Avaliação das Respostas Foliares a Metabólitos Secundários Microbianos Usando um Formato de Alta Produção

Resumo

Esse protocolo descreve uma abordagem de alto rendimento para avaliar vazamento de íons da planta, atividade da peroxidase e produção de calosas na mesma amostra.

Resumo

Migrorganismos secretam metabólitos secundários estruturalmente diversos durante a infecção das plantas, alguns dos quais são detectados pelas células vegetais, que desencadeiam respostas ao estresse. Neste método, a indução do vazamento de íons, da atividade da peroxidase e da produção de calosas é medida na mesma amostra de disco foliar. Primeiro, Arabidopsis ou discos de folha de cevada são infiltrados a vácuo em uma placa de 96 poços. Após 4-6 horas, a condutividade é medida, seguida pela atividade da peroxidase e deposição de calosa em 24 horas. O peptídeo flg22 induz as três respostas e é um controle positivo acessível. Surfactina e gramilina lipopeptídeos cíclicos induzem atividade peroxidase e vazamento iônico, respectivamente, enquanto o tricoteceno fitotóxico T-2 suprime a atividade da peroxidase. No geral, essa abordagem permite múltiplas comparações entre genótipos de plantas ou tratamentos com metabólitos. Essa abordagem pode ser aplicada à genética química ou bioproteção para identificar compostos moduladores de estresse para estudos adicionais. Na genética vegetal, essa abordagem pode ser usada para comparar respostas entre populações vegetais para mapeamento genético e para melhorar nossa compreensão das interações planta-microrganismo.

Introdução

As plantas respondem a diversas moléculas microbianas para ativar respostas ao estresse celular, o que pode culminar em resistência a doenças. Padrões moleculares (MAMPs) associados a microrganismos, como o peptídeo flg22 da flagelina bacteriana, são detectados pelas proteínas receptoras das plantas para iniciar várias respostas de sinalização celular. Essas incluem respostas precoces como cascatas de quinases, produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), picos de cálcio, despolarização da membrana e respostas tardias como deposição de calosa e indução de atividade^{peroxidase 1}. Os metabólitos secundários microbianos (MSMs) são pequenos (50-1.500 Daltons), moléculas estruturalmente diversas que são dispensáveis para crescimento e desenvolvimento, mas que promovem a sobrevivência do microrganismo. Alguns MSM induzem respostas de estresse celular em plantas, embora os mecanismos envolvidos no início dessas respostas permaneçam não resolvidos ^2,3. Mecanismos propostos para o reconhecimento da MSM por plantas incluem mecanosensição, modificações proteicas induzidas por redox ou sinalização baseada em^{lipídios 4,5}. Em alguns casos, o MSM induz respostas ao estresse ou causa danos celulares, dependendo da concentração. Por exemplo, a toxina T-2 induz a produção de calosa e ROS em 1 μM e causa morte celular em 10 μM, sendo tipicamente descrita como uma^{fitotoxina 4}. Os HSH influenciam a patogênese em algumas interações planta-microrganismo e podem desencadear suscetibilidade ou resistência das plantas. Por exemplo, o lipopeptídeo cíclico gramilina induz a produção de ROS, vazamento de íons e produção de calosa, ao mesmo tempo em que aumenta a suscetibilidade à cevada ao Fusarium^{graminearum 2}. Os lipopeptídeos cíclicos de siringomicina e siringopepitina induzem a produção de ROS das plantas e promovem a resistência do hospedeiro contra a bactéria Pseudomonas fluorescens ³. Outros MSM, como surfactina e iturina, são produzidos por microrganismos não patogênicos e promovem resistência contra infecções subsequentes por patógenos ao induzir respostas de estresse nas^{plantas 6,7}. Esses MSM bioprotetores induzem respostas celulares, incluindo fluxos iônicos, produção de ROS, alterações transcricionais e produção de^{calosas 8}. Compreender as interações entre MSM e plantas pode ajudar a determinar o papel do MSM na resistência a doenças e identificar genes hospedeiros que possam ser aproveitados para melhorar a resistência das culturas.

