Artigo de método

Modelagem do Reparo Alveolar Pulmonar Displásico e Funcional após Infecção por Influenza

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DOI:

10.3791/69062

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19 de setembro de 2025

 ,  ,  , 
1Cancer and Developmental Biology Laboratory, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

Neste artigo

Resumo

Este protocolo fornece instruções para administração intranasal de IAV e análise a jusante de danos pulmonares em camundongos e alterações transcricionais associadas aos tipos de células pulmonares.

Resumo

A infecção viral causa danos agudos e de longo prazo ao alvéolo pulmonar, a estrutura tecidual especializada responsável pelas trocas gasosas entre o sistema cardiovascular e o ambiente externo. A infecção pelo vírus influenza A (IAV) em camundongos representa um modelo translacional para a resposta do pulmão humano à infecção viral e induz alterações transitórias e persistentes do estado celular no alvéolo. Em alguns casos, estados celulares aberrantes induzidos por lesão viral que não são resolvidos com o tempo podem prejudicar permanentemente a função crítica de troca gasosa do pulmão. Este artigo demonstra métodos para infecção intranasal de camundongos com IAV A/PR/8/34 e caracterização de alterações transitórias e duradouras na composição celular e estrutura tecidual de pulmões danificados. Este modelo permite uma investigação detalhada dos mecanismos moleculares e celulares subjacentes ao reparo pulmonar e à disfunção crônica. Essa abordagem também oferece uma plataforma para avaliar intervenções terapêuticas destinadas a promover a regeneração pulmonar eficaz e restaurar a função respiratória após lesão viral.

Introdução

Os pulmões desempenham um papel crucial no fornecimento de oxigênio e nutrientes aos tecidos locais. As células endoteliais (CEs) que povoam pequenos vasos sanguíneos capilares dos pulmões são essenciais para o bom funcionamento do tecido pulmonar, mantendo a integridade vascular e as trocas gasosas eficientes1. Os CEs formam o nicho vascular e reciprocamente se comunicam com outras células, como células epiteliais, células imunes e células mesenquimais. Isso contribui para a regulação do desenvolvimento pulmonar e do reparo tecidual em resposta a lesão ou doença2.

A infecção pelo vírus H1N1 Influenza A é um problema mundial3. Pacientes com infecção por H1N1 são frequentemente diagnosticados com dano alveolar difuso exsudativo (DAD)4. A infecção pelo H1N1 pode levar a sérios danos pulmonares e consequências graves, incluindo pneumonia, lesão pulmonar aguda grave (LPA) e síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA)5. O dano surge principalmente do vírus que infecta as células epiteliais pulmonares, o que provoca uma resposta imune excessiva, resultando em inflamação, danos aos tecidos e acúmulo de líquido nos pulmões. As células epiteliais que revestem as vias aéreas e os alvéolos, responsáveis pelas trocas gasosas, são diretamente prejudicadas pelo vírus H1N1, levando à ruptura da estrutura normal do pulmão 6,7. Tornou-se claro que outros tipos de células, embora não diretamente infectados pelo IAV, podem ser danificados em resposta à infecção 8,9. O dano tecidual após a infecção por influenza, portanto, afeta todos os compartimentos celulares do pulmão, e recentemente foi demonstrado que a infecção por IAV causa alterações transitórias e persistentes no estado celular em vários compartimentos celulares9. Essa plasticidade celular em resposta à doença pode ser útil ou prejudicial ao reparo bem-sucedido do tecido e justifica um estudo mais aprofundado.

O modelo experimental mais adotado para o estudo da influenza e sua patogênese é a infecção intranasal de camundongos com o vírus influenza A/PR/8/3410. É uma técnica importante que permite o estudo da gravidade da doença, mortalidade e infectividade viral. A infecção intranasal de camundongos mimetiza a rota natural de infecção em humanos e permite o estudo das respostas imunes adaptativas e inatas contra o vírus. Em 1934, uma cepa específica do vírus Influenza A "A/PR/8/34" foi isolada de um paciente em Porto Rico11. Esta cepa do vírus influenza agora foi adaptada a camundongos e não infecta mais humanos de forma produtiva. Devido às semelhanças nos sistemas imunológicos de camundongos e humanos, os camundongos são o modelo animal mais popular para a pesquisa do IAV12. Nesse método, a cepa A/PR/8/34 H1N1 é administrada diretamente a camundongos através das narinas, mimetizando uma infecção natural13. É um método fácil, econômico e conveniente para estudar os efeitos da infecção viral no tecido pulmonar do hospedeiro em condições de tipo selvagem (WT), bem como nocaute (KO). Técnicas alternativas apresentam vantagens e desvantagens em relação ao modelo intranasal. A inoculação intratraqueal (IT) permite a entrega precisa do vírus nos pulmões, mas essa técnica não imita totalmente a infecção por inalação e não fornece informações sobre toxicidade no trato respiratório superior. A inoculação de IT também requer grande habilidade para reduzir o risco de lesão traqueal13,14. A inoculação por inalação de aerossol (AR) imita a via natural de infecção e cria uma patologia pulmonar mais uniforme em comparação com a infecção intranasal, mas pode ser difícil manter a concentração uniforme do vírus no aerossol e obter uma entrega precisa do aerossol viral. A segurança também é uma preocupação importante do método de inoculação AR10. Portanto, a técnica de inoculação intranasal da administração de IAV é uma abordagem crucial para a pesquisa com foco pulmonar sobre os efeitos a jusante da infecção viral na lesão e reparo tecidual. Ao contrário dos modelos químicos ou mecânicos, ele fornece uma maneira mais realista e menos invasiva de estudar danos pulmonares induzidos por influenza e interações patógeno-hospedeiro.

