Estabelecimento e Avaliação de um Modelo Murino Induzido por Extrato Solúvel em Água de Candida albicans de Arterite Coronária Associada à Doença de Kawasaki

Resumo

O modelo de camundongo induzido por CAWS simula efetivamente a progressão da doença de Kawasaki da inflamação aguda para a fibrose crônica, revelando as principais características patológicas e imunopatológicas, e pode facilitar o desenvolvimento de estratégias terapêuticas direcionadas para a doença de Kawasaki.

Resumo

A doença de Kawasaki (DK) é uma vasculite sistêmica que afeta principalmente crianças, sendo as lesões nas artérias coronárias sua complicação mais grave. Neste estudo, um modelo otimizado de KD de camundongo foi estabelecido usando o extrato solúvel em água de Candida albicans (CAWS). A inflamação miocárdica e as alterações patológicas relacionadas foram avaliadas usando a coloração HE e a coloração tricrômica de Masson. A técnica de imunofluorescência detectou a infiltração de células imunes no tecido cardíaco. A expressão e localização da proteína VDAC1 no tecido miocárdico foram detectadas por imuno-histoquímica. In vitro, um modelo fagocítico foi estabelecido pela co-cultura de macrófagos RAW264.7 com esporos de Candida albicans , e a formação e função dos autofagolisossomos foram avaliadas usando coloração de imunofluorescência LC3 e uma sonda Lyso-Tracker Red. Por meio da triagem de dose, foi determinado que 8 mg era a dose modeladora ideal para induzir inflamação da artéria coronária, com uma taxa de mortalidade moderada nessa dose. A coloração HE mostrou que a injeção de CAWS induziu de forma estável lesões nas artérias coronárias consistentes com as características da doença de Kawasaki humana em camundongos. A coloração de Masson confirmou que houve deposição significativa de fibras colágenas ao redor das artérias coronárias e aorta no grupo CAWS de camundongos, que coincidiu estreitamente com a área inflamatória, e uma diferença estatisticamente significativa foi observada no grupo controle em 14 dias (p < 0,001). A imunofluorescência revelou que, no 14º dia de modelagem, a infiltração de múltiplas células imunes no tecido cardíaco do grupo CAWS aumentou significativamente (p < 0,001). Os resultados imuno-histoquímicos mostraram que, no 28º dia de modelagem, a expressão da proteína VDAC1 no tecido miocárdico do grupo CAWS foi significativamente regulada positivamente (p < 0,001). Experimentos in vitro mostraram que em macrófagos infectados com esporos de Candida albicans , a formação de autofagolisossomos aumenta no estágio inicial, enquanto o fluxo autofágico é bloqueado no estágio posterior, sugerindo um distúrbio funcional.

Introdução

A doença de Kawasaki (DK), uma forma de síndrome dos linfonodos mucocutâneos, é uma doença autoimune que ocorre em crianças menores de 5 anos e é acompanhada por vasculite febril ^1,2,3. Estudos indicam que ciclos não tratados ou de tratamento superiores a 10 dias de DK grave são propensos a induzir complicações cardiovasculares graves, incluindo principalmente aneurismas coronarianos e estenose da artéria coronária ^4,5. A ruptura de aneurismas coronarianos pode levar ao choque cardiogênico ou mesmo à morte súbita, que é a principal causa de cardiopatia adquirida em crianças ^6,7. Embora a aplicação de imunoglobulina intravenosa tenha melhorado significativamente o prognóstico, sua etiologia e patogênese permanecem obscuras, o que restringe o desenvolvimento de estratégias terapêuticas direcionadas ^8,9. Portanto, o estabelecimento de modelos animais que possam simular com precisão as características das doenças humanas tornou-se uma necessidade urgente para as pesquisas atuais.

Atualmente, um grande obstáculo na pesquisa da doença de Kawasaki é a ausência de modelos animais bem caracterizados que recapitulem totalmente a patologia da doença humana. Dentre os vários modelos desenvolvidos atualmente, o modelo de vasculite induzida pelo extrato de parede celular de Lactobacillus casei (LCWE) é um sistema relativamente maduro, podendo causar arterite coronariana. É amplamente utilizado para estudar o mecanismo de desregulação imunológica e citocinas específicas em vasculites semelhantes à DK^10,11. O modelo de vasculite induzida pelo extrato hidrossolúvel de Candida albicans (CAWS) também tem atraído muita atenção devido à sua alta semelhança com as características patológicas da doença de Kawasaki humana^12,13. Após otimização e melhoria sistemáticas por várias equipes de pesquisa, o modelo induzido por CAWS tornou-se uma ferramenta importante para a pesquisa da doença de Kawasaki¹⁴. Embora o CAWS possa induzir inflamação da artéria coronária por meio de injeção intraperitoneal, ele tem limitações, pois não pode reproduzir totalmente o processo patológico exato da vasculite humana por DK. Por exemplo, nenhum neutrófilo foi encontrado na patologia tardia da DK^{humana 15}, mas a infiltração de neutrófilos ainda ocorreu neste modelo até 16 semanas após a injeção de CAWS¹⁶. Além disso, o mecanismo de vasculite causada pela CAWS não foi totalmente esclarecido no momento, o que limita a compreensão e aplicação aprofundadas do modelo⁹. Este estudo tem como objetivo estabelecer um modelo animal padronizado de DK, otimizando o protocolo de indução de CAWS, elucidando o mecanismo da doença e facilitando o desenvolvimento de terapias direcionadas.

