Medindo o Envelhecimento de Célula Única com um Biomarcador Baseado em Imagem de Cromatina e Envelhecimento Epigenético

Resumo

O protocolo apresenta o fluxo de trabalho de imagem e computacional para extrair e validar cromatina baseada em imagem e a idade epigenética (ImAge).

Resumo

Para avançar na saúde personalizada e avaliar possíveis estratégias de rejuvenescimento, biomarcadores que refletem a idade biológica são cruciais. Introduzimos cromatina baseada em imagem e idade epigenética (ImAge), um biomarcador baseado em imagem derivado da organização espacial da cromatina e das marcas epigenéticas dentro de núcleos individuais, capturando mudanças intrínsecas relacionadas à idade. O ImAge captura e quantifica efetivamente os efeitos das intervenções que modulam a idade biológica, mostrando sensibilidade por meio de diminuições significativas após estratégias de rejuvenescimento (como restrição calórica e reprogramação parcial por expressões transitórias de Oct4, Sox2, Klf4 e Myc (OSKM)) e aumentos após tratamentos como quimioterapia. Além disso, uma ImAge menor correlacionou-se com maior atividade locomotora, sugerindo que captura melhorias funcionais junto com a reversão biológica da idade, oferecendo uma ferramenta promissora de célula única para avaliar intervenções de longevidade. Como o ImAge é um método integrativo que exige imagem de boa qualidade e análise computacional meticulosa, buscamos fornecer orientações detalhadas para extraí-lo e validá-lo. Esse protocolo abrangente detalhará o fluxo de trabalho tanto para procedimentos de laboratório úmido (preparação e imagem da amostra) quanto para a utilização adequada de nosso pipeline computacional de código aberto (configuração do ambiente e processamento dos dados de imagem) para extrair e validar o ImAge.

Introdução

O aumento da expectativa média de vida e o envelhecimento da população global ressaltam a necessidade crítica de biomarcadores eficazes de idade funcional^{ou biológica 1,2,3}. Esses biomarcadores são essenciais para prever com precisão o risco e a longevidade da doença, o que pode melhorar significativamente o cuidado da geriatria e reduzir os custos associados. Embora os relógios de metilação do DNA (DNAm) tenham feito avanços notáveis na quantificação do envelhecimento ^{biológico 4,5,6}, eles frequentemente dependem da regressão linear e exigem grandes coortes, podendo negligenciar componentes biológicos nuançados e dependentes do contexto específicos dos^{indivíduos 7,8}. Além disso, essas técnicas baseadas em sequenciamento exigem lise celular, preparação complexa de amostras e reagentes caros para cada célula, tornando-as mais caras e desafiadoras para estudos de alta produtividade, em larga escala ou longitudinais, onde a destruição da amostra é uma desvantagem⁹.

Para superar essas limitações, desenvolvemos cromatina e idade epigenética baseadas em imagem (ImAge), uma técnica inovadora projetada para quantificar o envelhecimento e o rejuvenescimento em resolução de célula única. Essa técnica foi aplicada e validada no sangue periférico de camundongos e em vários órgãos sólidos, conforme descrito por Alvarez-Kuglen et ^al.1. Esta publicação descreve os protocolos otimizados em detalhes para que possam ser adaptados e adotados por outros pesquisadores para diversas aplicações.

Essa abordagem difere fundamentalmente dos relógios tradicionais de DNAm ao capturar trajetórias intrínsecas relacionadas à idade com base na organização espacial da cromatina e das marcas epigenéticas dentro de núcleos^{individuais 1}. Métodos baseados em imagem oferecem vantagens distintas: são inerentemente não destrutivos, ou seja, as células não são destruídas durante o processamento, ao contrário dos métodos baseados em sequenciamento. Essa natureza não destrutiva permite crucialmente a preservação da estrutura espacial da cromatina e das marcas epigenéticas no nível de célula única, mantendo o contexto espacial das células dentro dos tecidos — uma perspectiva frequentemente perdida nos fluxos de trabalho convencionais de sequenciamento. Além disso, as técnicas de imagem geralmente são mais econômicas para estudos de grande escala ou longitudinais, pois não exigem reagentes caros ou preparação complexa de bibliotecas por célula, tornando-as adequadas para observações repetidas ao longo do^{tempo 10,11}.