Aqui, estabelecemos um método reprodutível para infecção intranasal de camundongos com o vírus Influenza A (A/PR/8/34) e para caracterizar as alterações celulares e estruturais de curto e longo prazo no alvéolo pulmonar que resultam de lesão viral. Estudos usando esse método podem ajudar na descoberta de mecanismos de dano e reparo do tecido pulmonar para identificar novos alvos terapêuticos para doenças pulmonares.

Protocolo

Trabalhar com o vírus influenza A em um modelo animal é considerado nível de biossegurança 2 (BSL2) e nível de biossegurança animal 2 (ABSL2). Todos os procedimentos em animais usados para gerar esses dados foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Centro de Pesquisa do Câncer, Instituto Nacional do Câncer, Institutos Nacionais de Saúde (Protocolo # 24-452). Este protocolo também é aprovado pelo Comitê Institucional de Biossegurança do Centro de Pesquisa do Câncer, Instituto Nacional do Câncer, Institutos Nacionais de Saúde. Antes de iniciar este protocolo, recomenda-se que os usuários busquem a aprovação de seu comitê institucional de cuidados e uso de animais e do comitê institucional de biossegurança.

1. Preparação do material de trabalho

NOTA: Todo o trabalho com o vírus influenza deve ser realizado no gelo em um gabinete de biossegurança. Ejete as pontas e qualquer outra coisa que entre em contato com o vírus em um recipiente com alvejante a 10%. Baldes de gelo, pipetas e caixas de ponta devem ser borrifados com solução de alvejante a 10% em vez de imersos. Incube em temperatura ambiente por pelo menos 30 min. Descarte os resíduos sólidos em um recipiente de resíduos de risco biológico e descarte os resíduos líquidos na pia, lavando com água.

  1. Descongele o estoque congelado (0,5 mL) de vírus no gelo em um gabinete de biossegurança.
  2. Configure um recipiente de resíduos contendo 10% de água sanitária na água da torneira. Coloque duas caixas de plástico ou papelão que possam conter até 100 tubos de amostra em um freezer a -80 °C para pré-resfriar.
  3. Pré-rotule 160 tubos de 1,5 mL para alíquotas de vírus. Os tubos com tampa de rosca são preferíveis aos tubos com tampa flip para evitar a criação de aerossóis ao abrir os tubos de estoque viral para uso. Coloque os tubos no gelo para pré-resfriar antes de fazer alíquotas de vírus.
  4. Faça alíquotas de 3 μL de vírus usando uma pipeta P20 calibrada e pontas, colocando o vírus apenas em tubos pré-resfriados e mantendo as alíquotas no gelo o tempo todo.
  5. Depois de fazer alíquotas, armazene-as em uma caixa de freezer pré-resfriada rotulada com "A/PR/8/34 Influenza Virus (IAV)", o número do catálogo, o número do lote e a data de validade.
    NOTA: Diferentes lotes de vírus têm diferentes infectividades e não devem ser misturados.
  6. Coloque a caixa em um freezer a -80 °C. Certifique-se de manter tudo o mais frio possível, pois o título viral diminuirá a cada ciclo de congelamento/descongelamento.

