Artigo de investigação
O CD44 facilita a patogênese da doença orquestrando cascatas inflamatórias e diferenciação osteoclástica por meio da ativação da via PI3K/Akt. A gliciteína exerce efeitos terapêuticos nas manifestações de osteoporose (PO) + periodontite (DP) comórbidas por meio da atenuação direcionada da sinalização mediada por CD44.
Esta investigação elucida os determinantes moleculares críticos associados à comorbidade da osteoporose (PO) e periodontite (DP) por meio do perfil proteômico, ao mesmo tempo em que delineia a função regulatória do CD44 na periodontite experimental em um modelo murino de OP. A Fase I envolveu a coleta de amostras de soro de pacientes com PO+PD (n = 3) e controles saudáveis (n = 6) submetidos a avaliações de saúde de rotina em nossa instituição para análise proteômica comparativa. A validação translacional subsequente de genes diferencialmente expressos (DEGs) e cascatas de sinalização associadas foi conduzida em amostras clínicas e modelos murinos OP + PD. Para caracterizar mecanicamente o papel do CD44 na progressão da DP em condições osteoporóticas, um modelo murino OP foi gerado por meio de ovariectomia bilateral, seguido de indução experimental de DP por meio de colocação de ligadura. As avaliações abrangentes incluíram alterações histomorfométricas por meio da coloração de hematoxilina-eosina, análise óssea microarquitetônica na região do primeiro molar superior usando micro-CT e avaliação imunoblotting dos componentes da via fosfoinositídeo-3-quinase (PI3K)/Akt. A triagem farmacológica em rede paralela acoplada a simulações de docking molecular foi executada para identificar constituintes bioativos de Angelica sinensis com potencial terapêutico. A interrogação proteômica identificou CST3, A2M, CD44, CDH13, CETP e VWF como candidatos a mediadores patogênicos na patogênese de OP + PD. Em nossas mãos, a análise de enriquecimento do conjunto de genes revelou que a sinalização PI3K / Akt funciona como um mediador principal da progressão da doença OP + PD. A validação quantitativa baseada em PCR de transcrição reversa confirmou uma regulação positiva significativa de CD44 em coortes OP + PD clínicas e experimentais. A modulação in vivo via supressão de CD44 restaurou significativamente a integridade do tecido periodontal, reduziu a infiltração de células inflamatórias e fortaleceu a microarquitetura óssea alveolar em camundongos OP, concomitante com a inibição da via PI3K / Akt. A farmacologia da rede revelou a gliciteína como o principal fitoquímico bioativo em Angelica sinensis, com CD44 identificado como seu alvo molecular central. A gliciteína melhorou a estrutura óssea alveolar em camundongos OP+PD, aumentando a fração de volume ósseo (BV/TV), a espessura trabecular (Tb.Th), a densidade mineral óssea (DMO) e reduzindo o número trabecular (Tb.N), a relação entre a superfície óssea e o volume ósseo (BS/BV), indicando uma qualidade óssea mais saudável, mecanicamente atribuída à atenuação do eixo de sinalização CD44.
A periodontite (DP) é uma doença microbiana complexa e mista causada pela deposição de biofilmes patológicos no sulco gengival1. É caracterizada por um desequilíbrio no ambiente microecológico que desencadeia uma cascata inflamatória patológica dentro do hospedeiro, levando a danos progressivos irreversíveis ao cemento, ligamento periodontal e osso alveolar, que são componentes do sistema de fixação periodontal. Isso pode resultar em afrouxamento do dente ou até mesmo perda2. A quantidade foi padronizada para comparabilidade, e os dados epidemiológicos mais recentes3 indicam que mais de 1,066 bilhão de indivíduos em todo o mundo sofrem de periodontite grave, com uma prevalência padronizada por idade de aproximadamente 12,5%, destacando uma variação considerável entre as populações internacionais.
A osteoporose (PO), uma doença óssea sistêmica, é caracterizada por uma degradação substancial da microestrutura óssea e uma perda sistemática de massa óssea 4,5. O risco de fraturas é muito aumentado por essa fraqueza estrutural, especialmente em pessoas idosas. Notavelmente, pessoas com 65 anos ou mais no Japão tiveram uma prevalência maior de doença periodontal do que adultos entre 30 e 64 anos. Mulheres na pós-menopausa têm maior incidência de doença periodontal e frequentemente apresentam outros problemas de saúde 6,7. O estudo prevê que, de 2005 a 2025, a carga da doença aumentará em mais de 50%, com o custo econômico previsto para aumentar de US$ 17 bilhões para US$ 25 bilhões. O estudo prevê que, de 2005 a 2025, a carga da doença aumentará em mais de 50%, com o custo econômico previsto para aumentar de US$ 17 bilhões para US$ 25 bilhões. Essa tendência destaca o impacto socioeconômico significativo dessas doenças periodontais. Além disso, em pacientes do sexo feminino com doença periodontal e gengivite, há uma clara correlação positiva entre a duração da doença e sua cronicidade e o aumento dos riscos à saúde8.