Uma vantagem chave do ImAge é sua capacidade de revelar trajetórias relacionadas à idade como características principais intrínsecas dos próprios dados, sem exigir regressão na idade cronológica. O ImAge demonstrou forte correlação com a idade cronológica em células mononucleares do sangue periférico de camundongos e vários órgãos^{sólidos 1}. Crucialmente, o ImAge captura efetivamente as perturbações esperadas da idade biológica, mostrando um aumento após o tratamento de quimioterapia e uma diminuição da restrição calórica e reprogramação parcial por expressão transitória de OSKM no fígado e músculo esquelético. Além disso, as leituras ImAge têm sido observadas correlacionando-se inversamente com a atividade locomotora em camundongos cronologicamente idênticos, indicando sua utilidade na medição de aspectos da idade biológica e funcional.

A implementação da metodologia ImAge requer expertise tanto em procedimentos experimentais de laboratório úmido¹² quanto em análises computacionais¹ (Figura 1); Portanto, este artigo fornece protocolos abrangentes e passo a passo para ambos os aspectos. Esse protocolo otimizado visa facilitar a adoção generalizada do ImAge, permitindo que pesquisadores investiguem mudanças associadas à idade na organização da cromatina e epigenética em resolução de célula única em vários tipos celulares e tecidos. Neste protocolo, H3K27ac e H3K27me3, dois marcadores que fornecem contraste e resolução suficientes para determinar o ImAge, foram selecionados como marcas representativas. Pesquisadores podem replicar esse protocolo para quantificar o envelhecimento biológico, avaliar o impacto das intervenções de longevidade e explorar a heterogeneidade inerente nos processos de envelhecimento e rejuvenescimento no nível individual do organismo.

Protocolo

Todos os experimentos com animais são conduzidos de acordo com diretrizes e protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) do Instituto de Pesquisa Scripps (Protocolo 09-0004-6). Os dados apresentados neste manuscrito foram obtidos usando camundongos machos i4F, com idades entre 2 e 14 meses de idade. Órgãos de interesse (fígado e músculo esquelético) foram colhidos de camundongos i4F de 13,8 meses e camundongos controle irmãos de ninhada, tratados por 1 semana com uma dose baixa de doxiciclina (0,2 mg/ml)¹⁴. Núcleos foram isolados de amostras de jovens (3,2 meses), idosos (13,8 meses) e envelhecidos tratados com doxiciclina para superexpressar fatores OSKM (envelhecido-OSKM).

