Method Article

Análise específica do subtipo celular do proteassoma da membrana neuronal em neurônios somatossensoriais

DOI:

10.3791/69061

⸱

October 10th, 2025

 ,  , 
1Department of Molecular Pharmacology and Neuroscience, Loyola University Chicago Stritch School of Medicine, 2Center for Translational Research and Education

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O proteassoma da membrana neuronal (NMP) foi recentemente identificado em um subconjunto de neurônios somatossensoriais como um regulador chave da percepção do toque, dor e coceira. Este artigo apresenta um fluxo de trabalho robusto para analisar a expressão e função de NMP específicas do tipo de célula usando classificação de células, perfil de transcriptoma e análises de imunofluorescência baseadas em cultura.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A sinalização sensorial dos neurônios depende de proteassomas funcionais, e sua localização subcelular influencia a função. Um complexo proteassoma especializado, o proteassoma da membrana neuronal (NMP), foi recentemente identificado em uma subpopulação de neurônios somatossensoriais periféricos. O NMP localiza-se exclusivamente na membrana plasmática do soma e nos axônios proximal e distal. O sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) revelou que, em condições normais, o NMP é predominantemente expresso nos neurônios MrgprA3+ e Cysltr2+, que medeiam a sensação mecânica, de coceira e dor. A inibição aguda e seletiva de NMP na pele da pata de camundongos reduziu a sensibilidade mecânica e à dor sem afetar a sensação térmica. Notavelmente, ao contrário da inibição global do proteassoma, a inibição seletiva do NMP não causa neuropatia. Estudos in vitro sugerem que o NMP facilita a comunicação neurônio a neurônio, potencialmente por meio da liberação de peptídeos de sinalização, e é essencial para respostas neuronais normais à estimulação. Essas descobertas identificam o NMP como um regulador chave da diafonia dos neurônios sensoriais necessária para a sensação normal de toque, dor e coceira. Assim, o NMP representa um alvo potencial para o controle da dor. Este artigo apresenta métodos para isolar populações neuronais que expressam e não expressam NMP usando alimentação de anticorpos e classificação de células ativadas por fluorescência (FACS). Essas populações são adequadas para perfis de expressão específicos do tipo de célula por meio de scRNA-seq ou análises baseadas em cultura da dinâmica de expressão de NMP. Juntos, esses métodos fornecem um fluxo de trabalho robusto para investigar a dinâmica da expressão de NMP e sua contribuição para condições de doença relevantes para a dor.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A função do proteassoma é essencial para o desenvolvimento e manutenção ideais do sistema nervoso periférico (SNP)1,2,3,4,5,6. Estudos in vitro e in vivo usando inibidores de proteassoma demonstram que a atividade proteassômica é crucial para o neurodesenvolvimento, mielinização, excitabilidade e função das células gliais 7,8,9,10. Além disso, a quimioterapia baseada em inibidores de proteassoma induz neuropatias dolorosas em 30-60% dos pacientes, muitas vezes caracterizadas por dor crônica e sensibilidade alterada nas extremidades 8,9,11,12,13. Curiosamente, a administração de baixas doses desses mesmos inibidores reduz a sensibilidade a estímulos dolorosos, sugerindo um papel complexo para o proteassoma no processamento sensorial 6,14,15. No entanto, apesar desses extensos estudos, a função específica dos proteassomas no SNP permaneceu pouco compreendida.

Os proteassomas são a principal maquinaria de degradação de proteínas em todos os domínios da vida e são essenciais para manter a homeostase proteica16. O proteassoma central 20S é composto por quatro anéis heptâmeros de subunidades α, β, β α e medeia a degradação de proteínas independentes de ubiquitina 17,18. A associação com partículas reguladoras forma o proteassoma revestido 26S e 30S, que medeia a degradação da proteína dependente de ubiquitina 4,17. Nos neurônios, os proteassomas foram identificados em todos os compartimentos celulares, e sua localização subcelular é conhecida por influenciar a função19. No entanto, muitos inibidores de proteassoma comumente usados carecem de especificidade para atingir seletivamente populações de proteassoma localizadas diferencialmente.