Os métodos atuais para avaliar respostas ao estresse das plantas induzidas pelo MSM normalmente envolvem testar uma resposta ao estresse por^{vez, 8}. Considerando que o MSM secundário pode ser difícil de extrair e uma quantidade limitada de metabólito pode estar disponível, testar múltiplas respostas dentro da mesma amostra pode fornecer garantia de que o MSM tem efeito sobre as células vegetais. Um método de alto rendimento para avaliar explosões ROS apoplásticas é detectar luminescência gerada por luminol oxidado na presença da^{peroxidase 9} de raiz-forte. Infelizmente, a luminescência à base de luminol é extinta por cátions e alguns solventes, limitando o uso desse ensaio para extratos que contêm sais ou para moléculas não polares que precisam ser dissolvidas em DMSO, exigindo um método que funcione com esses^{contaminantes 9}. Para resolver essas questões, estendemos os métodos atuais para avaliar três respostas ao estresse (vazamento iônico, atividade da peroxidase e calose) da mesma amostra foliar em um ensaio de alto rendimento (Figura 1)10,11,12. Nossa abordagem envolve o tratamento de discos foliares com MSMs usando infiltração a vácuo em uma placa de 96 poços. Em seguida, as medições de condutividade são feitas entre 4 e 6 horas após o tratamento para avaliar o vazamento iônico, seguidas por medições de atividade peroxidase e deposição de calosa às 24 horas. Nossa abordagem foi otimizada para Arabidopsis e cevada, mas poderia ser estendida para outras espécies de plantas com validação experimental. Por exemplo, a atividade induzida da peroxidase de cevada não é detectável com esse método, mas a supressão da atividade por compostos tóxicos pode ser detectada. Assim, as características foliares ou a amplitude da resposta induzida variam entre as espécies, o que limita a aplicabilidade dessa abordagem a algumas espécies de plantas.

O desenho experimental usando esse método deve levar em conta os controles, a replicação e a concentração de MSM usados para garantir os melhores resultados. Um controle negativo é essencial para identificar HSH que induzem níveis estatisticamente diferentes de resposta ao estresse em comparação com os efeitos das lesões. Idealmente, o controle negativo conteria o mesmo solvente do MSM, mas sem o MSM. Solventes típicos para MSM hidrofóbicos incluem DMSO e metanol, que induzem respostas celulares como a produção de ROS em altas^{concentrações 13,14}. Neste ensaio, observamos um impacto na atividade da peroxidase, onde 10% ou mais de DMSO e metanol bloqueiam a atividade da peroxidase induzida por flg22 (Figura 2). No caso de extratos complexos, pode ser difícil desenvolver um controle negativo sem qualquer MSM quando os metabólitos de interesse são desconhecidos. Em vez disso, fracionar os extratos com base em tamanho, polaridade ou carga permitiria comparações relativas entre frações para identificar a fração que mais induz tensão para análise posterior. Além disso, incluir um controle positivo, como 1 μM flg22 ou 10 μM T-2, garante que o pesquisador possa avaliar se o ensaio está funcionando. Recomendamos incluir quatro réplicas técnicas por tratamento e incluir controles positivos e negativos em cada placa quando múltiplas placas estiverem sendo medidas dentro de um experimento.

No geral, essa abordagem captura três respostas ao estresse das plantas induzidas pelo MSM, oferecendo um método acessível e econômico para pesquisar as interações planta-MSM. O formato de alta produtividade permite que pesquisadores capturem diferenças sutis entre genótipos de plantas ou extratos microbianos dentro da mesma unidade experimental. Isso permite abordagens em nível sistêmico para entender famílias de genes de plantas ou para pesquisar populações de plantas para mapeamento genético. No lado dos microrganismos, essa abordagem pode ser usada para rastrear potenciais compostos bioprotetores ou, em genômica química, identificar compostos que potencializam ou suprimem respostas específicas ao estresse.

Protocolo

1. Preparação e tratamento da amostra

NOTA: Todas as precauções de segurança adequadas e práticas de descarte devem ser tomadas para minimizar o risco para o experimentador e para o meio ambiente.