Este estudo utilizou o CAWS para estabelecer um modelo animal mais padronizado da doença de Kawasaki. Por meio de experimentos sistemáticos de otimização de dose, foi determinado que a injeção intraperitoneal de 8 mg por dia por cinco dias consecutivos era o regime de administração ideal. Este regime pode induzir lesões nas artérias coronárias de forma estável, mantendo uma alta taxa de sobrevivência em animais. Além disso, exploramos ainda mais o papel da disfunção mitocondrial na formação de fibrose durante a fase crônica da DK, com foco no possível mecanismo do canal aniônico dependente de voltagem 1 (VDAC1), uma proteína chave que regula a apoptose mitocondrial, durante a transição da inflamação para a fibrose¹⁷. Vale ressaltar que, por meio da análise de co-localização autofagossomo/lisossomo neste estudo, foi observada função autofagia anormal neste modelo. Este modelo otimizado fornece uma ferramenta importante para estudar sistematicamente a patogênese das lesões das artérias coronárias na doença de Kawasaki e avaliar novas estratégias de tratamento.

Protocolo

Todos os experimentos de pesquisa envolvendo dados de animais foram aprovados pelo comitê de ética do Hospital Popular Huai'an No.1 Afiliado da Universidade Médica de Nanjing (KY-2024-250-01). Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação do CAWS

1. Inocular Candida albicans em caldo Sabouraud dextrose de acordo com o protocolo estabelecido por Duong et ^al.18. Em seguida, cultivar o caldo inoculado anaerobicamente a 37 °C durante 48 h numa câmara anaeróbia selada com uma mistura de gases.
   NOTA: Para garantir a esterilidade do meio de cultura, a condição de cultura anaeróbia a 37 °C deve ser rigorosamente controlada para evitar a contaminação por bactérias diversas.
2. Enxágue repetidamente com meio limitador C e incube a 37 ° C por 48 h a uma velocidade de rotação de 4,5 x g.
3. Adicionar um volume igual de etanol anidro e deixar repousar durante a noite a 4 °C.
4. Centrifugar a 4,5 x g durante 15 min a 4 °C, remover o sobrenadante, adicionar um volume igual de etanol anidro ao precipitado e deixá-lo durante a noite a 4 °C.
5. Após a centrifugação, descartar o sobrenadante, adicionar 50 ml de acetona ao precipitado, centrifugar e secar o precipitado. Dissolva o precipitado em solução salina normal estéril para uso posterior.

2. Construindo um modelo de camundongo da doença de Kawasaki

1. Selecione oitenta camundongos C57BL/6 machos de grau SPF com idades entre 4 e 6 semanas e os aloje em condições controladas com livre acesso a comida e água.
   NOTA: Para minimizar a potencial interferência das flutuações do nível de estrogênio nas respostas imunes e inflamatórias, apenas camundongos machos foram usados neste estudo preliminar de estabelecimento e caracterização^{do modelo 19}.
2. Divida os camundongos em 4 grupos uniformemente pelo método da tabela de números aleatórios, incluindo 3 grupos de injeção de CAWS de dose diferente (4 mg, 8 mg, 12 mg) e 1 grupo de controle de solução salina normal, com 20 camundongos em cada grupo.
3. Prepare o pó de CAWS em três concentrações de 40 mg / mL, 80 mg / mL e 120 mg / mL usando solução salina normal estéril (NaCl a 0,9%). Injetar no grupo experimental 0,1 mL de CAWS pela manhã do 1º ao 5º dia do experimento e administrar um volume igual de solução salina normal ao grupo controle no mesmo horário.
   NOTA: A injeção intraperitoneal foi realizada com uma seringa de insulina de 1 mL. Durante a operação, posicione o mouse com a cabeça mais baixa e a cauda mais alta para evitar danos a órgãos como os intestinos grosso e delgado quando a seringa for inserida.
4. Use uma balança eletrônica às 9h todos os dias para pesar simultaneamente o restante da ração no comedouro e calcular o consumo de alimento de 24 horas para cada gaiola de camundongos.
5. No 3º, 7º, 14º e 28º dias após a última injeção, selecione e sacrifique aleatoriamente 3 camundongos de cada grupo em cada momento.
6. Coloque os ratos em uma câmara fechada pré-cheia de ar ambiente. Introduzir CO₂ comprimido a um caudal de 30% do volume da câmara por minuto. Após 5 min, foi realizada luxação cervical para confirmação do óbito.
7. Colete e pese amostras de coração. Observe lesões inflamatórias do coração e vasos sanguíneos pela coloração HE.