1. Imagem de amostras

1. Preparação de amostras
   1. Colete órgãos de interesse (fígado e músculo esquelético) de camundongos recém-dissecados (ou outras espécies de interesse) e congele rapidamente com nitrogênio líquido. Armazene as amostras a -80 °C até estar pronto para uso.
   2. Transfira órgãos e tecidos para um almofariz pré-resfriado e coloque sobre gelo seco. Despeje nitrogênio líquido sobre o tecido congelado e moa usando um pilão pré-resfriado. Pulverize a amostra usando o pilão pré-refrigerados até obter um pó uniformemente fino.
   3. Aliquot moe tecido usando uma espátula metálica pré-resfriada em vários tubos e armazena amostras não utilizadas a -80 °C.
      NOTA: Amostras de tecido moído nos tubos podem ser armazenadas a -80 °C ou proceder ao isolamento dos núcleos.
   4. Extraia núcleos de alíquotas congeladas, usando um kit de tampão de lise de núcleos comercialmente disponível, conforme as instruções do fabricante.
   5. Conte os núcleos usando Trippan Blue. Misture núcleos e Trippan Blue em proporção igual em um tubo separado. Transfira 10 μl da solução de núcleos-Trippan Blue para um hemocitômetro ou contador celular automático.
   6. Diluir amostras em PBS + 0,5% de BSA de modo que 10.000 núcleos possam ser placados em um volume de 20-30 μL/poço.
2. Preparação do prato
   1. Insira todos os metadados relevantes para preparação de chapas e análise computacional no Platemap (fornecido no Arquivo Suplementar 1). Registre os identificadores da amostra (por exemplo, números ou caracteres) no mesmo layout da placa real do poço na aba SampleID. Registre as condições experimentais, incluindo a idade da amostra, no mesmo layout da placa real do poço na aba de condição.
      NOTA: As informações fornecidas na aba de condição serão utilizadas para identificar o grupo etário de cada amostra (ou seja, jovem ou idoso). Esses grupos etários identificados servirão posteriormente como referências para a construção do modelo de predição do envelhecimento (ImAge). Portanto, a aba de condição deve conter dados que possam ser associados à idade, juntamente com outras condições experimentais relevantes, conforme necessário.
   2. Registre os biomarcadores alvo (por exemplo, H3K27me3) no mesmo layout da placa real do poço no canal# (# é substituído por um número). Verifique se todas as combinações de metadados correspondem e são corretamente refletidas em um formato de tabela consecutivo na aba do mapa de placas.
      NOTA: Cada coluna da tabela deve corresponder a um nome de aba designado (por exemplo, "sampleID"). Uma aba adicional rotulada como "metadados" é fornecida para documentar os objetivos do projeto e colorizar detalhes; Essas informações não serão utilizadas na análise de dados. Use esta aba conforme necessário.
   3. Exporte o platemap de aba como formato de arquivo csv com o nome curto e descritivo do projeto (por exemplo, project.csv).
      NOTA: A aba de metadados fornece um modelo para resumir os objetivos do projeto e informações sobre imunocoloração. O uso da aba de metadados no modelo Platemap é opcional para o próprio processo de placagem. No entanto, outras abas, incluindo sampleID, channel# (# é substituído por um número), são necessárias para análise computacional.
3. Placar 10.000 núcleos/poço em um volume de 20 a 30 μL em uma placa de poço (por exemplo, placas de 384 poços). Placa giratória a 1.000 x g (aceleração nove, desaceleração 4) por 10 minutos a 4 °C.
4. Fixe com volume 1:1 de paraformaldeído (PFA) 8% em PBS por 10 minutos em temperatura ambiente.
   ATENÇÃO: Realize as etapas da PFA em uma exaustão e descarte resíduos conforme os procedimentos de segurança institucional.
5. Remova a solução. Adicione 30 μL de glicina 0,1 M em PBS por 5 minutos em temperatura ambiente. Remova a solução. Lave com 100 μL de PBS 2x e adicione 30 μL de PBS para armazenamento.
   NOTA: As células podem ser armazenadas a 4 °C ou proceder imediatamente à imunomarcação.
6. Imunomarcação
   1. Remova o PBS. Adicione 30 μL de solução bloqueante (2% de BSA e 0,5% de Triton X-100 em PBS) e incube por 1 h em temperatura ambiente. Remova a solução bloqueadora.
   2. Adicione 25 μL de anticorpos primários: anti-H3K27ac do camundongo (1:250) e anti-H3K27me3 do Coelho (1:250) diluídos em tampão bloqueante (0,4 - 2 μg/mL). Incube durante a noite a 4 °C.
   3. Remova a solução primária de anticorpos. Lave com 100 μL de PBS 3 vezes por 3 minutos em temperatura ambiente.
   4. Adicione 25 μL de anticorpos secundários: Alexa 488 Donkey Anti-Mouse (1:250) e Alexa 555 Donkey Anti-Rabbit (1:250) diluídos em buffer bloqueador (1 - 10 μg/mL). Incube por 2 horas a 4 °C ou 1 hora em temperatura ambiente.
   5. Lave com 100 μL de PBS 3 vezes por 3 minutos em temperatura ambiente. Tinga com DAPI/Hoechst em 30 μL de concentração de 0,01 mg/mL. Lave com 100 μL de PBS.
      NOTA: Armazene o prato a 4 °C em papel alumínio ou proceda imediatamente à imagem. DAPI/Hoechst é necessário para a etapa de segmentação dos núcleos.
7. Imagem
   1. Células de imagem em um imager de alto conteúdo para máxima resolução (para este conjunto de dados, 20x foi usado, mas 63x é recomendado).
      NOTA: Embora a imagem de imagem possa ser realizada com qualquer imager de alto conteúdo, esse protocolo assume uma estrutura de pastas plana de imagens adquiridas e um formato genérico de imagem (por exemplo, .tiff) como a saída da imagem adquirida (Figura 2).
   2. Colete múltiplos campos por poço e múltiplos z-stacks, idealmente cobrindo de cima a baixo os núcleos celulares. Uma cobertura de 10 μm junto com o eixo z (por exemplo, 20 fatias z em um passo z de 0,5 μm) normalmente cobre a maioria dos núcleos das células de camundongo. O tamanho e a cobertura necessária dependem da espécie e dos tipos celulares de interesse. Imagens representativas são mostradas na Figura 3.
   3. Transfira os dados de imagem para o computador onde será realizada a análise computacional, seguindo a estrutura de pastas apresentada na Figura 2.
   4. Adicione o prefixo anotado entre colchetes quadrados do nome do projeto definido no passo 1.2.2 acima à pasta de dados da imagem (por exemplo, [projeto]original_folder_name)