1. Cultivo de plantas
   1. Cultive Arabidopsis até o estágio de 4 a 5 semanas de idade em uma mistura de solo Cornell (300 turfa: 630 vermiculita: 1 fertilizante de liberação lenta: 4,2 cal) com duas plantas por vaso em 24 vasos por bandeja. Rege as plantas conforme necessário por baixo, adicionando água à bandeja. Ajuste as condições da câmara de crescimento para 21 °C continuamente, com 16 horas de luz e 8 horas de escuridão, mantendo aproximadamente 30-50% de umidade. Use as folhas totalmente expandidas de 5 a 9 para experimentação e colheita pela manhã.
   2. Cultive cevada até que a primeira e a segunda folhas verdadeiras estejam totalmente expandidas em 75 substrato para vasos: 24 terra preta: 1 mistura de solo de cal. Plante uma semente por vaso em 24 lotes por bandeja, regando conforme necessário. Ajuste as condições da câmara de crescimento para 21 ^°C com 16 h de luz e 8 h de escuridão a aproximadamente 30-50% de umidade. Amostre a primeira e a segunda folhas totalmente expandidas e colha pela manhã.
2. Colete três discos foliares por planta usando uma broca de cortiça de 4 mm de diâmetro, evitando a veia central. Evite macerar o tecido usando uma broca afiada com movimento de torção.
3. Coloque imediatamente e suavemente os discos foliares em um poço de uma placa de 96 poços em 196 μL de Milli-Q_{H 2}O estéril. Continue coletando os discos até que o número necessário de amostras seja coletado.
4. Adicione metabólitos secundários ou tratamentos com solvente na concentração desejada a um volume final de 200 μL em poços individuais.
5. Coloque a placa de 96 poços com a tampa aberta em um pote de sino com um bico a vácuo.
6. Conecte a mangueira de vácuo ao bico do belo do belo e aumente a pressão de vácuo até que o vácuo atinja 9,8 libras/polegada quadrada (normalmente 10 segundos). Repita esse processo mais uma vez.
7. Coloque a tampa na placa e incube em um agitador orbital (55 rpm) sob luz (13 W, 50 μmol∙^m-2∙^s-1) colocada 23 cm acima do shaker por 4 horas.

2. Medições de vazamento de íons

1. Lave a sonda com água Milli-Q e passe levemente com um toque no Kimwipe para secar. Note a leitura de condutividade da água para referência.
2. Em 4-6 horas após o tratamento, amostre e registre a condutividade de poços individuais mergulhando a sonda no líquido ao redor do disco da folha. Segure a placa em um ângulo de 45° para garantir que a sonda esteja totalmente emersida.
3. Enxágue a sonda entre as amostras mergulhando em água Milli-Q e secando a sonda em um Kimwipe. Ocasionalmente, teste a condutividade da água para garantir que as leituras da sonda permaneçam estáveis.
4. Coloque um filme plástico de vedação na placa e retorne ao agitador orbital para incubação durante a noite.

3. Medições da atividade da peroxidase

1. Prepare o substrato de peroxidase fresco diariamente como uma solução de 50 mL. Aqueça 40 mL de água estéril destilada a 70 ^°C em um béquer com uma barra de mistura e dissolva 50 mg de ácido 5-aminosalicílico (1 mg/mL) na água aquecida. Adicione água até 50 mL e ajuste o pH para 6 usando NaOH. A solução é sensível à luz, então cubra com papel alumínio ou use um tubo âmbar.
2. Em um tubo cônico âmbar de 50 mL, faça uma solução de 1% H_2O2 adicionando 1,7 mL de 30% H_{2O 2} a 48,3 mL de Milli-Q_{H 2}O.
3. Imediatamente antes do ensaio, adicione 10 μL da solução 1%_H2O2 por mililitro de solução 5-aminosalicílica necessária para que o ensaio gere o meio do ensaio.
4. Para amostrar os discos foliares tratados, retire 50 μL de cada poço no ponto de tempo desejado. Transfira para uma placa clara, de fundo plano e com 96 poços, e adicione 50 μL do meio de ensaio, misturando por pipeteamento 5x.
5. Incube a reação em temperatura ambiente por 3 minutos e pare a reação adicionando 20 μL de NaOH 2 N, batendo suavemente para misturar.
6. Meça a absorção dos poços a 595 nm em um leitor de placas.