2. Alíquotas diluídas de vírus para uso em experimentos de infecção intranasal

  1. Descongelar uma alíquota de 3 μL de estoque viral em gelo no gabinete de biossegurança.
  2. Fazer uma diluição de 1:100 (diluição A) transferindo 2 μL da alíquota de 3 μL para um tubo pré-resfriado de 1,5 ml contendo 198 μL de D-PBS frio.
  3. Continue a diluir o estoque viral até atingir a concentração apropriada para 0,5-1 LD50 no fundo da cepa dos camundongos usados. Mantenha tudo no gelo e use tubos pré-resfriados para evitar o superaquecimento do vírus.
    NOTA: Por exemplo, para VR-95PQ, lote 70063082, infecte camundongos com vírus 12.600 a 31.500 CEID50 / μL (dimensionado pelo peso corporal) em uma diluição de 1:500.000.
  4. A partir da diluição A (1:100), fazer uma diluição de 1:50.000 (diluição B) adicionando 10 μL de diluição A a 4990 μL de D-PBS frio em um tubo pré-resfriado de 15 mL. Misture bem pipetando para cima e para baixo usando uma pipeta sorológica de 5 mL.
  5. A partir da diluição B, faça uma diluição de 1:500.000 (diluição C) adicionando 200 μL de diluição B a 1,8 mL de D-PBS em um tubo pré-resfriado de 5 mL. Misture bem pipetando para cima e para baixo.
    NOTA: Para determinar a diluição ideal do vírus a ser usada na infecção dos animais na compra de um novo lote, é possível estimar usando o título do vírus indicado na ficha do produto e ajustando a diluição com base no título do lote anterior. A melhor maneira de determinar a diluição ideal é titular empiricamente o novo lote de vírus usando camundongos C57BL / 6 do tipo selvagem. Planeje uma variedade de diluições de 1:50.000 a 1:500.000 e encomende 1-2 gaiolas de camundongos fêmeas C57BL/6 por diluição para testar. Infecte camundongos em diferentes concentrações e monitore sua perda de peso. Para testar os títulos virais, o estudo propõe o uso apenas de camundongos fêmeas para reduzir a variabilidade que pode ser causada por diferenças de sexo ou peso entre os camundongos. Os camundongos fêmeas geralmente ficam mais doentes do que os camundongos machos, possivelmente devido ao seu tamanho menor ou devido a diferenças específicas do sexo na resposta à infecção por influenza, como ocorre em outras formas de lesão pulmonar em camundongos15. Embora isso não tenha sido estudado em detalhes, camundongos fêmeas foram usados nos experimentos de título porque se o título fosse determinado usando camundongos machos, camundongos fêmeas poderiam morrer na dose determinada. No entanto, verificou-se que os camundongos machos ficam consideravelmente doentes e apresentam lesões pulmonares perceptíveis quando infectados com um título viral, que foi determinado usando apenas camundongos fêmeas. Uma diluição ideal se usar camundongos de fundo misto ou não consanguíneos será "1 LD50", a diluição na qual 50% dos camundongos C57BL / 6 do tipo selvagem morrem. Camundongos não consanguíneos são mais resistentes à infecção16 e serão feridos e se recuperarão bem nessa diluição. Se os camundongos para o experimento estiverem em um fundo C57BL / 6 endogâmico, a dose ideal será metade desse "0,5 LD50". Como o objetivo desses experimentos é estudar lesões e reparos, é ideal definir uma dose na qual os camundongos adoecem e perdem 20-25% de seu peso corporal, mas a maioria dos camundongos acaba se recuperando (Figura 1). Se todos os camundongos do estudo tiverem aproximadamente o mesmo peso (~ 25 g), é possível administrar o vírus influenza a 50 μL da diluição apropriada para cada camundongo. No entanto, os ratos variam em peso de 15 a 35 g. Portanto, administre 2 μL de diluição viral por grama de peso corporal (por exemplo, um camundongo de 15 g receberia 30 μL de influenza, enquanto um camundongo de 35 g receberia 70 μL). Isso resulta em um nível mais consistente de infecção e dano tecidual em animais de tamanhos diferentes. Esta informação é necessária para planear o volume de diluição C.

3. Transporte de alíquotas virais para biotérios

  1. Coloque o tubo de 5 mL com a diluição viral final no gelo e rotule o recipiente com um adesivo de risco biológico. Forre uma caixa de plástico com toalhas de papel para absorver possíveis derramamentos.
  2. Coloque os materiais necessários para infecção intranasal dentro da caixa rotulada com risco biológico: uma pipeta P200, uma caixa fechada de pontas de pipeta P200 filtradas, uma caneta e um tubo cônico de 50 mL cheio de água sanitária fresca a 10% para resíduos virais. Como controle de infecção, encha um tubo de 1,5 mL com o mesmo D-PBS frio usado para diluir o IAV.

4. Administração de IAV a camundongos

NOTA: Trabalhar com o vírus influenza na instalação animal requer uma instalação de nível de segurança ABSL2. O EPI padrão inclui jalecos, jaleco descartável, dois gorros de cabelo, luvas duplas de nitrilo, capas duplas para sapatos, óculos de proteção (óculos de segurança) e uma máscara. O vírus da gripe diluído deve ser mantido no gelo durante todo o protocolo de administração para evitar a perda de infecciosidade.