De fato, usando inibidores de proteassoma impermeáveis à membrana e marcação de anticorpos em células não permeabilizadas, descobriu-se que um complexo de proteassoma específico do neurônio se localiza na membrana plasmática em um subconjunto de neurônios somatossensoriais20. A análise scRNA-seq de neurônios primários do gânglio da raiz dorsal (DRG), separados em populações NMP + e NMP - por meio de alimentação de anticorpos contra uma subunidade de proteassoma e classificação FACS, resultou em 20 grupos de células transcricionalmente distintos20. Uma análise mais aprofundada revelou que as células NMP + se agruparam em apenas 3 dos 20 clusters. Usando conjuntos de marcadores genéticos para subtipos neuronais específicos, 13 subtipos diferentes de neurônios somatossensoriais foram identificados20. A maioria dos neurônios NMP + agrupados com neurônios sensoriais MrgprA3 + e Cysltr2 + 20. Um número mínimo de células NMP + agrupou-se em um terceiro cluster, no qual nenhum conjunto de genes específicos foi identificado, e esse cluster foi, portanto, deixado sem atribuiçãode 20. Os neurônios MrgprA3+ e Cysltr2+ são nociceptores do tipo C, sensíveis ao calor, estímulos mecânicos e prurigogênicos, correspondendo aos subtipos neuronais CGRP-θ e SST, respectivamente21,22. Dos 20 clusters de células identificados, 7 clusters NMP- expressaram marcadores genéticos consistentes com células não neuronais, incluindo células de Schwann, glia satélite e células imunes, e também foram deixados sem atribuição20. Essas populações de células eram esperadas, pois não é possível separar células não neuronais de neuronais durante a cultura de neurônios DRG20.

Investigando sua função, a inibição in vitro do NMP alterou a excitabilidade neuronal para KCl, histamina e estimulação de αβ-metilenoadenosina 5'-trifosfato20. In vivo, a inibição do NMP reduziu a sensibilidade a estímulos mecânicos e dolorosos, sem efeitos sobre a sensação térmica20. Esses achados revelam que o NMP é um regulador chave da sensação mecânica, de dor e coceira e um potencial alvo terapêutico para o controle da dor20. No entanto, os mecanismos específicos que ligam a atividade do NMP ao desenvolvimento da dor em diferentes contextos de doença permanecem pouco compreendidos. Portanto, é necessária uma investigação mais aprofundada sobre a dinâmica e a função da expressão do NMP em condições associadas à dor e à neuropatia.

Aqui, este artigo descreve um fluxo de trabalho robusto (Figura 1) para identificar e isolar populações neuronais NMP+ DRG. Essa abordagem permite a investigação específica do tipo de célula da dinâmica da expressão de NMP usando classificação FACS, scRNA-seq e imunocoloração. Essas abordagens permitem a análise de alta resolução da expressão de NMP de maneira específica do tipo de célula, que pode ser usada para investigar o papel do NMP em condições normais e várias associadas à dor.

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Protocol

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Todos os métodos descritos usando animais experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Loyola University of Chicago Stritch School of Medicine.