4. Imagem calosa e análise de imagem

1. Após amostrar os poços para o ensaio de peroxidase, remova o líquido restante dos poços e adicione 100 μL de uma solução de ácido acético:etanol (1:3) para fixação e descoloração. Coloque uma tampa na placa e incube a placa em um shaker (60 rpm) em uma exaustão por 24 horas em temperatura ambiente.
2. Substitua a solução de desmanchação por uma solução fresca e incube por mais 24 horas em temperatura ambiente.
3. Pipete a solução de descoloração e adicione 100 μL de 150 mM_{K 2HPO 4} em cada poço. Coloque o prato no coitel e incube por 30 minutos em temperatura ambiente.
4. Remova a solução de lavagem K_{2HPO 4} e adicione 100 μL de 150 mM K₂HPO₄ com 0,1 mg/mL azul de anilina. Cubra a placa de 96 poços com uma tampa e papel alumínio e incube em um shaker por pelo menos 2 horas (Arabidopsis) ou durante a noite (cevada).
   NOTA: O azul de anilina é sensível à luz e deve ser feito fresco para cada réplica técnica.
5. Remova a solução de azul de anilina e substitua por glicerol 50%. Cubra as placas de 96 poços com papel alumínio e armazene a 4 °C até estar pronto para a imagem.
6. Coloque uma gota de solução de glicerol 50% sobre uma lâmina de vidro limpa. Pegue delicadamente um disco de folha com uma pinça e coloque-o com o lado abaxial para cima sobre o ferrolho. Cubra com uma capa de cobertura de 1,5, minimizando bolhas de ar, e adicione 50% de glicerol adicional se necessário para preencher por baixo da capa de cobertura.
7. Coloque o material da folha em foco usando luz branca transmitida (campo brilhante) sob uma lente objetiva seca 20x.
8. Selecione o comprimento de onda de excitação para 370 nm e o comprimento de onda de emissão para 509 nm para imagem azul de anilina e defina um tempo de exposição. Otimize o tempo de exposição para permitir sinal suficiente, mas evite a supersaturação dos pixels. Para comparação quantitativa de imagens, certifique-se de que a intensidade do laser e o tempo de exposição sejam consistentes para todas as réplicas biológicas, tratamentos e réplicas técnicas.
9. Para cada disco folha, selecione três campos de visão diferentes e adquira imagens para cada um usando os parâmetros definidos no passo 4.8. Adquira todas as imagens com material vegetal preenchendo completamente o campo de visão com regiões mínimas de fundo (material não vegetal). Adquira imagens em um único plano z na superfície da folha.
   NOTA: Ter algum fundo pode ser inevitável e pode ser corrigido em etapas posteriores de quantificação da imagem. Neste exemplo, as imagens são tiradas usando um microscópio de epifluorescência vertical com uma lâmpada de mercúrio e o cubo filtro DAPI (excitação 360/40 nm, emissão 460/50 nm). Em casos em que uma lâmpada de mercúrio não está disponível, pode-se usar uma fonte de luz LED de múltiplos comprimentos de onda.
10. Para quantificar manchas de calosa a partir de imagens, baixe e instale o software de processamento de imagens FIJI disponível gratuitamente usando as instruções online em https://imagej.net/Fiji/Downloads. Abra o FIJI e importe as imagens do azul anilina para análise. Para essa análise, use arquivos .tiff com resolução de pelo menos 300 dpi. Exporte arquivos de imagem em .tiff formato usando o software do microscópio antes da análise, ou deixe o FIJI abrir os arquivos.
    NOTA: Fiji pode abrir a maioria dos tipos de arquivos proprietários (por exemplo, .czi, .nd2, .lif, .vsi).
11. Defina a escala da imagem (clique em Analisar | Set Scale), usando os valores de distância do sistema do microscópio.
12. Converta a imagem para uma imagem em tons de cinza de 32 bits (clique em Imagem | Tipo | 32 bits).
13. Ajuste o limiar (clique em Imagem | Ajustar | Threshold) para incluir apenas o sinal de fluorescência que representa a coloração azul de anilina clicando em Auto e ajustando manualmente os valores mínimo e máximo na curva de limiar. Assim que o limite for finalizado, clique em Aplicar | Converter para Máscara. Usando um software de planilha, escreva os parâmetros de limiar selecionados para cada imagem.
    NOTA: Devido à autofluorescência inerente das amostras vegetais e à eliminação do tecido vegetal, o limiar pode variar entre as amostras. Para a reprodutibilidade, é essencial registrar o limiar de cada imagem e ser consistente no ajuste dos valores de limiar entre as amostras.
14. Quantifique o número e o tamanho dos pontos do azul de anilina usando Analisar Partículas (clique em Analisar | Analisar partículas) usando as configurações padrão. Para ver valores médios de todos os pontos na imagem, selecione Resumir na caixa pop-up e depois clique em OK.
15. Copie e cole esses resultados da caixa Resumo na planilha com os parâmetros de limiar para análise adicional. Os valores incluídos nessa quantificação incluem a Contagem (número de pontos azul de anilina), Área total (área total em unidades² de pontos azul de anilina), Tamanho médio (tamanho médio em^{unidades 2} de pontos azul de anilina), %Área (porcentagem de cobertura média nas^{unidades 2} de fluorescência azul anilina versus área total), Perímetro (perímetro médio dos pontos) e IntDen (indicação da intensidade de fluorescência da coloração azul de anilina).
16. Repita os passos 4.11-4.15 para todas as imagens adquiridas durante o experimento. Ao fechar uma imagem com limite do FIJI, selecione Não Salvar para evitar alterar a imagem de dados brutos para ter a máscara de limiar.
17. Se alguma imagem contiver área com fundo não vegetal, meça a área do tecido vegetal delineando manualmente a região do tecido vegetal usando as ferramentas de seleção Polygon ou Freehand e medindo a Área ( clique em Analisar | Medida). Copie esse valor para a planilha de cada imagem.
18. Em uma planilha, faça a média dos valores das três imagens de campo de visão de uma réplica biológica. Se algumas imagens do experimento conterem área não vegetal (veja o passo 4.17), corrija todos os valores com base na área do tecido vegetal em cada imagem. Por exemplo, divida o valor de contagem pela área de tecido vegetal de cada imagem antes de fazer gráficos e comparações estatísticas.