  1. Todo o trabalho com vírus deve ocorrer dentro de um gabinete de biossegurança. Embora o vírus influenza A/PR/8/34 seja uma cepa adaptada a camundongos, os vírus influenza são propensos a mutações e, portanto, tratam o vírus como se fosse potencialmente infeccioso para humanos.
  2. Administre anestesia com isoflurano aos animais, um de cada vez, a uma taxa de fluxo de 2,5-3% na máquina vaporizadora. Mova os animais de uma caixa de anestesia para um cone nasal antes de administrar a gripe.
  3. Quando um camundongo está sob anestesia, verifique sua respiração e belisque o dedo do pé para ver se ele reage. Os camundongos estão prontos para a infecção por IAV quando reagem a um beliscão no dedo do pé com uma pequena convulsão ou "salto" - mas não se estiverem acordados o suficiente para mover a cabeça.
  4. Usando uma pipeta P200 ajustada para 50 μL (ou 2 μL/g de peso corporal; consulte a NOTA abaixo da etapa 2.5), aspire o IAV diluído (ou controle PBS) do frasco para injetáveis no gelo e coloque a pipeta na caixa de ponteiras ou toalha de papel onde a ponteira não entre em contato com as luvas ou com a superfície do gabinete de biossegurança.
  5. Pegue o mouse anestesiado com scruffing e segure o mouse voltado para cima em um ângulo de 45°. Aperte o mouse com força suficiente para que a traqueia fique alongada para melhor inalação, mas não com tanta força que a respiração seja obstruída. Certifique-se de que a respiração do mouse seja superficial, mas consistente, sem ofegar.
  6. Pipete lentamente a diluição do IAV nas narinas do camundongo. Isso pode ser feito com êxito usando um dos dois métodos, conforme descrito nas etapas 4.6.1 e 4.6.2.
    1. Solte a diluição viral nas narinas gota a gota, alternando entre as narinas para que o vírus entre em ambos os lados do nariz.
    2. Crie uma "bolha" de vírus abrangendo ambas as narinas, mantida por pipetagem consistente e lenta enquanto o camundongo inala o líquido.
      NOTA: Este estudo utilizou consistentemente o método de instilação de bolhas, que foi mais controlado e reprodutível. Este método permite a fácil entrega da suspensão do vírus nas narinas sob anestesia e facilita a respiração natural. O método dropwise é igualmente válido, mas qualquer que seja o método usado, a consistência no método deve ser aplicada em todos os experimentos para garantir menos variabilidade nos resultados.
  7. Segure a ponta da pipeta perto do nariz, mas não toque no nariz. Se o camundongo estiver acordando, administre metade da dose e retorne o camundongo ao cone nasal de isoflurano antes de administrar a segunda metade da dose.
  8. Se o camundongo estiver acordado o suficiente para balançar a cabeça, tossir ou cuspir o vírus, mais anestesia é necessária para evitar causar vírus em aerossol e garantir uma boa infecção. Se o rato não estiver acordado, administre a dose completa. Se o mouse foi colocado de volta no cone do nariz, repita a etapa 4.6 para administrar o IAV restante.
  9. Ejete a ponta em um recipiente de resíduos contendo alvejante fresco a 10%. Use uma nova ponta para cada gaiola de ratos.
  10. Após cada administração de IAV, segure o mouse na posição vertical por 1-2 minutos para manter as vias aéreas abertas e certifique-se de que a gripe foi administrada adequadamente aos pulmões. Se o vírus da gripe foi entregue com sucesso aos pulmões do camundongo, os estalos podem ser sentidos colocando um dedo sobre cada lado do peito do camundongo.
  11. Depois que o mouse começar a se recuperar, coloque-o de volta na gaiola para se recuperar totalmente. Os camundongos se recuperam rapidamente do isoflurano, mas precisam ser monitorados até que sejam ambulatórios.
  12. Registre eventos como crepitações no peito e respiração profunda que indicam que o IAV foi bem inalado, ou bolhas e pulverização nasal que indicam que parte dele foi expelido das narinas do camundongo. Acompanhe essas informações em uma planilha de registro de lesões (Arquivo Suplementar 1) e caderno de laboratório.
  13. Repita as etapas 4.2-4.12 para cada camundongo a ser infectado.

5. Transporte de volta ao laboratório

  1. Coloque 50 mL cônicos contendo alvejante e pontas de volta na caixa plástica de suporte de amostras, junto com a diluição restante do IAV (se houver) e os itens de laboratório usados para infecção por gripe.
  2. Uma vez de volta ao laboratório, incube qualquer coisa que tenha entrado em contato com o vírus com 10% de alvejante. Pulverize baldes de gelo, pipetas e caixas de ponta com solução de alvejante a 10% em vez de imergir. Incube em temperatura ambiente por pelo menos 30 min. Descarte os resíduos sólidos no recipiente de resíduos de risco biológico e descarte os resíduos líquidos na pia, lavando com água.

6. Monitoramento de camundongos e procedimentos experimentais adicionais

  1. Monitore o escore de condição corporal (BCS)17 e o peso corporal de todos os camundongos controles (PBS) e infectados com IAV diariamente após a infecção por influenza, começando no dia seguinte à infecção (dia 1) ou 3 dias após a infecção (dia 4). É improvável que camundongos infectados com IAV percam peso substancial até o dia 4 após a infecção (Figura 1).
    NOTA: Os camundongos que perdem mais de 30% do peso corporal ou atingem uma pontuação de condição corporal de 1 devem ser sacrificados.
  2. Se desejar, administre EdU a camundongos por injeção intraperitoneal (i.p.) ou na água potável para monitorar a proliferação celular após a infecção por influenza.
    NOTA: Muitos tipos de células no pulmão do camundongo proliferam após danos induzidos por IAV9. É possível administrar outros medicamentos, alimentos especiais ou água especial conforme desejado para fins experimentais específicos. Lembre-se de que os camundongos não comem ou bebem tanto quanto de costume durante a recuperação da gripe, portanto, um método de administração baseado em injeção pode ser mais desejável; por outro lado, pode ser difícil injetar camundongos com um BCS de 2-2,5.

