Estabelecimento e Avaliação de um Modelo Murino Induzido por Extrato Solúvel em Água de Candida albicans de Arterite Coronária Associada à Doença de Kawasaki

A doença de Kawasaki (DK), uma forma de síndrome dos linfonodos mucocutâneos, é uma doença autoimune que ocorre em crianças menores de 5 anos e é acompanhada por vasculite febril ^1,2,3. Estudos indicam que ciclos não tratados ou de tratamento superiores a 10 dias de DK grave são propensos a induzir complicações cardiovasculares graves, incluindo principalmente aneurismas coronarianos e estenose da artéria coronária ^4,5. A ruptura de aneurismas coronarianos pode levar ao choque cardiogênico ou mesmo à morte súbita, que é a principal causa de cardiopatia adquirida em crianças ^6,7. Embora a aplicação de imunoglobulina intravenosa tenha melhorado significativamente o prognóstico, sua etiologia e patogênese permanecem obscuras, o que restringe o desenvolvimento de estratégias terapêuticas direcionadas ^8,9. Portanto, o estabelecimento de modelos animais que possam simular com precisão as características das doenças humanas tornou-se uma necessidade urgente para as pesquisas atuais.

Atualmente, um grande obstáculo na pesquisa da doença de Kawasaki é a ausência de modelos animais bem caracterizados que recapitulem totalmente a patologia da doença humana. Dentre os vários modelos desenvolvidos atualmente, o modelo de vasculite induzida pelo extrato de parede celular de Lactobacillus casei (LCWE) é um sistema relativamente maduro, podendo causar arterite coronariana. É amplamente utilizado para estudar o mecanismo de desregulação imunológica e citocinas específicas em vasculites semelhantes à DK^10,11. O modelo de vasculite induzida pelo extrato hidrossolúvel de Candida albicans (CAWS) também tem atraído muita atenção devido à sua alta semelhança com as características patológicas da doença de Kawasaki humana^12,13. Após otimização e melhoria sistemáticas por várias equipes de pesquisa, o modelo induzido por CAWS tornou-se uma ferramenta importante para a pesquisa da doença de Kawasaki¹⁴. Embora o CAWS possa induzir inflamação da artéria coronária por meio de injeção intraperitoneal, ele tem limitações, pois não pode reproduzir totalmente o processo patológico exato da vasculite humana por DK. Por exemplo, nenhum neutrófilo foi encontrado na patologia tardia da DK^{humana 15}, mas a infiltração de neutrófilos ainda ocorreu neste modelo até 16 semanas após a injeção de CAWS¹⁶. Além disso, o mecanismo de vasculite causada pela CAWS não foi totalmente esclarecido no momento, o que limita a compreensão e aplicação aprofundadas do modelo⁹. Este estudo tem como objetivo estabelecer um modelo animal padronizado de DK, otimizando o protocolo de indução de CAWS, elucidando o mecanismo da doença e facilitando o desenvolvimento de terapias direcionadas.

Este estudo utilizou o CAWS para estabelecer um modelo animal mais padronizado da doença de Kawasaki. Por meio de experimentos sistemáticos de otimização de dose, foi determinado que a injeção intraperitoneal de 8 mg por dia por cinco dias consecutivos era o regime de administração ideal. Este regime pode induzir lesões nas artérias coronárias de forma estável, mantendo uma alta taxa de sobrevivência em animais. Além disso, exploramos ainda mais o papel da disfunção mitocondrial na formação de fibrose durante a fase crônica da DK, com foco no possível mecanismo do canal aniônico dependente de voltagem 1 (VDAC1), uma proteína chave que regula a apoptose mitocondrial, durante a transição da inflamação para a fibrose¹⁷. Vale ressaltar que, por meio da análise de co-localização autofagossomo/lisossomo neste estudo, foi observada função autofagia anormal neste modelo. Este modelo otimizado fornece uma ferramenta importante para estudar sistematicamente a patogênese das lesões das artérias coronárias na doença de Kawasaki e avaliar novas estratégias de tratamento.