5. Análise de dados

1. Avalie a qualidade do experimento comparando controles positivos com controles negativos dentro da mesma placa usando um teste t. Se os controles positivos não produziram mudanças significativas nas respostas ao estresse, reavalie condições experimentais como a saúde das plantas, o momento do tratamento, o controle negativo e a possível deterioração dos HSH.
2. Testes de significância
   1. Se todas as réplicas técnicas de um tratamento forem avaliadas dentro da mesma placa, analise as diferenças entre tratamentos individuais e o controle negativo usando abordagens estatísticas padrão, como uma ANOVA unidirecional com teste de Tukey.
   2. Se réplicas técnicas de um tratamento foram avaliadas em múltiplas placas, normalize cada amostra em relação ao controle negativo para minimizar a influência do erro placa-termo. Divida cada valor pela média das amostras controle negativas dentro da mesma placa. Submeta os valores normalizados a métodos estatísticos padrão.

Resultados

Usando esse método, é possível determinar se um MSM ativa um subconjunto das respostas ao estresse celular das plantas. Os resultados desse ensaio fornecem quantificação da atividade da peroxidase, vazamento de íons e produção de calosas para determinar se um MSM induz respostas diferenciais em comparação com um controle negativo. Um resultado positivo para um composto seria indicado por uma diferença significativa em relação ao controle negativo, como mostrado para o ionóforo gramilina, que induz vazamento iônico e produção de calosas (Figura 3)². Incluir um controle positivo, como 1 μM flg22, que induz as três respostas, garante desempenho intacto da planta e condições experimentais (Figura 3)^11,15. Gramillin e FLG22 são dissolvidas em água, enquanto a surfactina hidrofóbica e a toxina T-2 são dissolvidas em DMSO. Para preparar moléculas hidrofóbicas, primeiro preparamos um estoque de 10 mM em DMSO. Esse estoque é usado para criar uma concentração final de 10 μM em água Milli-Q para tratamento foliar que contém 0,1% de DMSO. Surfactina (10 μM) induz atividade de peroxidase e callose, enquanto a toxina T-2 (10 μM) suprime a atividade da peroxidase e induz a produção de calosa, provavelmente devido à morte celular ^2,6,16. O uso de água ou DMSO de 0,1% como controles negativos é apropriado para os tratamentos indicados, pois ambos os controles produzem resultados semelhantes (Figura 2).