2. Análise computacional de dados de imagem

1. Preparação para requisitos de software do sistema (Necessário apenas para a configuração inicial)
   1. Instale o Windows Subsystem for Linux (WSL) se estiver operando em uma máquina Windows seguindo as instruções do https://learn.microsoft.com/en-us/windows/wsl/install. Instale Anaconda ou Miniconda seguindo as instruções em https://www.anaconda.com/docs/getting-started/anaconda/main
2. Preparação do ambiente computacional (Necessário apenas para a Configuração Inicial)
   1. Baixe os scripts de fluxo de trabalho do repositório do github https://github.com/terskikh-lab/ImAge_workflow. Descompacte o arquivo baixado.
      NOTA: O local de armazenamento de dados pode ser designado arbitrariamente; no entanto, recomenda-se selecionar um diretório distinto do local de armazenamento de arquivos do sistema (por exemplo, o drive C no Windows).
   2. Organize o repositório ImAge clonado para corresponder à estrutura de pastas assumida para a execução correta do script (Figura 2).
   3. Abra o app do terminal se estiver usando Linux ou macOS. Abra o app WSL se estiver usando Windows.
   4. Mude a pasta para o arquivo do repositório clonado. A partir de então, o termo Comando: denota uma instrução para copiar e colar o código subsequente no aplicativo do terminal, seguida de pressionar a tecla Enter .
      Comando: cd /PATH_TO_CLONED_REPOSITORY/ImAge-main
      NOTA: Substitua "/PATH_TO_CLONED_REPOSITORY" pela configuração específica para o usuário. Por exemplo, quando o repositório é descomprimido na pasta "analysis" do drive D e acessado a partir do WSL, isso será "/mnt/d/analysis".
   5. Crie um novo ambiente computacional com Python versão 3.10 usando o conda (aplicação de linha de comando instalada com Anaconda/miniconda).
      Comando: conda create -n ImAge_workflow python=3.10
   6. Ative o ambiente recém-criado.
      Comando: conda ativar ImAge_workflow
   7. Instale Poetry (um gerenciador de pacotes em Python) usando o instalador pip (instalador de pacotes Python instalado ao criar o ambiente ImAge_workflow).
      Comando: pip install poetry
   8. Instale pacotes pré-requisitos em Python usando Poetry.
      Comando: instalação de poesia
      ATENÇÃO: Certifique-se de que a pasta atual seja a ImAge_workflow pasta, que pode ser verificada executando um comando: pwd.
   9. Configure o CUDA dentro do ambiente Conda para habilitar a funcionalidade de unidade de processamento gráfico (GPU) na etapa de segmentação para um cálculo mais rápido (aplicável apenas para Linux ou PC Windows com GPU Nvidia).
      Comando: mkdir -p $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d
      echo 'NVIDIA_PACKAGE_DIR=$(dirname $(python -c "import nvidia; print(nvidia.__file__)"))' >> $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d/env_vars.sh
      echo 'for dir em $NVIDIA_PACKAGE_DIR/*; faça se [ -d "$dir/lib" ]; então exportar LD_LIBRARY_PATH="$dir/lib:$LD_LIBRARY_PATH"; fi done' >> $CONDA_PREFIX/etc/conda/activate.d/env_vars.sh
      NOTA: Os scripts detectam automaticamente a disponibilidade da GPU no servidor. Se não houver GPUs disponíveis, ele funciona como padrão na CPU.
3. Execute os cálculos conforme descrito abaixo.
   NOTA: A análise computacional consiste em quatro etapas: segmentação de núcleos, extração de características de imagem, construção do eixo de envelhecimento (ImAge) e previsão do ImAge. Cada processo é realizado usando scripts em python; o1_illumination_correction, o2_segmentation, o3_extract_features e o4_ImAge_validation. Todos esses passos estão incluídos em um único script Python, main.py. As leituras extraídas do ImAge podem ser visualizadas usando um gráfico de caixa e violino, conforme apresentado em Figura 4. A leitura do ImAge também pode ser extraída em um formato de tabela simples (formato padrão .csv arquivo), com amostras representadas como linhas e leituras e metadados correspondentes como colunas. Os usuários têm a flexibilidade de realizar análises numéricas adicionais nas leituras ImAge conforme necessário. Esses gráficos e o arquivo CSV podem ser obtidos usando um script em Python, visualization.py. O processo de predição ImAge utiliza sinais bootstrap obtidos de células individuais dentro do mesmo tecido. Esses sinais bootstrapados são sinais médios derivados de amostragem aleatória e iterações repetidas. Essa abordagem visa garantir que a análise capture as leituras mais confiáveis e representativas, com a incerteza da análise proporcional à heterogeneidade inerente do tecido.