Todos os experimentos de pesquisa envolvendo dados de animais foram aprovados pelo comitê de ética do Hospital Popular Huai'an No.1 Afiliado da Universidade Médica de Nanjing (KY-2024-250-01). Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação do CAWS

1. Inocular Candida albicans em caldo Sabouraud dextrose de acordo com o protocolo estabelecido por Duong et ^al.18. Em seguida, cultivar o caldo inoculado anaerobicamente a 37 °C durante 48 h numa câmara anaeróbia selada com uma mistura de gases.
   NOTA: Para garantir a esterilidade do meio de cultura, a condição de cultura anaeróbia a 37 °C deve ser rigorosamente controlada para evitar a contaminação por bactérias diversas.
2. Enxágue repetidamente com meio limitador C e incube a 37 ° C por 48 h a uma velocidade de rotação de 4,5 x g.
3. Adicionar um volume igual de etanol anidro e deixar repousar durante a noite a 4 °C.
4. Centrifugar a 4,5 x g durante 15 min a 4 °C, remover o sobrenadante, adicionar um volume igual de etanol anidro ao precipitado e deixá-lo durante a noite a 4 °C.
5. Após a centrifugação, descartar o sobrenadante, adicionar 50 ml de acetona ao precipitado, centrifugar e secar o precipitado. Dissolva o precipitado em solução salina normal estéril para uso posterior.

2. Construindo um modelo de camundongo da doença de Kawasaki

1. Selecione oitenta camundongos C57BL/6 machos de grau SPF com idades entre 4 e 6 semanas e os aloje em condições controladas com livre acesso a comida e água.
   NOTA: Para minimizar a potencial interferência das flutuações do nível de estrogênio nas respostas imunes e inflamatórias, apenas camundongos machos foram usados neste estudo preliminar de estabelecimento e caracterização^{do modelo 19}.
2. Divida os camundongos em 4 grupos uniformemente pelo método da tabela de números aleatórios, incluindo 3 grupos de injeção de CAWS de dose diferente (4 mg, 8 mg, 12 mg) e 1 grupo de controle de solução salina normal, com 20 camundongos em cada grupo.
3. Prepare o pó de CAWS em três concentrações de 40 mg / mL, 80 mg / mL e 120 mg / mL usando solução salina normal estéril (NaCl a 0,9%). Injetar no grupo experimental 0,1 mL de CAWS pela manhã do 1º ao 5º dia do experimento e administrar um volume igual de solução salina normal ao grupo controle no mesmo horário.
   NOTA: A injeção intraperitoneal foi realizada com uma seringa de insulina de 1 mL. Durante a operação, posicione o mouse com a cabeça mais baixa e a cauda mais alta para evitar danos a órgãos como os intestinos grosso e delgado quando a seringa for inserida.
4. Use uma balança eletrônica às 9h todos os dias para pesar simultaneamente o restante da ração no comedouro e calcular o consumo de alimento de 24 horas para cada gaiola de camundongos.
5. No 3º, 7º, 14º e 28º dias após a última injeção, selecione e sacrifique aleatoriamente 3 camundongos de cada grupo em cada momento.
6. Coloque os ratos em uma câmara fechada pré-cheia de ar ambiente. Introduzir CO₂ comprimido a um caudal de 30% do volume da câmara por minuto. Após 5 min, foi realizada luxação cervical para confirmação do óbito.
7. Colete e pese amostras de coração. Observe lesões inflamatórias do coração e vasos sanguíneos pela coloração HE.

3. Padrões de coloração e classificação HE

1. O coração e o arco aórtico (cerca de 3 mm × 3 mm) foram rapidamente isolados. Realizar esternotomia mediana de acordo com o método^{descrito 20}. Separe rapidamente o coração do arco aórtico (cerca de 3 mm × 3 mm). Os tecidos coletados foram fixados em formol tamponado neutro a 10% por 24 h.
2. Após a fixação, desidratar os tecidos por meio de uma série graduada de etanol (70% de etanol por 1 h, 80% de etanol por 1 h, 95% de etanol por 1 h e 100% de etanol por 1 h), clara em xileno e embebida em parafina. Por fim, divida os blocos em fatias contínuas de 5 μm.
3. Para coloração H & E, pinte as seções com hematoxilina por 5 min, enxágue em água corrente por 10 min, contra-core com eosina por 2 min e, em seguida, prossiga com a desidratação e montagem²¹.
   NOTA: De acordo com o grau de lesão vascular intimal, é classificada em três graus: O grau I é caracterizado principalmente por edema endotelial e agregação de neutrófilos; O grau II se manifesta como degeneração do músculo liso, infiltração de células inflamatórias e danos às organelas; O grau III apresenta lesões graves, como necrose e excreção endotelial e deposição de fibrina.

