 °C por várias semanas.
    10. Gere bibliotecas de sequenciamento usando um protocolo baseado em ligação de acordo com as instruções do fabricante, começando com 1 μg de DNA de entrada.

5. Propagação mutante, recuperação de modificações e provas de DNA

NOTA: Uma vez que o fago mutante desejado é identificado, ele é propagado em E. coli do tipo selvagem para restaurar os níveis de modificação do DNA semelhantes aos do fago WT. Isso garante que o fago mutante possa ser utilizado em experimentos biológicos subsequentes sem qualquer compromisso, além da mutação introduzida.

  1. Preparar uma cultura de 10 ml de E . coli B em meio LB e incubar durante a noite a 37 °C com agitação a 160 rpm.
  2. No dia seguinte, inocular um meio fresco de 50 mL LB com a cultura durante a noite para atingir um OD600 inicial de 0,1.
  3. Deixar a cultura crescer a 37 °C com agitação a 160 rpm até atingir um OD600 de 0,8.
  4. Adicionar 50 μl do estoque de fagos mutantes (4.2.2) à cultura. Remova a fase com cuidado para evitar a transferência de CHCl3.
  5. Incubar a cultura infectada durante a noite à temperatura ambiente com agitação suave a 120 rpm.
  6. Após a incubação, centrifugue a cultura a 4000 × g para remover as células bacterianas. Filtrar o sobrenadante através de um filtro de 0,45 μm para recolher o fago.
  7. Transferir o fago mutante filtrado para um recipiente de vidro e conservar a 4 °C até nova utilização.
    NOTA: (PONTO DE PAUSA) Os fagos filtrados são estáveis por vários meses a 4 ° C, armazenados em meio LB em um frasco de vidro.
  8. Como validação opcional da regeneração de modificações no DNA, especificamente citosinas glicosiladas, realize uma análise de LC-MS conforme descrito na etapa 2.1.
    1. Para isso, purifique o DNA do fago recuperado da progênie do fago conforme descrito na etapa 2.1.1, isole como na etapa 2.1.2 e, posteriormente, prepare-se para a análise de LC-MS conforme descrito na etapa 2.1.3.
    2. Analisar cromatogramas de íons e calcular a abundância relativa de cada modificação normalizando a área de pico de cada sinal para a área de pico de dG dentro da amostra, usando dG como um padrão interno específico da amostra, conforme descrito nas etapas 2.1.3.
      NOTA: Recomenda-se incluir o fago T4 do tipo selvagem, o fago T4 tratado com NgTET e o fago T4 tratado com a variante inativa NgTET D234A como controles, a fim de validar e comparar diretamente a abundância de 5ghmdC10.

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Resultados

Identificação da banda do fago no gradiente.
A visibilidade da banda do fago no gradiente depende da concentração do fago na amostra inicial carregada no gradiente. Quando o fago está suficientemente concentrado (~ >1 × 1011 PFU / mL), a banda pode ser vista claramente iluminando o gradiente da parte inferior com uma fonte de luz (ver Figura 3).

No entanto, em baixas concentrações de fago, a banda pode não ser facilmente visível. ...

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Discussão

Este estudo apresenta uma estratégia robusta e adaptável para a introdução de mutações pontuais precisas em genomas de bacteriófagos, incluindo alterações de nucleotídeo único. Um elemento central do fluxo de trabalho é a integração de etapas de validação rigorosas em cada estágio, o que é essencial para garantir a precisão e a eficiência da edição do genoma. Isso é particularmente crítico, dada a natureza de várias etapas do fluxo de trabalho e as interações dinâmicas entre os fagos e s...

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Divulgações

KH e NP apresentaram um Pedido de Patente Europeia para "Engenharia de Fagos", Pedido de Patente Europeia nº 23 175 257.7. Os demais autores declaram não haver interesses conflitantes.