Estudos anteriores indicaram que a PO pode promover o desenvolvimento de DP e vice-versa devido a fatores de risco comuns para ambas as doenças, como envelhecimento, tabagismo e ingestão inadequada de cálcio e vitamina D. Na população feminina na pós-menopausa, a PO grave pode ser acompanhada por conteúdo mineral mandibular reduzido, o que pode estar associado a níveis deficientes de inserção periodontal9. Foi demonstrado que a densidade óssea reduzida associada à PO pode acelerar a reabsorção óssea alveolar induzida pela DP, favorecendo assim a invasão de patógenos periodontais10. Entre uma série de desafios de saúde relacionados à idade e às mudanças fisiológicas, a DP e a OP são particularmente proeminentes com a aceleração do envelhecimento da população global e o aumento significativo no número de mulheres na menopausa. Portanto, esclarecer os indicadores relevantes e suas associações é de crucial importância para a prevenção, tratamento e avaliação prognóstica da doença. Motivado por esses aspectos, este estudo utilizou proteômica para rastrear proteínas-chave, com ênfase na sinalização PI3K/Akt mediada por CD44, no desenvolvimento de OP+PD, explorando os papéis regulatórios e possíveis mecanismos de proteínas-chave usando um modelo experimental de PD em camundongos OP. Triagem adicional de agentes terapêuticos direcionados presentes em Angelica sinensis - uma erva medicinal tradicional chinesa amplamente utilizada na prática clínica por suas propriedades anti-inflamatórias e protetoras ósseas, e relatada anteriormente para aliviar a perda óssea e modular as respostas inflamatórias na osteoporose e doença periodontal. Guiada pela farmacologia da rede e docking molecular, a gliciteína foi identificada como o fitoquímico bioativo primário e um candidato racional para intervenção OP + PD.
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Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais para o cuidado e uso de animais de laboratório. O protocolo do estudo foi revisado e aprovado pelo Comitê de Ética Animal. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento animal.
Este estudo tem como objetivo avaliar o papel da regulação mediada por CD44 da via PI3K/Akt na diferenciação osteoclástica e progressão inflamatória durante osteoporose comórbida e periodontite (OP+PD) e determinar se a gliciteína, um composto bioativo de Angelica sinensis, pode modular terapeuticamente esses efeitos. A justificativa decorre de evidências emergentes que ligam a superexpressão de CD44 à reabsorção óssea patológica e desregulação imunológica em PO+PD 11,12,13. Ao integrar proteômica, modelagem in vivo e farmacologia de rede, o protocolo investiga sistematicamente mecanismos moleculares e intervenções terapêuticas para mitigar a progressão da doença14.
O tamanho da amostra para experimentos in vivo foi baseado em estudos anteriores e análise de poder, resultando em n = 6 por grupo, o que garante poder estatístico adequado para detectar diferenças significativas (P < 0,05) entre as condições de tratamento. A gliciteína foi administrada nas dosagens de 50 mg/kg e 100 mg/kg, suspensa em DMSO a 5% em azeite de oliva e administrada por gavagem oral diária. Os camundongos foram monitorados por mais de 8 semanas após a indução da DP. A colocação da ligadura para induzir a inflamação periodontal utilizou fio de seda 5-0, e a ovariectomia bilateral foi realizada sob anestesia com pentobarbital sódico a 0,3% (0,5 mL/100 g)15. Além disso, ensaios moleculares, incluindo RT-qPCR, western blotting e ELISA, foram conduzidos usando protocolos validados16, e avaliações histológicas, como coloração de hematoxilina-eosina (H&E) e azul de metileno, seguiram cronogramas estabelecidos e durações de coloração.
Todos os procedimentos experimentais envolvendo reagentes químicos, agentes de coloração e espécimes biológicos foram conduzidos seguindo protocolos padrão de biossegurança para minimizar os riscos à saúde. Materiais perigosos como formalina, EDTA, azul de metileno e fucsina ácida foram manuseados com equipamentos de proteção individual (EPI), incluindo luvas, máscaras e óculos de segurança. Todos os resíduos, incluindo reagentes usados e descartáveis contaminados, foram coletados em recipientes designados de risco biológico e descartados por meio de serviços certificados de descarte de resíduos perigosos por diretrizes de segurança institucional e ambiental. A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho experimental geral.