7. Colheita de tecido pulmonar para abordagens a jusante

  1. Colete tecido pulmonar para aplicações a jusante, incluindo análise de imunofluorescência, citometria de fluxo ou sequenciamento de RNA de célula única nas instalações de camundongos ou no laboratório em um gabinete de biossegurança.
  2. Eutanasiar camundongos um de cada vez usando CO2. Não desloque cervical para evitar o deslocamento da traqueia. A toracotomia bilateral geralmente é um método de eutanásia secundária aprovado.
    NOTA: Este estudo segue as diretrizes de cuidados com animais aprovadas pela instituição e o protocolo de eutanásia de CO2 e tem usado consistentemente esse método em estudos anteriores de influenza sem introduzir variabilidade significativa na lesão pulmonar ou nos resultados histopatológicos. A cetamina / xilazina também pode ser usada para sacrificar camundongos para evitar danos causados pela inalação de CO2 . No entanto, a inalação de CO2 é um método aceitável se a aquisição de cetamina/xilazina for muito cara ou se a obtenção de uma licença da DEA for muito difícil.
  3. Disseque a cavidade torácica e exponha a caixa torácica e a traqueia.
  4. Abra o diafragma e disseque-o para longe da caixa torácica com cuidado para não perfurar os pulmões. Corte ao longo das laterais da caixa torácica e remova a caixa torácica na parte superior. Corte as clavículas e disseque o osso e o tecido mole longe da frente da traqueia.
  5. Disseque o músculo e o tecido ao redor da traqueia até que os anéis de cartilagem fiquem visíveis, mas não perfure a traqueia. Usando uma pinça curva, empurre o esôfago para fora de trás da traqueia e disseque-o para longe da traqueia.
  6. Passe um pedaço de sutura atrás da traqueia e dê um nó de sutura solto (laço duplo de uma extremidade ao redor de uma pinça com outra, pegue a ponta solta da sutura e puxe a ponta solta pelas alças).
  7. Perfundir o sistema circulatório com D-PBS. Prenda um vaso grande (sob o membro anterior ou na parte inferior do diafragma) e perfunda o D-PBS através do ventrículo direito (parte inferior do coração, voltado para cima) empurrando lentamente a extremidade da seringa. Se a agulha não for visível através da parede do coração, é provável que esteja no ventrículo esquerdo. Isso remove o sangue dos pulmões.
    NOTA: Não empurre bolhas. Se houver bolhas na linha, expulse-as antes de empurrar o D-PBS com a seringa. Se a morte das células endoteliais for uma preocupação, é mais suave usar a perfusão por gravidade em vez de empurrar o PBS com a mão.
  8. Se estiver coletando tecido apenas para histologia ou imunofluorescência, prossiga para a etapa 7.9; se coletar apenas para suspensão de célula única, corte todos os lobos pulmonares e coloque-os em PBS no gelo e, em seguida, prossiga para a etapa 7.11.
  9. Insuflação pulmonar para imunofluorescência ou histologia a jusante:
    1. Infle os pulmões em paraformaldeído a 2% (PFA) e desidrate com etanol para inclusão em parafina ou infle com PFA a 2% e desidrate com sacarose para criossecção.
    2. Para técnicas de detecção de RNA, como RNAscope ou reação em cadeia de hibridização (HCR), fixe os pulmões em 4% de PFA. Para melhor fixação, infle os pulmões em agarose de fusão ultrabaixa a 2% e corte imediatamente um micrótomo vibratório em PFA a 2% ou 4% em uma placa de cultura de tecidos para imunofluorescência a jusante.
  10. Insuflação pulmonar com a mão:
    1. Infle os pulmões manualmente com uma seringa e agulha 21-23 G com ou sem tubo ou usando a gravidade, fixando um tubo de PFA em um suporte de anel 30 cm acima da superfície da bancada.
    2. Depois de isolar a traqueia, insira a agulha na parte superior da traqueia, incline, sem perfurar a parte inferior da traqueia, e aperte a sutura ao redor da traqueia e da agulha antes de inserir o líquido.
      NOTA: O uso de uma agulha afiada apresenta um pequeno risco de punção traqueal em comparação com uma agulha de ponta romba, e os pesquisadores devem tomar muito cuidado durante o procedimento para evitar qualquer dano. Se uma agulha afiada estiver perfurando a traqueia, uma agulha de ponta romba deve ser usada.
  11. Para criar uma suspensão de célula única para citometria de fluxo a jusante ou análise de sequenciamento de célula única, remova o tecido pulmonar do D-PBS e pique o tecido pulmonar com uma tesoura e, em seguida, pique com uma lâmina de barbear por 2-3 minutos para obter pedaços de tecido ainda mais finos.
  12. Dissociar em tampão de digestão contendo 480 U / mL de colagenase I, 100 μL / mL de dispase e 2 μL / mL de DNase em D-PBS, a 37 ° C por 30-35 min. Filtre através de filtros de 100 μm e 40 μm, lise quaisquer glóbulos vermelhos restantes usando tampão de lise de cloreto de amônio-potássio (ACK) e ressuspenda em 1% BSA em PBS para processamento e análise a jusante.
    NOTA: Para detectar infecção viral e eliminação após infecção nos pulmões, é possível avaliar a carga viral usando o ensaio qRT-PCR ou TCID50 em homogeneizados pulmonares para medir a replicação viral. A coloração de neuraminidase e capsídeo também pode ser usada para detectar infecção viral. A depuração viral deve ocorrer nos dias 8-9 após a infecção18,19, enquanto o reparo e a regeneração do tecido pulmonar continuam por várias semanas9.