   1. Abra o app do terminal se estiver usando Linux ou macOS. Abra o app WSL se estiver usando Windows.
      Comando: cd /PATH_TO_CLONED_REPOSITORY/ImAge-main
      ATENÇÃO: Certifique-se de que a pasta atual seja a ImAge_workflow pasta, que pode ser verificada executando um comando: pwd.
   2. Ative o ambiente.
      Comando: conda ativar ImAge_workflow
   3. Configure os parâmetros de análise no fluxo de trabalho/arquivo main.py no editor de código ou texto (por exemplo, aplicativo Notepad, Microsoft Visual Studio Code, etc.).
      1. Defina o nome do projeto na variável p para um identificador curto, seguro para o sistema de arquivos, usado para organizar as saídas (por exemplo, p = brain_3ages_k27me3).
      2. Defina a lista de canais para extração de recursos no chs. Inclua o canal de segmentação se características desse canal forem necessárias para a análise (chs = ['DAPI', 'H3K27me3', 'H3K27ac']).
      3. Mapeie identificadores de canais de imagem dos nomes de arquivos para as colunas do mapa de placas usando imageIndex. Determine o formato do rótulo do canal usado pelo sistema de imagem para adquirir dados de imagem e use esse rótulo como chave. Mapeie cada rótulo para o cabeçalho exato, com sensível a maiúsculas minúsculas, no platemap salvo na etapa 1.2.2 (por exemplo, imageIndex = {'1': 'Channel1', '2': 'Channel2', '3': 'Channel3'}).
         ATENÇÃO: Os nomes das colunas são sensíveis a maiúsculas e minúsculas e devem corresponder ao seu arquivo de mapas de placas.
      4. Defina as localizações dos dados: orgDataLoadPath para a raiz do conjunto de dados, orgDataSubFolder para a subpasta imagem, se necessário, e resultsSavePath para a raiz de saída.
      5. Confirme a extensão do nome do arquivo em imageFileFormat e edite imageFileRegEx para usar grupos de captura nomeados em Python para todas as partes necessárias: linha, col, campo, zposition e canal. Use a seguinte sintaxe: (? P\d+), onde GROUP é substituído por linha, col, campo, zposição ou canal.
         NOTA: Atualize o regex se os nomes dos arquivos diferirem; todos os grupos nomeados devem analisar corretamente. Por exemplo, o nome do arquivo r01c11f01p01-ch1sk1fk1fl1.tiff deve ser convertido para o seguinte: r(? P\d+)c(? P\d+)f(? P\d+)p(? P\d+)-ch(? P\d+)sk1fk1fl1\.tiff.
      6. Defina o canal de segmentação em segmentation_ch para o canal nuclear usado para detecção de objetos (por exemplo, segmentation_ch = 'DAPI').
      7. Decida se usa correção de iluminação definindo illumiCorrection. Defina para True para calcular e aplicar modelos BaSiC; Configurado para False para processar imagens brutas.
         NOTA: Para placas com ≥ 25 poços, recomenda-se a correção de iluminação para reduzir o viés sistemático.
      8. Defina o tamanho físico do vóxel em micrômetros em voxel_dim como [z, y, x]. Use metadados do microscópio para determinar o espaçamento (por exemplo, voxel_dim = [1,0, 0,6, 0,6]). Salve o arquivo e feche o editor após verificar cada parâmetro
   4. Execute scripts para obter leituras ImAge e realizar validação. Enquanto executa o script, não feche o terminal nem o app WSL.
      Comando: Fluxo de trabalho/main.py em Python
      NOTA: O script (main.py) abrange todas as etapas, incluindo segmentação, extração de características, construção do eixo ImAge e previsão por padrão. O script gerará um tempo estimado de conclusão para cada etapa (por exemplo, segmentação de núcleos). Cada processo (por exemplo, o1_illumination_correction) gerará arquivos intermediários no formato .pickle que contêm resultados de cada processo. No entanto, isso é destinado exclusivamente à transferência de dados entre processos para garantir processamento padronizado e não é destinado à manipulação do usuário neste artigo. No entanto, se os usuários precisarem manipular ou adotar esses arquivos, veja a documentação incluída em cada função Python para a forma e os tipos de dados¹³.
   5. Visualize os resultados e exporte as leituras brutas do ImAge para análise adicional em softwares externos. Comando: Fluxo de trabalho/visualization.py em Python
      NOTA: Esta etapa produz figuras e tabelas de leituras do ImAge, e os arquivos estão localizados em fig_o4_ImAge_validation_VIOLIN e export_o4_ImAge_validation, respectivamente (Figura 2).