4. Coloração tricrômica de Masson

1. Após a fixação, desidratar as amostras de tecido através de uma série graduada de etanol, clara em xileno e embebida em parafina.
2. Após a desparafinação, hidratar as secções através de uma série graduada de etanol para água destilada em preparação para a coloração.
3. Manchar os núcleos com hematoxilina de ferro de Weigert por 5 min, enxaguar abundantemente em água corrente e, em seguida, corar o citoplasma com fucsina ácida Lichun Red por 5 min.
4. Diferencie com ácido fosfomolíbdico a 1% por 1 min e, em seguida, core diretamente as fibras de colágeno com azul de anilina por 3 min. Enxágue rapidamente com ácido acético glacial a 1%.
   NOTA: Controle rigorosamente o tempo da etapa de diferenciação para garantir a especificidade da coloração.
5. Após a desidratação com etanol e xileno, tornando-se transparente, sele o filme neutro.
6. Enxágue as seções manchadas em água corrente para remover o excesso de corante.
7. Desidrate as seções através de uma série graduada de etanol, transparente em xileno e monte com goma neutra.
8. Observe as seções sob um microscópio de luz com ampliação consistente. As fibras colágenas devem aparecer azuis, as fibras musculares e o citoplasma vermelhos e os núcleos azuis profundos.

5. Coloração de imunofluorescência

1. Fixe as seções de células ou tecidos e bloqueie com 5% de BSA por 1 h para reduzir a ligação inespecífica.
2. Use soro normal da mesma origem da espécie que o anticorpo secundário, dilua-o com PBS na proporção de 1:10 e coloque-o na amostra. Sele-o em temperatura ambiente por 30 min. Após a selagem, enxágue suavemente duas vezes com PBS.
3. Incubar as secções com o anticorpo primário durante a noite a 4 °C. Após a lavagem com PBS, adicione o anticorpo secundário fluorescente e incube no escuro por 1 h.
4. Coloração do núcleo com DAPI, vedação com agente de montagem anti-têmpera e observação sob microscopia confocal.

6. Imuno-histoquímica

1. Após a desparafinação e hidratação das seções de parafina, realizar o reparo do antígeno e bloquear a peroxidase endógena.
2. Incubação de anticorpos e desenvolvimento de cores: Primeiro, bloqueie com soro normal, depois incube o anticorpo primário e o anticorpo secundário marcado com HRP em sequência e, finalmente, o desenvolvimento da cor DAB. Controle o grau de reação sob um microscópio.
3. Volte a corar os núcleos celulares com hematoxilina. Após a desidratação e transparência, feche as placas e observe o sinal positivo amarelo-acastanhado ao microscópio.
   NOTA: O experimento precisa configurar controles e controlar estritamente as condições de restauração e desenvolvimento de cores.

7. Detecção de autolisossomas

1. Co-cultive macrófagos RAW264.7 com esporos de Candida albicans em uma proporção apropriada (10:1) e incube a 37 °C e 5% de CO₂ por 4 h, 8 h, 12 h, 16 h, 20 h, 24 h, 28 h, 32 h, 36 h, 40 h, 44 h e 48 h para estabelecer um modelo fagocítico.
2. Lave três vezes com PBS pré-resfriado para remover os esporos não fagocíticos.
3. Primeiro, bloqueie as amostras com 5% de BSA por 30 min. Em seguida, incube sucessivamente com o anticorpo primário contra LC3 (diluição 1:200) em temperatura ambiente por 1 h, seguido pelo anticorpo secundário marcado com Alexa Fluor 488 em temperatura ambiente por 30 min.
4. Adicione a sonda de lisossomo Lyso-Tracker Red diretamente às células para visualizar a localização lisossômica. Finalmente, contra-corar os núcleos com DAPI (1 μg / mL) por 5 min.
   NOTA: Todo o processo de operação deve ser realizado no escuro para garantir que o tempo de incubação e a concentração do anticorpo sejam controlados com precisão.