1. Preparação de soluções de digestão, meios DRG e meios FACS

  1. Prepare solução salina completa (CSS) contendo 137 mM de NaCl, 5,3 mM de KCl, 1 mM de MgCl2·6H2O, 25 mM de sorbitol, 10 mM de HEPES e 3 mM de CaCl2·2H2O. Ajuste o pH para 7,2 com NaOH e filtre a esterilização.
  2. Prepare a solução de trabalho da mistura de enzimas de dissociação tecidual (trituração moderada) combinando 190 μL do estoque (5 mg / mL em H2O), 84 μL de 50 mM EDTA e 6,5 mL de CSS. Prepare fresco e filtre e esterilize antes de usar.
  3. Prepare a mistura enzimática de dissociação tecidual (baixa trituração) - solução de papaína contendo 190 μL de solução estoque de mistura enzimática, 150 μL de papaína, 84 μL de EDTA 50 mM e 6,5 mL de CSS. Prepare fresco e filtre e esterilize antes de usar.
  4. Prepare a solução de BSA/TI/DMEM combinando 7,5 mg de inibidor de tripsina e 7,5 mg de BSA em 5 mL de meio DMEM/F12. Prepare fresco e filtre-esterilize.
  5. Prepare o meio de neurônio DRG combinando 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% de penicilina/estreptomicina, 1% de glutamina e 2% de suplemento 50x B27 em 430 mL de DMEM/F12.
  6. Prepare o tampão FACS combinando 1% de FBS, 1x PBS, 25 mM de HEPES e 1% de penicilina/estreptomicina em água autoclavada. Prepare fresco e filtre-esterilize.
  7. Vinte e quatro horas antes do início do protocolo, revestir dois tubos de fundo redondo de poliestireno de 5 mL, enchendo-os com tampão FACS e colocando-os a 4 °C.

2. Preparação da suspensão de neurônios DRG de célula única

  1. Colha todos os DRGs de 4-6 camundongos P20-P23 seguindo os métodos descritos anteriormente 20,23.
  2. Transfira os DRGs para um tubo cônico de 15 mL e adicione 7 mL de solução de trabalho de mistura de enzimas de dissociação tecidual (trituração moderada). Incubar com agitação suave (por rotação) a 37 °C durante 20 min.
  3. Gire os gânglios a 120 × g por 2 min. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet e ressuspenda os gânglios em 7 mL de mistura de enzimas de dissociação tecidual (baixa trituração) e solução de trabalho de papaína. Incubar com agitação suave (por rotação) a 37 °C durante 15 min.
  4. Gire a 120 × g por 2 min. Remover o sobrenadante e ressuspender os gânglios em 500 μL de solução de BSA/TI/DMEM.
  5. Triture os gânglios 12-16x com uma pipeta Pasteur de vidro polido a fogo de 1 mL.
  6. Filtrar os detritos celulares passando as células por um filtro de células de 40 μm. Lave o filtro com 1 mL de solução BSA/TI/DMEM para garantir a coleta de todos os neurônios DRG. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL.
  7. Gire a 120 × g por 2 min. Remova o sobrenadante e ressuspenda suavemente o pellet em 1 mL de meio DRG.
    NOTA: Esta é a suspensão de neurônios DRG de célula única.

3. Alimentação de anticorpos para rotular neurônios NMP-positivos

  1. Divida a suspensão de neurônios DRG em dois tubos de 1,5 mL, cada um contendo 500 μL, e rotule os dois tubos: "primário" e "não primário".
  2. Adicione 20 μL de anticorpo anti-proteassoma 20S subunidade alfa 2 (PSMA2) de cabra ao tubo marcado como "primário" (diluição 1:25).
    1. Opcional: Para testar a integridade da membrana e a especificidade do anticorpo PSMA2, inclua uma amostra adicional de DRGs primários incubados com cadeia pesada anti-neurofilamento de galinha (NF-H) (1:1.000) seguido por anti-galinha (por exemplo, conjugado com 488) secundário (1:250) (etapa 3.10).
      NOTA: O controle de marcação anti-NF-H deve resultar em nenhuma marcação celular se a membrana neuronal estiver intacta.
  3. Incubar as células sob agitação suave durante 30 min a 37 °C.
  4. 1x PBS esterilizado e filtrado a quente durante a incubação de anticorpos primários.
  5. Centrifugar os tubos a 200 × g durante 2 min e retirar 90% do sobrenadante (eliminar).
  6. Ressuspenda os neurônios em 500 μL de PBS 1x quente. Incubar os tubos com agitação suave durante 3 min a 37 °C.
  7. Repita as etapas 3.5-3.6 para um total de três lavagens.
  8. Enquanto as etapas de lavagem estão em andamento, prepare o anticorpo secundário diluindo 4 μL de IgG anti-cabra (fluoróforo de 555 nm) em 1.000 μL de meio DRG quente (diluição 1:250).
  9. Após a terceira lavagem, ressuspenda os tubos "primário" e "sem primário" em 500 μL da solução de anticorpo secundário.
    NOTA: Deste ponto em diante, proteja os tubos da luz envolvendo-os com papel alumínio.
  10. Incubar os tubos com agitação suave durante 40 min a 37 °C.
  11. Lave as células repetindo as etapas 3.5 a 3.6 para um total de três lavagens.
  12. Após a terceira lavagem, ressuspenda os neurônios em 300 μL de tampão FACS. Transfira as células ressuspensas para tubos separados de 5 mL de poliestireno de fundo redondo e coloque no gelo em um balde de gelo com tampa para proteger da luz.
  13. Coloque os tubos de fundo redondo pré-tratados contendo o tampão FACS do dia anterior no balde de gelo com os tubos contendo as células e prossiga para a etapa de classificação do FACS.