3. Padrões de coloração e classificação HE

1. O coração e o arco aórtico (cerca de 3 mm × 3 mm) foram rapidamente isolados. Realizar esternotomia mediana de acordo com o método^{descrito 20}. Separe rapidamente o coração do arco aórtico (cerca de 3 mm × 3 mm). Os tecidos coletados foram fixados em formol tamponado neutro a 10% por 24 h.
2. Após a fixação, desidratar os tecidos por meio de uma série graduada de etanol (70% de etanol por 1 h, 80% de etanol por 1 h, 95% de etanol por 1 h e 100% de etanol por 1 h), clara em xileno e embebida em parafina. Por fim, divida os blocos em fatias contínuas de 5 μm.
3. Para coloração H & E, pinte as seções com hematoxilina por 5 min, enxágue em água corrente por 10 min, contra-core com eosina por 2 min e, em seguida, prossiga com a desidratação e montagem²¹.
   NOTA: De acordo com o grau de lesão vascular intimal, é classificada em três graus: O grau I é caracterizado principalmente por edema endotelial e agregação de neutrófilos; O grau II se manifesta como degeneração do músculo liso, infiltração de células inflamatórias e danos às organelas; O grau III apresenta lesões graves, como necrose e excreção endotelial e deposição de fibrina.

4. Coloração tricrômica de Masson

1. Após a fixação, desidratar as amostras de tecido através de uma série graduada de etanol, clara em xileno e embebida em parafina.
2. Após a desparafinação, hidratar as secções através de uma série graduada de etanol para água destilada em preparação para a coloração.
3. Manchar os núcleos com hematoxilina de ferro de Weigert por 5 min, enxaguar abundantemente em água corrente e, em seguida, corar o citoplasma com fucsina ácida Lichun Red por 5 min.
4. Diferencie com ácido fosfomolíbdico a 1% por 1 min e, em seguida, core diretamente as fibras de colágeno com azul de anilina por 3 min. Enxágue rapidamente com ácido acético glacial a 1%.
   NOTA: Controle rigorosamente o tempo da etapa de diferenciação para garantir a especificidade da coloração.
5. Após a desidratação com etanol e xileno, tornando-se transparente, sele o filme neutro.
6. Enxágue as seções manchadas em água corrente para remover o excesso de corante.
7. Desidrate as seções através de uma série graduada de etanol, transparente em xileno e monte com goma neutra.
8. Observe as seções sob um microscópio de luz com ampliação consistente. As fibras colágenas devem aparecer azuis, as fibras musculares e o citoplasma vermelhos e os núcleos azuis profundos.

5. Coloração de imunofluorescência

1. Fixe as seções de células ou tecidos e bloqueie com 5% de BSA por 1 h para reduzir a ligação inespecífica.
2. Use soro normal da mesma origem da espécie que o anticorpo secundário, dilua-o com PBS na proporção de 1:10 e coloque-o na amostra. Sele-o em temperatura ambiente por 30 min. Após a selagem, enxágue suavemente duas vezes com PBS.
3. Incubar as secções com o anticorpo primário durante a noite a 4 °C. Após a lavagem com PBS, adicione o anticorpo secundário fluorescente e incube no escuro por 1 h.
4. Coloração do núcleo com DAPI, vedação com agente de montagem anti-têmpera e observação sob microscopia confocal.

6. Imuno-histoquímica

1. Após a desparafinação e hidratação das seções de parafina, realizar o reparo do antígeno e bloquear a peroxidase endógena.
2. Incubação de anticorpos e desenvolvimento de cores: Primeiro, bloqueie com soro normal, depois incube o anticorpo primário e o anticorpo secundário marcado com HRP em sequência e, finalmente, o desenvolvimento da cor DAB. Controle o grau de reação sob um microscópio.
3. Volte a corar os núcleos celulares com hematoxilina. Após a desidratação e transparência, feche as placas e observe o sinal positivo amarelo-acastanhado ao microscópio.
   NOTA: O experimento precisa configurar controles e controlar estritamente as condições de restauração e desenvolvimento de cores.