Agradecimentos

Este projeto recebeu financiamento do Conselho Alemão de Pesquisa (DFG; Projeto SPP 2330 número 464500427, RTG 2355 projeto 11 e RTG 2937 (projeto número 505997786) da Sociedade Max Planck (financiamento do Líder do Grupo de Pesquisa Max Planck para K.H.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos de reação de 1,5 mLSarstedt72.690.001
Tubos canociais de 15 mLSarstedt62.554.502
Tubos de polipropileno de parede fina de 15 mL de topo abertoCiências da Vida Beckman Coulter36170616 mm x 95 mm (para ultracentrifugação)
Tubos canônicos de 50 mLSarstedt62.547.254
5x buffer de GCThermo Fisher Scientific F519L
6x TriTrack DNA Loading Dye Thermo Fisher Scientific R1161
AgaroseBIOCIÊNCIA MERIDIANABIO-41025Grau molecular
Centrífuga Avanti J-30ICiências da Vida Beckman CoulterSem catálogo  númeroSerien-Nr. JKY14M01, https://www.beckman.de/centrifuges/ultracentrifuges/optima-xe
Ácido bórico Merck10043-35-3
BsaI-HF v2NEBR3733S
Hexahidrato de cloridrato de cálcioACROS ORGÂNICOS7774-34-797 %, extra puro
Medidor de densidade celularBiocromo de Harvard 80211630
ChemiDoc MP Biorad12003154
ClorofórmioVWR650498
CuvetesSarstedt67.742
Dimetilsulfóxido (DMSO) Sigma AldrichD4540
Hidrogenofosfato dissódiconeoFroxx GmbH7558-79-4Grau farmacêutico
Pipetas de vidro descartáveis PasteurVWR612-1702230 milímetros
DNase I Roche471672800110 U/µ L
Mistura dNTP (10 mM cada dNTP) Sigma-Aldrich72004
DS_SPcas_ModAProduto interno.https://github.com/MaikTungsten/CRISPRT4/tree/main/Plasmid_mapsConstrução de plasmídeo que contém CRISPR-Cas12/ModA sgRNA
DS-spCas (sistema CRISPR-Cas9)Adicionar 48645 (número do acessório addgene)Plasmídeo para construção de plasmídeos CRISPR-Cas contendo espaçadores (sistema CRISPR-Cas9) para mutagênese de fagos (etapa 3.2)
A cepa B de E. coli foi usada para infecção por T4DSMZSem catálogo  númeroEscherichia coli (Migula 1895) Castellani e Chalmers 1919 (DSM 613, ATCC 11303)
E. coli BL21 (DE3) Cepa de expressão, célula competenteInvitrogenC600003Cepa de expressão, células competentes.
E. coli DH5&alfa; Cepa de clonagem, células competentesInvitrogen18265017Cepa de clonagem, células competentes. 
EDTARoth8043.2
Etanol (absoluto) VWR200-578-6
Célula de fluxo FlongleTecnologias Oxford NanoporeSem catálogo  númeroR10.4.1. Química https://nanoporetech.com/document/flongle
Kit Miniprep de Plasmídeo Gene JET Thermo Fisher Scientific 10242490
GeneRuler 1 kb Plus escada de DNAThermo Fisher Scientific SM1331
GeneRuler ULR DNA ladder Thermo Fisher Scientific SM1213
Mestre Gradiente 108BIOCOMPSem catálogo  númerohttps://biocompinstruments.com/our-approach/gradient-forming
Centrífuga Heraeus Pico 17Thermo Científico75002410
Incubadora Infors HT MinitronInfors AGSem catálogo  númerohttps://infors-ht.com/de/produkte/inkubationsschuettler/minitron#productspecs
Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG)Sigma-Aldrich367-93-1
CanamicinaCarl RothT832.1
LB-ÁgarCarl-RothX969.1
LB-médio (Luria/Miller) Carl-RothX968.1
Cloreto de magnésio hexahidratado Sigma-Aldrich7791-18-6
Sulfato de magnésioSigma-Aldrich7487-88-9
Dispositivo MinION Tecnologias Oxfrod NanoporeSem catálogo  númerohttps://store.nanoporetech.com/eu/minion.html
ModA E165A_fwIDTGAATTAGTTTCAGATGA
ACAAGCGGTAATGATAC