Inicialmente, avaliamos sistematicamente as alterações patológicas miocárdicas induzidas por diferentes doses de CAWS em camundongos. Não foram observadas mortes no grupo controle PBS, no grupo CAWS de 4 mg e no grupo CAWS de 8 mg (n = 20 em cada grupo). Em contraste, a resposta inflamatória no grupo de 4 mg foi leve e não atendeu aos requisitos de modelagem. A taxa de mortalidade foi maior no grupo CAWS de 12 mg (9/20, 45%), e os óbitos ocorreram do 3º ao 10º dia após a injeção. Esses achados sugerem que uma dose de 12 mg pode causar dano inflamatório local excessivo e toxicidade sistêmica. Portanto, essa dose foi excluída de estudos subsequentes. A dose de 8 mg foi finalmente selecionada como o regime de dosagem ideal porque poderia efetivamente induzir arterite coronária significativa, mantendo uma taxa de sobrevivência aceitável e reações adversas locais mínimas. (Figura 1A). Eventualmente, foi determinado que a injeção intraperitoneal de 8 mg de CAWS era a dose ideal de modelagem. Os resultados da coloração HE do grupo experimental mostraram um processo dinâmico típico de inflamação e fibrose. No terceiro dia, ocorreu infiltração inflamatória focal, composta principalmente por neutrófilos e monócitos perivasculares. No sétimo dia, a amplitude inflamatória expandiu-se para o interstício miocárdico, acompanhada de edema significativo das células miocárdicas e edema intersticial. No 14º dia, a inflamação atingiu seu pico, ocorrendo distúrbio do arranjo de fibras miocárdicas e necrose focal. No 28º dia, embora a inflamação tenha sido aliviada, a fibrose precoce se formou (Figura 1B e Figura 2A). Em contraste, a estrutura miocárdica permaneceu normal em todos os momentos no grupo controle. Todos os resultados foram confirmados por meio de uma avaliação duplo-cega, que verificou que uma dose de 8 mg de CAWS poderia induzir de forma estável um modelo de lesão miocárdica compatível com as características da doença de Kawasaki.

Posteriormente, o método de coloração tricolor de Masson foi empregado para investigar se a vasculite semelhante à doença de Kawasaki induzida por CAWS resultaria em fibrose persistente ao redor das artérias coronárias (AC). Os resultados experimentais mostraram que no grupo de injeção de camundongos CAWS, depósitos óbvios de fibras de colágeno foram detectados ao redor das paredes das artérias coronárias inflamadas e da aorta, e essas áreas fibróticas coincidiram altamente com os locais de distribuição da infiltração de células inflamatórias. Em contraste, os camundongos do grupo controle PBS apresentaram apenas coloração fraca de colágeno, que estava confinada dentro da faixa estrutural normal da parede vascular (Figura 2A). A análise quantitativa mostrou que a deposição significativa de fibras colágenas ocorreu em 14 dias, e o grau de fibrose foi estatisticamente diferente do grupo controle (Figura 2C).

Dado que a alteração patológica central na doença de Kawasaki é a resposta imunoinflamatória da parede vascular, que envolve a ação coordenada de múltiplas células imunes22,23, exploramos a seguir as mudanças características do microambiente imunológico no modelo CAWS por meio da coloração por imunofluorescência (IF). No 14º dia após a injeção de CAWS, a coloração IF de marcadores de células imunes foi realizada nos tecidos cardíacos de camundongos injetados com CAWS. Os resultados experimentais mostraram que no 14º dia de modelagem para camundongos no grupo de tratamento CAWS, a infiltração de células T CD3+, células T citotóxicas CD8+, macrófagos do tipo CD86+ M1, macrófagos F4/80+ e células natural killer NK1.1+ nas artérias coronárias e tecidos miocárdicos foi significativamente aumentada em comparação com o grupo controle PBS (Figura 2B,D). Ao analisar sistematicamente as alterações de expressão desses marcadores imunológicos, não apenas verificou que o modelo CAWS poderia simular com precisão as características imunológicas da doença de Kawasaki humana, mas, mais importante, revelou o possível mecanismo de diferentes subconjuntos de células imunes na ocorrência e desenvolvimento da doença, fornecendo uma base teórica para o desenvolvimento subsequente de estratégias de intervenção imune direcionadas.

A pesquisa estabeleceu que a disfunção mitocondrial é um mecanismo chave subjacente à fibrose miocárdica 24,25,26. Reconhece-se que, sob estresse inflamatório, o canal aniônico 1 dependente de voltagem (VDAC1), uma proteína crítica para o controle de qualidade mitocondrial, pode desencadear a abertura anormal dos poros de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTP) quando sua expressão é regulada positivamente. Este, por sua vez, induz a apoptose e ativa os fibroblastos 17,27. Para explorar esse mecanismo, avaliamos a expressão de VDAC1 na fase crônica usando imuno-histoquímica. Nossos achados revelaram que, em comparação com o grupo controle PBS, a expressão da proteína VDAC1 no tecido miocárdico de camundongos no grupo tratado com CAWS foi significativamente elevada 28 dias após a modelagem (Figura 3). Os sinais positivos foram predominantemente localizados em áreas fibróticas e ao redor dos vasos sanguíneos, indicando que a disfunção mitocondrial mediada por VDAC1 pode contribuir para a fibrose miocárdica no modelo da doença de Kawasaki. Esses dados fornecem evidências experimentais sobre os mecanismos moleculares da lesão miocárdica induzida por CAWS.