4. Separação de neurônios NMP-positivos (NMP+) e NMP-negativos (NMP-) via classificação FACS

  1. Imediatamente após a alimentação com anticorpos e a marcação dos neurônios DRG, leve as células e os tubos revestidos a um classificador FACS.
  2. Adicione 7-aminoactinomicina D (7-AAD) (1:1.000) aos tubos "primário" e "não primário". Incube por 10-30 min no gelo.
    NOTA: 7-AAD é usado para excluir células mortas do processo de classificação.
  3. Remova o tampão FACS dos tubos que foram revestidos durante a noite e substitua por 1 mL de tampão FACS novo. Esses tubos servem como tubos de coleta para os neurônios classificados.
  4. Use o tubo rotulado como "sem primário" para definir parâmetros e gating para neurônios não marcados.
  5. Aplique o bloqueio de dispersão direta (FSC) para isolar células consistentes com o tamanho dos neurônios sensoriais. Os diâmetros dos neurônios sensoriais variam de 10 a 50 μm.
  6. Aplique o gating de dispersão lateral (SSC) para excluir células mortas e detritos (dispersão lateral inferior) e para isolar eventos consistentes com a granularidade dos neurônios DRG (dispersão lateral maior).
  7. Carregue o tubo "primário" e defina os parâmetros de gating conforme estabelecido com a amostra "sem primária" para detectar populações neuronais não marcadas (NMP-) e 555-positivas (NMP+).
  8. Usando um bico de 100 μm e pressão de classificação de 15-20 psi, classifique os neurônios em 555+ e 555-.
  9. Prossiga para a análise a jusante dos neurônios classificados.

5. Sequenciamento de RNA de célula única de neurônios NMP+ e NMP-

  1. Transfira as células classificadas para tubos de 1,5 mL e coloque no gelo. Transporte as células para um núcleo de sequenciamento de célula única.
  2. Realize o sequenciamento de RNA de célula única nos neurônios classificados por NMP+ e NMP- a uma profundidade de 30.000 a 100.000 leituras por célula.
  3. Analise os dados de scRNA-seq usando vários programas de software disponíveis gratuitamente para gerar aglomerados de células de acordo com perfis de expressão gênica específicos. Para mais detalhes sobre as etapas de análise e os programas utilizados anteriormente, consulte Villalón Landeros et al.20.
  4. Construa uma lista de marcadores genéticos específicos para identificar populações neuronais individuais usando bancos de dados disponíveis, como https://painseq.shinyapps.io/harmonized_painseq_v2/ ou https://kleintools.hms.harvard.edu/tools/springViewer_1_6_dev.html?datasets/Sharma2019/all
  5. Use a lista de marcadores genéticos específicos para identificar os aglomerados de células resultantes.
    NOTA: A análise scRNA-seq realizada anteriormente foi conduzida por uma empresa de consultoria independente (www.cmcherryconsulting.com).