Em nossas triagens preliminares de 100 MSM comercialmente disponíveis, vemos indução calosa para a maioria dos compostos que pesquisamos (>70%), enquanto vazamento iônico e atividade de peroxidase são desencadeados por menos compostos (30% e 35%). A maioria desses compostos é produzida por espécies de Fusarium , incluindo sete tricotecenos diferentes, como o desoxinivalenol (DON) e a toxina T-2. Embora a replicação adicional esteja em andamento para confirmar esses resultados, eles indicam tendências semelhantes às observadas em nossos controles positivos (Figura 3), onde a calosa foi induzida por todos os tratamentos e vazamento de íons ou peroxidase foi desencadeada por alguns, mas não todos os tratamentos.

Figura 1: Visão geral do procedimento para avaliar as respostas celulares induzidas pelo MSM em folhas. Os discos foliares são colocados em uma placa de 96 poços contendo os tratamentos de interesse, e os discos são infiltrados a vácuo. Cada placa contém quatro réplicas de um controle negativo (água com solvente) e um controle positivo (toxina flg22 ou T-2). Após 4-6 horas, a condutividade do líquido ao redor do disco da folha é medida como uma quantificação do vazamento de íons. Após 24 horas, a atividade da peroxidase é quantificada usando um ensaio colorimétrico usando o líquido ao redor do disco foliar, e o disco foliar é descolorido e processado para quantificação de calosa. Abreviação: MSM = metabólito secundário microbiano. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Efeito do solvente sobre o vazamento de íons induzido por flg22 ou atividade de peroxidase. Quatro amostras replicadas de Arabidopsis foram tratadas com 1 μM flg22 combinado com DMSO ou metanol (0, 0,01, 0,1, 1, 10%). Gráficos de barras mostram a condutividade média da amostra após 4 h ou a atividade da peroxidase (OD₆₀₀) após 24 h após o tratamento de um único experimento (n = 4, DS). O experimento foi repetido duas vezes com resultados semelhantes. A diferença significativa em relação ao controle da água foi determinada pelo teste t e indicada por um asterisco (p < 0,05). Abreviações: DMSO = dimetil sulfóxido; MeOH = metanol. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Indução de vazamento de íons, atividade de peroxidase ou deposição de calosa em discos foliares de Arabidopsis por moléculas derivadas de microbianos. Os tratamentos incluíram o peptídeo imunogênico e não tóxico flg22 (1 μM), os lipopeptídeos cíclicos gramilina e surfactina (10 μM), e a toxina T-2 (10 μM^)2,6. Todos os dados foram normalizados para o controle DMSO da água + 0,1%. Gráficos de caixa e bigode mostram a condutividade da amostra após 4 horas, a atividade da peroxidase (OD₆₀₀) após 24 horas, ou o número de depósitos de calosa após 24 horas de um único experimento (n = 4-16 plantas). Os gráficos de caixa indicam um 'x' para mostrar o valor da média, e as caixas indicam o primeiro quartil, mediana e terceiro quartil de tratamento. As observações mais altas e menores que não são exceções são indicadas pelos bigodes (>intervalo interquartil de 1,5x, indicado por círculos). A diferença significativa em relação ao controle da água é indicada por um asterisco e foi determinada por ANOVA unidirecional com teste de Tukey (p < 0,05). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Discussão

Comunidades microbianas colonizadoras de plantas secretam diversos MSMs para facilitar a formação de biofilmes, suprimir microrganismos concorrentes e influenciar o hospedeiro^{vegetal 17}. Enquanto alguns HSH não têm impacto na planta, outros induzem morte celular rápida, suprimem a função celular ou induzem resistência à planta¹⁷. Alguns MSM influenciam a resistência das plantas ao microrganismo produtor de MSM, e genótipos resistentes podem ser selecionados com base na insensibilidade^{aos MSM 2,3,18}. Outros HSH induzem resistência sistêmica e oferecem proteção contra patógenos microbianos, o que tem sido usado na agricultura para desenvolver produtos bioprotetores para suprimir a^{doença 8}. Para desenvolver estratégias eficazes e sustentáveis de melhoria de culturas, é essencial identificar os MSMs benéficos e os genes das plantas que possibilitam a resposta ótima ao MSM.

Encontrar MSMs benéficos é complicado pelo fato de que esses compostos são produzidos enzimaticamente, onde múltiplas enzimas são necessárias para o produto^{final 2}. Isso dificulta determinar qual gene atingir para abolir a produção de HSH em estudos genéticos. A biossíntese enzimática resulta em múltiplas variações estruturais do mesmo MSM com bioatividades potencialmente^{diferentes 19}. Separar e purificar esses MSMs para encontrar as moléculas bioativas pode ser demorado ou impossível. Em alguns casos, apenas baixas concentrações de MSMs individuais podem ser purificadas, exigindo múltiplas rodadas de^{purificação 2}. Uma vez obtido um composto ou extrato bioativo, várias abordagens podem ser usadas para entender como o microrganismo pode estar afetando a planta.