Resultados

Imagens representativas devem estar bem povoadas para obter células individuais, mas núcleos individuais não devem se tocar, pois isso degradaria a qualidade da segmentação dos núcleos celulares. A Figura 3 mostra a imagem representativa para obter resultados robustos de análise computacional.

Os resultados apresentados neste manuscrito de métodos são adaptados do manuscrito ImAge de Alvarez-Kuglen et ^al.1....

Discussão

Preparação de Amostras
Para a preparação da amostra, colha prontamente os tecidos de interesse e congele-os rapidamente em nitrogênio líquido. Ao moer tecido com um pilão e argamassa, uma tampa de silicone para o argamassa pode ser usada para evitar a perda de amostra. Adicione mais nitrogênio líquido se o tecido for difícil de pulverizar. Para tecidos mais frágeis, as amostras também podem ser processadas frescas (em vez de congeladas) para reduzir perturbações mecân...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Albumina Sérica Bovina	Sigma-Aldrich	A9647
Anticorpo secundário anti-rato Donkey IgG (H+L) altamente adsorvido cruzadamente, Alexa 488	Invitrogen	A-21202
Anti-Coelho IgG (H+L) Anticorpo Secundário Altamente Adsorvido Cruzado, Alexa 555	Invitrogen	A-31572
Glicina	Bio-Rad	161-0718
Histona H3K27ac anticorpo (mAb)	Motivo Ativo	39685
Anticorpo H3K27me3 (pAb)	Motivo Ativo	39155
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570
Kit de Isolamento de Núcleos: Preparação EZ de Núcleos	Sigma-Aldrich	NUC101
Opereta CLS High Content Imager	Revvity	https://www.revvity.com/au-en/product/operetta-cls-system-hh16000020
Paraformaldeído 16% Solução Aquosa Grau EM	Ciências da Microscopia Eletrônica	15710-S
PBS	Thermo Fisher	AM9624
Microplaca PhenoPlate de 384 poços	Revvity	6057302
Triton-X	Sigma	T8787
Solução Trippan Blue, 0,4%	Gibco	15250061