6. Culturas primárias de neurônios NMP+ e NMP- enriquecidos

  1. No dia anterior ao experimento, colocar lamínulas redondas de 12 mm em uma placa de cultura de 24 poços (1 lamínula/poço) e lavar com etanol a 70% por 15 min. Em seguida, enxágue com água estéril 3x e seque ao ar em uma capa de cultura de tecidos estéril.
  2. Quando as lamínulas estiverem secas, cubra-as com bromidrato de poli-L-lisina (PLL) 0,1 mg/ml e coloque a 4 °C durante a noite.
  3. No dia do experimento, remova o PLL, lave as lamínulas com água estéril 3x e deixe secar em uma capa de cultura de tecidos.
    NOTA: O PLL pode ser salvo e reutilizado.
  4. Dilua 10 μL de 1 mg/mL de laminina em 125 μL de meio DRG e coloque 20-30 μL no centro de cada lamínula.
  5. Cubra as lamínulas com laminina por pelo menos 40 minutos antes de usar.
  6. Transfira as células classificadas por FACS para um tubo de 1,5 mL e centrifugue a 200 × g por 5 min para coletar as células. Remova o sobrenadante e ressuspenda os neurônios em 50 μL de meio DRG quente.
  7. Aspirar a laminina da lamínula e deixar a lamínula secar.
  8. Semeie 15-20 μL de neurônios ressuspensos em cada lamínula. Mova cuidadosamente a placa com lamínulas semeadas para uma incubadora de cultura de tecidos e incube por pelo menos 30 min (não mais que 1 h) para permitir que as células adiram.
  9. Mova a placa de volta para uma capa de cultura de tecidos e adicione 1 mL de meio DRG quente estéril a cada poço contendo células em lamínulas.
    NOTA: Abaixe a ponta da pipeta até o canto inferior do poço e dispense lentamente para evitar tocar na lamínula e interromper as células. Adicionar mídia muito rápido pode criar turbulência e desalojar células.
  10. Mantenha as culturas a 37 °C com 5% de CO,2/95% de umidade com 75% de trocas de meio a cada 2-3 dias.