7. Detecção de autolisossomas

1. Co-cultive macrófagos RAW264.7 com esporos de Candida albicans em uma proporção apropriada (10:1) e incube a 37 °C e 5% de CO₂ por 4 h, 8 h, 12 h, 16 h, 20 h, 24 h, 28 h, 32 h, 36 h, 40 h, 44 h e 48 h para estabelecer um modelo fagocítico.
2. Lave três vezes com PBS pré-resfriado para remover os esporos não fagocíticos.
3. Primeiro, bloqueie as amostras com 5% de BSA por 30 min. Em seguida, incube sucessivamente com o anticorpo primário contra LC3 (diluição 1:200) em temperatura ambiente por 1 h, seguido pelo anticorpo secundário marcado com Alexa Fluor 488 em temperatura ambiente por 30 min.
4. Adicione a sonda de lisossomo Lyso-Tracker Red diretamente às células para visualizar a localização lisossômica. Finalmente, contra-corar os núcleos com DAPI (1 μg / mL) por 5 min.
   NOTA: Todo o processo de operação deve ser realizado no escuro para garantir que o tempo de incubação e a concentração do anticorpo sejam controlados com precisão.

Resultados

Inicialmente, avaliamos sistematicamente as alterações patológicas miocárdicas induzidas por diferentes doses de CAWS em camundongos. Não foram observadas mortes no grupo controle PBS, no grupo CAWS de 4 mg e no grupo CAWS de 8 mg (n = 20 em cada grupo). Em contraste, a resposta inflamatória no grupo de 4 mg foi leve e não atendeu aos requisitos de modelagem. A taxa de mortalidade foi maior no grupo CAWS de 12 mg (9/20, 45%), e os óbitos ocorreram do 3º a...

Discussão

Os aneurismas da artéria coronária (AAC) e a fibrose miocárdica na DK são as principais causas de eventos cardiovasculares de longo prazo. Apesar do progresso no tratamento da fase aguda, aproximadamente 5% dos pacientes ainda desenvolvem AAC persistente^28,29. O mecanismo dessa mudança patológica tardia ainda não está claro, e há uma necessidade urgente de modelos animais revelarem seu processo dinâmico³⁰....

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
um anticorpo secundário de cabra contra o IgG Alexa Fluor 488 do coelho	Abcam	ab15081	um anticorpo secundário de cabra contra o IgG Alexa Fluor 488 do coelho
Câmara anaeróbica	Termo Científica	Termo Científica	Câmara anaeróbica
Azul anilina	Solarbio	G3668	Azul anilina
anti-LC3	Abcam	ab192890	o anticorpo primário contra LC3
Gabinete de segurança biológica	Termo Científica	1500	Gabinete de segurança biológica
BSA	Solarbio	A8020	BSA
Candida albicans (cepa)	NBRC	1385	Candida albicans (cepa)
CD3e	BD em Biociências	561827	FITC Hamster Anti-Mouse CD3e(145-2C11)
CD86	BD em Biociências	105013	CD86
CD8a	BD em Biociências	100713	CD8a
Incubadora de culturas celulares	Termo Científica	311	Incubadora de culturas celulares
Centrifuga	Termo Científica	ST4R Plus	Centrifuga
Microscópio confocal	Olimpo	IX73	Microscópio confocal
DAPI	Beyotime Biotechnology	P0131-25ml	DAPI
DMEM	Gibco	11965126	DMEM
Máquina de embedding	P.S.J MEDICAL	BM450A	Máquina de embedding
Eosina	Solarbio	G1100	Eosina
F4/80	BD em Biociências	123109	F4/80
FBS	Gibco	16000044	FBS
Formaldeído	Solarbio	P1110	Formaldeído
Desidratador de tecidos totalmente automático	Leica Biosystems	ASP3005	Desidratador de tecidos totalmente automático
Lâminas de microscópio de vidro	Citotest	250124A1	Lâminas de microscópio de vidro
H& Corante E	Beyotime Biotechnology	C0105M	H& Corante E
IHC Kit	Biotecnologia Absin	abs996-5ml	IHC Kit
Sonda LC3	Beyotime Biotechnology	C3018M	Sonda LC3
Lâminas de Microtomo de Perfil Baixo	Thermo Fisher	3052835	Lâminas de Microtomo de Perfil Baixo
Sonda do lisossomo	Beyotime Biotechnology	C1046	Sonda do lisossomo
Marcador	Deli	SK109	Marcador
Corante de masão	Beyotime Biotechnology	C0189M	Corante de masão
Micrótomo	Leica Biosystems	HistoCore BIOCUT	Micrótomo
Goma neutra	Solarbi	G8590	Goma neutra
NK1.1	BD em Biociências	561117	NK1.1
Microscópio óptico	Nikon	Nikon	Microscópio óptico
Parafina	Solarbio	YA0012	Parafina
Parafina	Solarbio	YA0012	Parafina
PBS	Solarbio	P1020	PBS
Ácido fosfomolíbdico	Solarbio	G3472	Ácido fosfomolíbdico
VDAC1	Abcam	ab34726	Anti-VDAC1