Resultados

Em comparação com camundongos não infectados tratados com PBS, os camundongos infectados com IAV demonstrarão danos teciduais heterogêneos (Figura 1A). O dano tecidual pode ser quantificado usando um algoritmo de agrupamento k-means no MATLAB20 (Figura 1B). Os camundongos infectados com IAV começarão a perder peso entre 3-4 dias após a infecção. Em um título ideal, os camundongos perderão entre 20-30% de seu peso corporal inicial, com a perda máxima de peso ocorrendo em 8-10 dias após a infecção (dpi) (Figura 1C). Por 11-12 dpi, os camundongos devem ter começado a ganhar peso e devem retornar a 10-15% de seu peso corporal inicial em 14 dpi. Para estudos de regeneração, é útil se a maioria dos camundongos no experimento perder peso e sofrer danos nos tecidos, mas não morrer. No entanto, devido à heterogeneidade no dano tecidual ( Figura 1A, B ) e à possível variabilidade na administração intranasal, é normal que vários camundongos em um experimento não percam peso ou sofram danos teciduais e que vários camundongos percam > 30% do peso corporal, resultando em eutanásia ( Figura 1D ). Experimentos que se esforçam para determinar uma diferença na sobrevivência e perda de peso entre, por exemplo, camundongos com KO de um determinado gene e seus controles WT podem precisar ajustar o título e a dosagem de IAV e precisarão realizar um cálculo de poder para determinar o tamanho da amostra necessário para detectar tal diferença nesses dois parâmetros.

Além das alterações na estrutura geral do tecido e na saúde do camundongo, as alterações transcricionais em todos os compartimentos celulares pulmonares ocorrem ao longo da resposta do tecido ao dano. Isso inclui estados celulares transitórios que acabam se resolvendo à medida que o tecido é reparado, incluindo estados de células epiteliais transicionais ou intermediárias e estados de células imunes mieloides, e estados celulares persistentes que não contribuem para o reparo funcional, incluindo células epiteliais Krt5+ e células endoteliais TrkB+9. Por exemplo, no endotélio capilar do pulmão de camundongo, um estado transitório de células endoteliais estimuladas por interferon surge em 6 dpi, caracterizado por alta expressão de genes estimulados por interferon (Figura 2A). Esse estado é resolvido em 11-19 dpi (Figura 2A). Um estado endotelial capilar induzido por lesão (iCAP) surge em 11 dpi, caracterizado por alta expressão de Ntrk2 (TRKB), Sparcl1 e Bnip3 (Figura 2B). Ao contrário do estado da célula endotelial estimulada por interferon, o estado da célula endotelial do iCAP persiste em regiões de tecido gravemente danificado e ainda está presente um ano após a infecção (Figura 2C). Os estados transitórios das células epiteliais alveolares, incluindo células de transição alveolar e estados de células epiteliais alveolares imaturas tipo I (AT1), também surgem após a infecção (Figura 2D). Finalmente, a infecção resulta na perda de muitos macrófagos alveolares endógenos (aMAC_a) e sua reconstituição de monócitos inflamatórios (iMON) e aMACs endógenos. Os macrófagos alveolares 1 ano após a infecção apresentam diferentes estados transcricionais (aMAC_a e aMAC_b) dependendo de sua origem (Figura 2E)9. Os estados celulares transitórios e persistentes que surgem após lesão pulmonar aguda justificam um estudo mais aprofundado, pois seu comportamento anormal dentro do nicho pode contribuir produtiva ou negativamente para o reparo bem-sucedido do tecido e subsequente função do tecido. Os dados de sequenciamento de RNA de célula única foram publicados anteriormente9 e são depositados no Gene Expression Omnibus como GEO: GSE262927.