7. Análise de expressão NMP específica do tipo de célula

  1. Preparar uma placa de cultura de 140 mm ou uma bandeja de coloração por imunofluorescência, revestindo-a com um grande pedaço de parapelícula.
  2. Usando uma pinça 5/45 estéril, transfira as lamínulas da placa de cultura de tecidos para o parafilme na bandeja de coloração, garantindo que o lado que contém os neurônios DRG esteja voltado para cima.
  3. Adicione 100 μL de meio DRG a cada lamínula no parafilme para evitar que as células sequem.
    NOTA: Adicione líquidos pipetando lentamente logo acima da borda da lamínula.
  4. Diluir o anticorpo primário anti-PSMA2 caprino em meio DRG quente em uma diluição de 1:20.
  5. Usando um aspirador equipado com uma ponta não filtrada P10, remova a mídia da lamínula lentamente aspirando pela borda. Adicione 100 μL de solução de anticorpo anti-PSMA2 de cabra às lamínulas e incube em temperatura ambiente por 40 min.
  6. Aspire cuidadosamente a solução de anticorpos primários das lamínulas. Adicione 100 μL de PBS (à temperatura ambiente) e incube por 3 min à temperatura ambiente para lavar.
  7. Aspirar o PBS da lamínula e repetir a adição e aspiração de PBS durante um total de três lavagens.
  8. Prepare o anticorpo secundário anti-caprino (por exemplo, conjugado com 555) em meio DRG quente em uma diluição de 1:250.
  9. Após a terceira lavagem, adicione 100 μL do anticorpo secundário diluído à lamínula e incube à temperatura ambiente por 40 min.
    NOTA: A partir deste passo à frente, proteja as células da luz.
  10. Aspire a solução de anticorpo secundário da lamínula e lave 3x conforme descrito nas etapas 7.6-7.7.
  11. Remova a última lavagem de PBS e fixe as células adicionando 100 μL de solução fixadora contendo 4% de paraformaldeído (PFA), 4% de sacarose em 1x PBS. Incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
  12. Aspire o fixador e lave 3x repetindo os passos 7.6-7.7.
  13. Permeabilize as células adicionando 100 μL de detergente não iônico a 0,1% (por exemplo, Triton X-100) em 1x PBS e incube em temperatura ambiente por 5 min.
  14. Aspire a solução permeabilizante e lave 3x repetindo as etapas 7.6-7.7.
  15. Adicione 100 μL de solução de bloqueio consistindo de 5% de FBS, 5% de soro de burro em 1x PBS e incube em temperatura ambiente por 40 min.
  16. Preparar uma mistura de anticorpos primários específicos para o tipo de célula do neurónio DRG de acordo com as seguintes diluições na solução de bloqueio: peptídeo relacionado com o gene da anticalcitonina de coelho (CGRP) (1:500); isolectina B4, conjugado de biotina (IB4) (1:50); frango anti-NF-H (1:1000).
    NOTA: Esses anticorpos não interferem uns com os outros e podem ser adicionados na mesma solução.
  17. Remova a solução de bloqueio e adicione a mistura de anticorpos primários à lamínula. Incubar em temperatura ambiente por 45 min.
  18. Remova a solução de anticorpos e lave 3x repetindo as etapas 7.6-7.7.
  19. Prepare a solução de mistura de anticorpos secundários diluindo estreptavidina (por exemplo, conjugada com 647), anti-coelho de burro (por exemplo, conjugada com 488) e anti-frango de burro (por exemplo, conjugada com 405) a 1:500 cada.
  20. Remova a última lavagem de PBS e adicione 100 μL de solução de anticorpos secundários às lamínulas. Incubar em temperatura ambiente por 45 min.
  21. Lave 3x repetindo as etapas 7.6-7.7.
  22. Opcional: Prepare a coloração nuclear a 1-10 μg/mL. Adicione 100 μL de solução de corante nuclear, incube por 30 s em temperatura ambiente e lave 2x com água deionizada (diH2O) repetindo as etapas 7.6-7.7.
  23. Aspire a última lavagem da lamínula e, usando uma pinça de ponta fina, levante a lamínula do parafilme. Seque o excesso de líquido tocando suavemente a borda da lamínula em um lenço de papel sem fiapos.
  24. Coloque uma gota de 7 μL de meio de montagem em uma lâmina de microscópio. Coloque suavemente a lamínula sobre a gota do meio de montagem, certificando-se de que as células estejam voltadas para baixo e em contato com o meio.
  25. Coloque as lâminas do microscópio com lamínulas em uma gaveta ou caixa escura e seca por pelo menos 1 h para secar e selar a borda da lamínula. Termine de selar a borda das lamínulas com esmalte de secagem rápida e aguarde 10-15 minutos antes de fazer a imagem.