Esforços anteriores têm se concentrado no monitoramento do impacto do MSM na reprogramação transcricional ou bioproteção em^{plantas-modelo 20}. Para avaliar as respostas dos MSM além das plantas-modelo, ensaios de alto rendimento que capturam respostas a diversos MSMs e exigem mínimos MSMs são potencialmente úteis. Trabalhos recentes indicam que os surtos ROS são uma resposta precoce comum aos HSH, incluindo gramilina, surfactina, siringomicina e siringopepitina ^2,3,7. Um ensaio à base de luminol detecta o surto apoplástico de ROS gerado por peroxidases e oxidases de NADPH e é passível de testes de alta produtividade²¹. Infelizmente, ROS intracelulares induzidas por HSH, como a surfactina, não são detectáveis usando esse^{método 7}. Quantificar a atividade da peroxidase oferece uma alternativa mais sensível do que o ensaio baseado em luminol para detectar a ativação transitória das enzimas produtoras de ROS durante o^{estresse 11}. Nossa observação de que a surfactina induz a atividade da peroxidase está alinhada com trabalhos recentes que mostraram que a atividade da peroxidase é desencadeada pela surfactina e pela beauvericina na Arabidopsis (Figura 3)². Além disso, mostramos que flg22 e o ionóforo gramilina induziram vazamento iônico, e todos os compostos testados, incluindo flg22, toxina T-2, surfactina e gramillina, induzem calosa como esperado (Figura 3^)2,4,7.

Ao avaliar múltiplas respostas dentro da mesma amostra, minimizamos a variação experimental na avaliação separada de cada um desses traços e possibilitamos a correlação entre características para estudos em nível sistêmico sobre respostas ao estresse das plantas. Avaliar múltiplos tratamentos ou genótipos dentro da mesma unidade experimental também possibilita a fenotipagem em nível populacional para genética populacional. Por exemplo, uma abordagem semelhante foi usada para identificar um QTL subjacente à produção de ROS induzida por flg22 na^{cevada 22}. Esse ensaio também pode ser usado em triagens de genética química para encontrar moduladores das respostas ao estresse das plantas ou para identificar potenciais MSMs bioprotetores a partir de extratos microbianos.

Para garantir que o método experimental funcione dentro do sistema de interesse, os pesquisadores devem considerar os seguintes fatores e limitações:

Qualidade do tecido foliar
Certifique-se de que o tecido das folhas da planta não seja estressado antes da colheita. Os sinais de estresse das plantas variam entre as espécies, mas geralmente incluem murchamento, amarelecimento amarelado, vermelhidão, manchas, excesso de enrolamento ou enrolamento excessivo das folhas. A amostragem de tecido foliar causa ferimentos, então evitar a maceração excessiva do tecido reduzirá o erro de fundo devido ao manuseio.

Espécies de plantas
Esse protocolo é otimizado para uso com cevada e folhas de Arabidopsis. As folhas de cevada requerem um tempo de coloração maior para calosas do que Arabidopsis, provavelmente devido à cera cuticular mais espessa das gramíneas, o que aumenta a hidrofobicidade e limita a difusão dos tratamentos para a^{folha 23}. Isso também pode explicar parcialmente a ausência de indução de atividade da peroxidase usando nosso método, embora tenhamos observado supressão da atividade da peroxidase por compostos tóxicos semelhante ao que apresentamos em Arabidopsis (Figura 3). Tentamos aumentar o número de discos foliares por amostra para 5, ajustando o pH para 5, 6 ou 7, aumentando o número de infiltrações no vácuo para 10 e modificando a concentração do substrato ou mudando o substrato para guaiacol²⁴. Embora tenhamos observado aumento da atividade da peroxidase com mais discos foliares e rodadas de infiltração, as diferenças entre o controle negativo e o flg22 permaneceram pequenas (aumento de 10% com flg22) ou não significativas entre os experimentos. Sabemos que a cevada responde à flg22 induzindo a produção de ROS, a produção de calosas e a expressão^{de peroxidase 25,26}. Nas raízes de milho, extratos proteicos apresentaram atividade de peroxidase induzida por MAMP, sugerindo que a extração de proteína pode ser necessária para observar a indução, em vez de detectar a atividade proteica que se infiltra nos discos foliares, como é feito em nosso^{ensaio 24}. Em nosso ensaio, a ferida claramente induz atividade de peroxidase na amostra controle negativa, pois essa atividade desaparece quando as células morrem devido à exposição à toxina. É possível que o tratamento com FLG22 induza as mesmas peroxidases que a ferida, de modo que pareceria que nenhuma indução ocorreu. Alternativamente, nosso ensaio pode não ser sensível o suficiente para detectar mudanças sutis, ou as peroxidases podem não estar se difundindo bem na solução.