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Figura 1: Monitoramento de lesões pulmonares e saúde animal. (A) Coloração de hematoxilina e eosina (HE) de seções de tecido pulmonar de um pulmão infectado simulado (tratado com PBS) à esquerda e um pulmão infectado com IAV à direita. Comparado ao pulmão não lesado, o pulmão infectado com IAV mostra dano tecidual heterogêneo. Barras de escala, 1 mm. (B) Usando um algoritmo de agrupamento k-means no MATLAB20, o dano tecidual pode ser caracterizado como grave (vermelho), danificado (verde) ou normal (azul). É importante notar que no lobo pulmonar tratado com PBS à esquerda, as estruturas das vias aéreas são classificadas como "graves" devido à densidade e intensidade de coloração das células epiteliais das vias aéreas. No entanto, ainda é possível discernir facilmente a diferença entre pulmões tratados com PBS e infectados com influenza devido a essa linha de base. Barras de escala, 1 mm. (C) Exemplo de curva de perda de peso de um experimento representativo de infecção por IAV no qual os pulmões de camundongos foram coletados 13 dias após a infecção (dpi). A curva contém dados de seis camundongos do tipo selvagem e os pontos representam a média, enquanto as barras de erro representam o erro padrão da média. (D) Exemplo de curva de sobrevivência de um experimento representativo de infecção por IAV no qual os pulmões de camundongos foram coletados 14 dias após a infecção (dpi). A curva contém dados de sete camundongos do tipo selvagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Monitoramento das alterações do estado das células endoteliais capilares após a infecção por IAV. (A) Um estado de EC estimulado por interferon surge a 6 dpi que é resolvido entre 11-19 dpi. A reanálise dos dados publicados de sequenciamento de RNA de célula única de pulmões de camundongos em vários momentos diferentes após a infecção por influenza mostra que a pontuação do módulo de interferon em todos os tipos de células endoteliais capilares é mais alta em 6 dpi. Os dados foram reanalisados usando R, e a pontuação do módulo de interferon é baseada na expressão de 87 genes estimulados por interferon dentro de cada tipo de célula. CAP1, célula endotelial capilar tipo 1; iCAP, célula endotelial induzida por lesão; CAP2, célula endotelial capilar tipo 2; CE, célula endotelial. (B) Em contraste, um estado de CE induzido por lesão caracterizado pela expressão de Ntrk2 (TRKB) surge em 11 dpi e persiste até um ano após a infecção. Barra de escala, 500 μm. (C) Dados transcricionais do sequenciamento de RNA de célula única de células endoteliais capilares pulmonares após infecção por influenza demonstram a natureza dinâmica do estado das células endoteliais capilares durante o reparo tecidual. (D) As células epiteliais alveolares também experimentam plasticidade celular após a infecção por influenza. Um tipo de célula de transição alveolar surge entre 6-11 dpi e é resolvido em 19 dpi. Um estado de célula AT1 imaturo (AT1_c) surge a 11 dpi e persiste até 90 dpi. (E) Após a infecção, muitos macrófagos alveolares existentes (aMAC_a) são perdidos e um influxo de monócitos inflamatórios (iMON) é observado a 6 dpi. A população de macrófagos alveolares é reconstituída tanto por aMACs existentes para regenerar a população aMAC_a, quanto por monócitos inflamatórios, gerando a população aMAC_b. Embora ambos representem um estado de macrófagos alveolares, os aMACs resultantes podem ser distinguidos transcricionalmente. Os gráficos em (CE) indicam a porcentagem de células em cada população em cada ponto de tempo no conjunto de dados de infecção longitudinal por influenza e foram gerados usando R. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo Suplementar 1: Registro de lesões de amostra, registro de peso e registro de pontuação de condição corporal (BCS) para monitorar animais após infecção por influenza. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Aqui, relatamos um método conveniente de transferir o vírus influenza para camundongos para iniciar danos rápidos e eficazes aos pulmões de camundongos e estudar mecanismos de regeneração bem-sucedida e reparo displásico. Demonstramos que a inoculação intranasal de A/PR/8/34 IAV pode ser uma técnica livre de estresse. Leva menos de 2 minutos por camundongo para completar a inoculação após a anestesia com isoflurano. É uma técnica simples e não invasiva de inoculação viral que segue a via natural de infecção e permite o estudo da resposta tanto do tecido quanto do sistema imunológico de maneira mais fisiologicamente relevante. O vírus inoculado pelas narinas de camundongos pode induzir imunidade mucosa e sistêmica21. Mais importante, o dano causado pela infecção viral é claramente visível em cortes de tecido pulmonar corados com hematoxilina e eosina (HE)22 (Figura 1). Uma linha do tempo completa das mudanças transcricionais esperadas nos tipos de células pulmonares em cada compartimento do pulmão foi publicada anteriormente9. Aqui, reanalisamos um subconjunto desses dados para demonstrar que nos compartimentos imunológicos endotelial capilar, epitelial alveolar e mieloide dos pulmões de camundongos, ocorrem alterações transcricionais transitórias e persistentes ao longo da resposta à infecção por influenza de camundongos não infectados até um ano após a infecção (Figura 2).