  26. A imagem é feita usando um microscópio confocal fluorescente ou de disco giratório equipado com os filtros de luz apropriados para visualizar a fluorescência azul, verde, vermelha e vermelha distante.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A capacidade de distinguir entre o NMP e os proteassomas intracelulares depende de abordagens de marcação impermeáveis à membrana. A alimentação de anticorpos permite o uso de anticorpos específicos da subunidade do proteassoma em neurônios vivos para rotular proteassomas acessíveis apenas do lado de fora da célula. Devido ao seu tamanho e hidrofilicidade, os anticorpos são incapazes de atravessar as membranas celulares intactas24. Os neurônios vivos mantêm a integ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os proteassomas são essenciais em todas as células e podem ser encontrados em todos os compartimentos da célula19. A recente descoberta de um complexo proteassoma especializado, o NMP, em neurônios dos sistemas nervosos central 25,26,27 e periférico 20 mudou nossa compreensão atual da função dos proteassomas. Trabalhos anteriores mostraram que o NM...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram não ter conflitos de interesse.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O EVL foi apoiado por fundos iniciais da Loyola University Chicago Stritch School of Medicine. Gostaríamos de agradecer a Robert Ladd por seus conselhos e assistência com o FACS.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Solução tampão HEPES 1 M, pH 7,3Qualidade Biológica118-089-721Buffer FACS
10x PBSThermo Fisher Científico70011-044Buffer FACS
solução estoque de paraformaldeído (PFA) a 16%; Grau EMEMS15710solução fixadora
1x solução salina tamponada com fosfato (PBS)Fisher Científico10-010-023Lavagens FACS
Tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mLFisher Científico14-959-6Tubos FACS
7-Aminoactinomicina D (7-AAD)InvitrogenA1310Rotula células mortas
Suplemento B27Thermo Fisher Científico17504044meio de cultura
Albumina de soro bovinoMilliporeSigmaA9647; CAS: 9048-46-8BSA/TI/DMEM
Cloreto de cálcio di-hidratado (CaCl?-2H? O)MilliporeSigmaC7902Solução salina completa
Cadeia pesada anti-neurofilamento de frango (NF-H)MilliporeSigmaAB5539anticorpo
DMEM/F12 1:1Thermo Fisher Científico11320033meio de cultura; BSA/TI/DMEM
Burro anti-cabra IgG (H+L) Alexa Fluor Plus 555Thermo Fisher CientíficoRolamento A32816anticorpo
Burro anti-coelho IgG (H+L) Alexa Fluor Plus 488Thermo Fisher CientíficoRolamento A32790anticorpo
DyLight 405 burro anti-frangoJackson ImmunoResearch703-475-155anticorpo
EDTAMilliporeSigmaE5134; CAS: 6381-92-6Soluções de trabalho Liberase TM / Liberase TL-papaína
Soro fetal bovino (FBS)MilliporeSigmaRolamento A9647meio de cultura/tampão FACS/solução de bloqueio
Pipeta pasteur de vidro, 9 polegadasFisher Científico1367820Dtitulação
Cabra anti-PSMA2Feito em casaNAanticorpo
HEPES em póMilliporeSigmaH4034Solução salina completa
HoechstThermo Fisher CientíficoH21492mancha nuclear
Soro de cavaloThermo Fisher Científico26050070solução de bloqueio
IB4, conjugado de biotinaMilliporeSigmaL2140anticorpo
LamininaSigma-AldrichL2020-1MGprato de cultura
L-glutaminaThermo Fisher Científico25030081meio de cultura
Trituração da liberase baixa (TL)MilliporeSigma54010200001Solução-mãe Liberase TL
Trituração da liberase moderada (MT)MilliporeSigma5401119001Solução de estoque Liberase TM
Cloreto de magnésio hexahidratado (MgCl?-6H? O)MilliporeSigmaM2393Solução salina completa
Mídia de montagemBiotecnologia do Sul0100-01Fluoromount-G
PapaínaWorthingtonGato #: 9001-73-4Solução de trabalho Liberase TL-papaína
Penicilina/estreptomicinaMilliporeSigma15140122meio de cultura/tampão FACS
Bromidrato de poli-L-lisina (PLL)MilliporeSigmaPág. 4707prato de cultura
Cloreto de potássio (KCl)MilliporeSigmaPág. 5405Solução salina completa
Coelho anti-CGRPImunoestrela24112anticorpo
cloreto de sódio (NaCl)MilliporeSigmaS9888; CAS: 7647-14-5Solução salina completa
SorbitolMilliporeSigma56755-MSolução salina completa
Conjugado estreptavidina Alexa Fluor 647Thermo Fisher CientíficoS21374anticorpo
SacaroseSigma-AldrichS0389-500Gsolução fixadora
Inibidor de tripsinaMilliporeSigmaT9253; CAS: 9035-91-8BSA/TI/DMEM

References

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