Estudos anteriores descobriram que a disfunção mitocondrial mediada por VDAC1 está envolvida no processo de fibrose miocárdica da doença de Kawasaki, mas seu mecanismo específico ainda não foi esclarecido. Dado que a manutenção da homeostase mitocondrial depende da função normal do sistema lisossômico de autofagia. Especulamos que o VDAC1 pode exacerbar a fibrose influenciando a formação ou função dos autofagolisossomos, levando ao acúmulo mitocondrial anormal. Para verificar essa hipótese, primeiro estabelecemos um modelo de infecção por esporos de Candida albicans em macrófagos (RAW264.7) (Figura 4) e detectamos as mudanças dinâmicas do fluxo autofágico e da atividade lisossômica no modelo. Os resultados experimentais mostram que a formação de lisossomos de autofagia aumenta no estágio inicial (dentro de 2-3 h após a infecção celular), enquanto o fluxo autofágico é bloqueado no estágio posterior (3-4 h após a infecção celular). A mudança do fluxo de autofagia pode ser avaliada pela mudança da coloração de fusão após a co-localização de autofagossomo e lisossomo. Este resultado confirma que a disfunção dos autofagolisossomos pode realmente levar ao comprometimento da depuração celular.

Figura 1: Análise histopatológica do coração e das artérias coronárias. (A) Curvas de sobrevida de camundongos injetados com PBS ou diferentes doses de CAWS (4 mg, 8 mg e 12 mg; n = 20 por grupo). (B) Os resultados da coloração HE do coração no grupo de tratamento CAWS (8 mg) em diferentes momentos (3 d, 7 d, 14 d, 28 d) foram apresentados. Barras de escala: 1500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Análise da fibrose do colágeno e infiltração de células imunes. (A) Os resultados da coloração de Masson do grupo CAWS 8 mg e do grupo controle. As fibras colágenas apresentam uma cor azul característica, as fibras musculares e o citoplasma são vermelhos e o núcleo da célula é azul escuro. As setas indicam esporos de fungos. Barras de escala: 1500 μm. (B) Resultados da coloração por imunofluorescência do grupo CAWS 8 mg e do grupo controle (células T CD3+ marcadas com CD3, células T CD8+ citotóxicas marcadas com CD8, macrófagos do tipo CD86+ M1 marcados com CD86, macrófagos F4/80+ marcados com F4/80+ e células assassinas naturais NK1.1 marcadas com NK1.1+). Barras de escala: 200 μm. (C) Avalie o grau de fibrose cardíaca. O grau de fibrose cardíaca foi avaliado com base na porcentagem de área de coloração tricromática no tecido cardíaco do campo visual com aumento de 800x. O método específico é o seguinte: Como as fibras colágenas são tingidas de verde brilhante com corantes aniônicos macromoleculares, foram observados 100 campos visuais com aumento de 800 vezes (todas as fatias com espessura de 5 μm), e o grau de fibrose cardíaca foi determinado pela porcentagem de área verde na área total. Quanto maior a porcentagem, mais grave é a fibrose. (D) A porcentagem de células imunes foi analisada estatisticamente de acordo com os resultados da coloração por imunofluorescência,***p < 0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Análise imuno-histoquímica da expressão de VDAC1 no grupo PBS e no grupo CAWS no dia 28. (A) Análise imuno-histoquímica da expressão de VDAC1. Barra de escala: 800 μm. Partículas pretas marrons são resultados positivos. (B) Análise estatística da porcentagem de células VDAC1 imuno-histoquimicamente positivas, p < 0,001. (C) Análise estatística do escore H da imuno-histoquímica VDAC1. Os dados foram derivados de múltiplas réplicas biológicas (n = 20 camundongos por grupo), e os resultados foram expressos como média ± desvio padrão e analisados estatisticamente (***p < 0,001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Detecção de autolisossomo após a fagocitose de Candida albicans por células RAW264.7 de camundongo. (A) As setas indicam esporos de fungos. Barras de escala: 25 μm. A mudança do fluxo de autofagia pode ser avaliada pela mudança da coloração de fusão após a co-localização de autofagossomo e lisossomo. (B) Uma análise de curso de tempo da taxa de formação de autolisossomos quantifica os parâmetros relevantes. Os resultados foram expressos em média ± desvio-padrão e analisados estatisticamente (*** p < 0,001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada a divulgar.