Existem várias etapas críticas neste protocolo, e a solução de problemas apropriada dessas etapas produzirá um experimento bem-sucedido. O vírus influenza A/PR/8/34 é uma cepa de influenza adaptada a camundongos que não infecta humanos de forma produtiva23, mas é sempre importante seguir todos os procedimentos de segurança indicados durante o experimento para evitar qualquer possibilidade de infecção do pessoal do laboratório. A administração de anestesia com isoflurano é uma etapa crítica para garantir a entrega bem-sucedida do vírus, pois os camundongos não inalam bem o vírus quando estão acordados. Verifique a respiração e monitore o movimento da cabeça do camundongo durante o procedimento para garantir que o vírus seja inoculado em ambas as narinas. Se os camundongos não estiverem totalmente anestesiados, bolhas podem ser geradas, o que limita a inalação do vírus e gera aerossóis. Ambos os desfechos devem ser evitados, e os camundongos devem ser colocados de volta no cone nasal do isoflurano se forem observados espirros ou bolhas nas narinas. O monitoramento pós-infecção, como medir a perda de peso, o escore de condição corporal e o estado de saúde, além de fornecer um suplemento alimentar de recuperação, também é um componente importante desse experimento. Se for observado que os camundongos não perdem peso adequado ou não apresentam a quantidade esperada de dano tecidual (Figura 1), é possível que a dose seja muito baixa; Por outro lado, se muitos camundongos atingirem o ponto final de perda de peso corporal de 30%, é possível que a dose seja muito alta. Em ambos os casos, é melhor determinar a dose adequada por meio de um título empírico do lote de vírus usando uma coorte de camundongos C57BL / 6, conforme descrito aqui.

Como a infecção por influenza continua a ser prevalente em todo o mundo, causa doenças respiratórias graves e pode ser fatal, entender o processo de infectividade viral e a resposta celular à infecção e lesão tecidual no pulmão é de primordial importância. O método de infecção intranasal descrito neste estudo pode, portanto, ajudar na identificação de importantes mecanismos regulatórios e no desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para doenças pulmonares. Além disso, futuras aplicações da técnica podem usar uma cepa diferente do vírus influenza adaptado a camundongos, como o X31, para determinar os efeitos na estrutura e função do tecido pulmonar no caso de infecções respiratórias repetitivas. Como muitas pessoas estão sujeitas a múltiplas infecções respiratórias durante a vida, essa extensão desse modelo pode ter implicações importantes para o estudo da regeneração do tecido pulmonar e, portanto, para a saúde pública.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa Intramural dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (NIH), Instituto Nacional do Câncer, Centro de Pesquisa do Câncer.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1,5 mL tubo  Fisher Scientific02-682-557
100 & micro; Filtro de células MFalcon352360
Tubo cônico de 15 mLFalcon352196
1x PBSGibc010010-023
40 & micro; Filtro de células MFalcon352340
Tubo de 5 mLGlobo6101C
Tubo cônico de 50 mLFalcon352098
Estoque do Vírus da Influenza A/PR/8/34ATCC VR-95PQLotes diferentes têm títulos virais diferentes
Buffer de Lise ACKQualidade Biológico118-156-101
Anticorpo anti-TRKBR& Sistemas DAF1494
Água sanitáriaClorox10% de água sanitária
Albumina Sérica BovinaSigma AldrichA8022
Câmara de Indução de Anestesia por CO2QualquerN/A
Colagenase Tipo IGibco17100017
DAPIMilipore Sigma28718-90-3
DispaseCorningCB-40235
Ferramentas de dissecação: tesoura, pinça curva, pinça retaQualquerN/A
DnaseSigma Aldrich4716728001
D-PBSCorning21-031-CM
EtanolPharmco111000200
Frascos de vidroDWK Ciências da Vida986562
Balde de geloQualquerN/A
IsofluranoCovetrus29404
Agulhas, 21 e traço; 23 GQualquerN/A
Pipeta P20/P200 & nbsp;PipetmanF144056M/F144058M,
Pontas de pipeta P20/P200Thomas Scientific1159M43/1159M40
Paraformaldeído (PFA) Termo CientíficaJ19943-k22%PFA
PipetmanQualquerN/A
Caixas de freezer de plástico ou papelãoQualquerN/A
Lâmina de barbearQualquerN/A
Suporte do RingueQualquerN/A
Pipetas sorológicas, 5 mLFalcon357543
Câmara de Isoflurano de Isoflurano de Mouse por Indução de Topo DeslizanteSomni Scientific
SuturaFisher ScientificNC9422522
Tubos de seringa e luer-locksQualquerN/A
Seringa, 10 mLQualquerN/A
Máquina de Anestesia de Mesa IsofluranoOhmedaOhmeda Isotec- 4A vazão deve ser 2,5 e traço; 3%
Agarose de fusão ultra-baixaSigma AldrichA5030-1G
Pesagem da balançaOHAUSCS200

Referências

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