Para aplicar esse protocolo a outras espécies de plantas, sugerimos usar o método conforme descrito e incluir Arabidopsis como controle para garantir que o protocolo esteja funcionando. Se a atividade da peroxidase parecer baixa, então aumentar o número de discos foliares por amostra, aumentar o número de infiltrações a vácuo para 5 ou 10 e tentar diferentes tratamentos, incluindo outros MAMPs, ionóforos ou toxina T-2, pode trazer um resultado positivo.

Tratamentos de controle negativo
Esse método depende de um controle negativo eficaz e apropriado para comparações. Idealmente, um controle negativo conteria o mesmo solvente de fundo do tratamento de MSM de interesse, mas sem MSM. O solvente de fundo seria água ou teria o mesmo impacto nas tensões medidas que a água. Essa é uma abordagem prática em casos em que o MSM já está purificado e pode ser dissolvido em um solvente de sua escolha. Ao comparar extratos microbianos, um controle negativo pode ser o subproduto da purificação parcial do MSM, contendo o mesmo meio de fundo, mas com concentração reduzida de MSM após fracionamento. Ou o experimentador pode usar o meio de cultivo usado para gerar o extrato contendo MSM como controle negativo. Nessas amostras mais complexas, o controle negativo pode conter sais que inflam a medição de condutividade, ou solventes podem suprimir a atividade da peroxidase (Figura 2). Para determinar se os sais estão influenciando os resultados do vazamento de íons, o experimentador poderia testar a condutividade do controle negativo e da amostra na ausência de um disco foliar para determinar se a amostra ou a folha está gerando mudanças na condutividade. Para determinar se os solventes estão afetando as respostas da peroxidase, o experimentador pode adicionar flg22 ao controle negativo e comparar o resultado com o flg22 dissolvido em água para determinar se há diferença. É possível que solventes, compostos tingidos ou sais excessivos em um controle negativo possam obscurecer os efeitos do MSM nas respostas ao estresse vegetal descritas e, portanto, essa abordagem não será adequada em todos os cenários.

Tempo de amostragem
É importante iniciar os tratamentos pela manhã, pois as respostas de defesa induzíveis seguem um ciclo circadiano e têm a maior amplitude no início da^{manhã 27}. Em nossa experiência, Arabidopsis produz vazamento de íons em resposta à gramilina mais rápido (4 h) do que cevada e milho (4-7 h), e, portanto, pode ser necessário um curso temporal para estabelecer parâmetros^{experimentais 2,28}. A resposta celular diminui com o tempo, e não recomendaríamos testar respostas ao estresse além de 30+ horas após o tratamento.

Concentração
A concentração de MSM pode ter um impacto não linear na indução das respostas ao estresse das plantas, um fenômeno chamado^{hormese 20}. Dependendo da disponibilidade e solubilidade do MSM, os experimentadores idealmente testariam as respostas ao estresse das plantas em uma variedade de concentrações de MSM. As concentrações típicas variam entre 100 nM e 1.000 μM como ponto de partida^{2, 11, 20}.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ácido 5-aminosalicílico	Millipore Sigma	A79809
Bomba de vácuo Barnart	Grupo de Tecnologia Artesanal	400-3910
Sonda de microcondutividade COND-905	Lazar Research Laboratories Inc.
Peptídeo FLG22	AnaSpec	AS-62633
Infinite 200PRO F	TeCan Group Ltd.	30190086
Surfactina	Sigma-Aldrich	S3523
Toxina T-2	Cayman Chemical Company Inc	20433