CAGCT		Cartilha direta para introdução de mutação pontual para ModA E165A e para introdução de extremidades adesivas para clonagem Golden Gate (Etapa 3.1)
ModA E165A_revIDTCATATTACGATAACGA
TGACTATCCGGAAAC		Primer reverso para introdução de mutação pontual para ModA E165A e para introduzir extremidades adesivas para clonagem Golden Gate (Etapa 3.1)
ModA_sgRNA_Cas12_fwIDTTCTTGTTCATCTACAAC
AGTAGAAATTAATTTAAA
GTTCTTAGACCCG		Primer direto para geração de espaçador para sistemas CRISPR-Cas12 / CRISPR-Cas9 / CRISPR-Cas13 para mutagênese e contra-seleção de fagos (etapa 3.2 e etapa 4.1)
ModA_sgRNA_Cas12_revIDTAGTAATGATAAAGAACT
TTAAATAATTTCTACTGT
TGTAGATGCTAC		Primer reverso para geração de espaçador para sistemas CRISPR-Cas12 / CRISPR-Cas9 / CRISPR-Cas13 para mutagênese e contra-seleção de fagos (etapa 3.2 e etapa 4.1)
Espectrofotômetro NanoDrop ND-1000Thermo Fisher CientíficoAZY2019944
Kit NucleoMagMachery NagelREFERÊNCIA 744970.50
Mistura para digestão de nucleosídeosBiolabs da Nova InglaterraM0649S
pBA560 (sistema CRISPR-Cas13)Addgene186236 (número do acessório addgene)Sistema CRISPR-Cas13 de codificação de plasmídeo para contra-seleção (etapa 4.1)
plasmídeo pCpfl-sp (sistema CRISPR-Cas12)Addgene122186
plasmídeo pCpfl-sp (sistema CRISPR-Cas12)Addgene122186 (número do acessório addgene)Plasmídeo para construção de plasmídeos CRISPR-Cas contendo espaçadores (sistema CRISPR-Cas12) para mutagênese de fagos (etapa 3.2)
Vasos de reação de PCRSarstedt72.991.002
PeqVERDEVWR732-3196
pET28a_NgTET Produto interno.Sem catálogo  númeroO plasmídeo está disponível mediante solicitação, o mapa do plasmídeo pode ser encontrado no seguinte https://zenodo.org/records/10615143 
pET28a_NgTET Produto interno.Sem catálogo  númeroPlasmídeo para construção de DNA pET28a_NgTET_donor via clonagem Golden Gate (etapa 3.1), plasmídeo  estiver disponível mediante solicitação, o mapa de plasmídeo pode ser encontrado no seguinte https://zenodo.org/records/10615143 
Placas de PetriSarstedt82.1473.00192 x 16 mm com cames
DNA polimerase de Phusion Thermo Fisher Scientific F-530XL2 U/µ L
Fosfato de potássioSigma Aldrich7778-77-0Monobásico
Fonte de alimentação universal PowerPacBio Rad1645070
Proteinase K Carl Roth7528.1100 mg/ml
Kit de Purificação PCR QIAquick QIAGEN28506
Fluorômetro Quantus, sistema QuantiFluor dsDNAPromegaE2670
RNase A/T1 Thermo Fisher CientíficoEN0551misture 2 mg/mL de RNase A 5000 U/mL de RNase T1 
Roti-Aqua P/C/I para extração de DNA Carl RothX985.1
Acetato de sódio Sigma-Aldrich127-09-3
Cloreto de sódio Sigma-Aldrich7647-14-5
Kit de sequenciamento de ligadura SQK-LSK109Tecnologias Oxford NanoporeSem catálogo  númerohttps://nanoporetech.com/document/gDNA-q-sqk-lsk109
Filtros Steritop, 0,22 µ tamanho do poro mMilliporeS2GPT05RE250 mL e 500 mL
Estreptomicina 50 mg/LCarl RothHP66.1
SuccroseNeoFroxx GmbH57-50-1para biologia molecular 
Rotor de Alumínio de Balde OscilanteCiências da Vida Beckman CoulterJS[1]24.15
T4 DNA Ligase 5 U/µ LThermo Fisher Scientific EL0011
Tampão de DNA ligase T4Thermo Fisher Scientific B69
Tubos de ensaio de parede pesada sem aroKarl Hecht GmbH42775054100 mm x 18 mm
Termociclador, T100Biorad1861096
Conforto do ThermomixerEppendorf5382000015
Trizma BaseSigma Aldrich77-86-1
Banho de água, VWB2 VWR462-055712 L de volume

Referências

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