Coleta de dados clínicos
Em nosso estudo, coletamos sistematicamente e analisamos de forma abrangente os dados clínicos basais e os históricos médicos detalhados de três pacientes com PO+DP e seis indivíduos controle, incluindo fatores demográficos e de estilo de vida, bem como perfis anatômicos e metastáticos. Além disso, foi feita uma confirmação rigorosa do resultado do teste para infecção pelo HPV (positivo ou negativo). O estágio de progressão ou padrão de recorrência das lesões metastáticas foi registrado em detalhes. Durante os primeiros 7 dias de imunoterapia, as amostras de sangue dos pacientes foram sistematicamente coletadas e padronizadas, incluindo indicadores bioquímicos, como exames de sangue de rotina. Exames de sangue de rotina foram realizados em estrita conformidade com os procedimentos padrão para avaliar com precisão os principais parâmetros, como plaquetas, linfócitos e neutrófilos. A albumina sérica foi medida em paralelo e a função hepática foi avaliada por análise quantitativa do índice de concentração de globulina.
Pacientes
Avaliação da densidade mineral óssea e estratificação dos participantes
Realizamos uma comparação sistemática das medidas de densidade óssea na região lombar e colo do fêmur. Todos os exames foram realizados por radiologistas experientes em nosso serviço, utilizando equipamentos de precisão para quantificar com precisão os valores de densidade óssea. Para garantir a coleta padronizada da amostra, os participantes foram obrigados a jejuar por pelo menos 8 h antes da amostragem. Ao integrar dados de densidade óssea com dados abrangentes de avaliação periodontal, categorizamos estritamente os indivíduos no grupo de osteoporose com periodontite (OP + PD) ou no grupo de controle saudável (HC), garantindo que a proporção sexual fosse perfeitamente compatível entre os dois grupos. O pareamento sexual refere-se à distribuição igualitária de fêmeas entre os grupos OP+PD e controle saudável. No entanto, apenas participantes do sexo feminino foram incluídas neste estudo para se concentrar na osteoporose pós-menopausa; Não havia indivíduos do sexo masculino em nenhum dos grupos. O estudo aderiu às diretrizes éticas da Declaração de Helsinque, com todos os participantes assinando o termo de consentimento livre e esclarecido, protegendo integralmente seus direitos.
Parâmetros de diagnóstico
A osteoporose foi definida de acordo com as Diretrizes Chinesas para Diagnóstico e Tratamento da Osteoporose Primária (2022)17, com limiares diagnósticos definidos em T-score ≤ -2,5 desvios padrão (DP) para DMO lombar (L1-L4) ou quadril. O estadiamento da periodontite seguiu a Classificação Mundial de Doenças Periodontais de 201818, com inclusão restrita a casos de Grau A, Estágio II-III. Critérios de inclusão: Mulheres na pós-menopausa com idade entre 50 e 65 anos, diagnóstico duplo de PO e DP que atendam aos critérios acima, ausência de doenças autoimunes, sem história de neoplasias malignas, função cardiopulmonar, hepática e renal normal. Critérios de exclusão: Recusa de participação do paciente ou família, farmacoterapia recente (≤6 meses) para PO ou DP.
Perfil proteômico de amostras de soro
Amostras de soro de três pacientes OP+PD e seis indivíduos controles foram coletadas para análise proteômica. A quantificação relativa de proteínas foi obtida por meio de procedimentos padrão, e as proteínas diferencialmente expressas foram definidas como aquelas com P < 0,05 e mudança de dobra > 1,519.
Análise de enriquecimento de conjuntos genéticos (GSEA)
O GSEA foi usado para identificar as principais vias de sinalização desreguladas entre as coortes de controle e OP + PD. Os dados transcriptômicos brutos foram primeiro transformados usando a conversão log2 e normalizados por meio de normalização quantílica para remover efeitos de lote. Conjuntos de genes com múltiplas funções biológicas foram selecionados do Molecular Signatures Database (MSigDB), e a significância estatística foi avaliada usando o teste não paramétrico de Wilcoxon. Os resultados do enriquecimento foram relatados usando pontuações de enriquecimento normalizadas e taxas de descoberta falsa (FDR < 0,25).
Análise ponderada da rede de co-expressão gênica (WGCNA)
WGCNA foi usado para identificar módulos gênicos significativamente associados aos fenótipos OP+PD. Um poder de limiar suave de 12 foi selecionado para obter uma topologia de rede livre de escala (R2 > 0,85), e a análise de correlação de Pearson foi usada para avaliar as relações entre os autogenes do módulo e as características clínicas. Análises de enriquecimento funcional foram conduzidas para descobrir vias biológicas relevantes em módulos fortemente correlacionados.
Estabelecimento de modelos murinos osteoporóticos induzidos por ovariectomia
Este estudo envolveu 116 camundongos fêmeas de grau SPF. Antes dos experimentos, os animais foram alojados em condições controladas de temperatura e umidade para uma fase de adaptação de 7 dias, durante a qual receberam ração padronizada para roedores e água destilada. Todos os procedimentos de manejo de animais seguiram rigorosamente os protocolos éticos aprovados pelo Comitê de Ética do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Xi'an Jiaotong, sob a aprovação ID 0609. O estudo foi registrado sob o número do projeto [2024-054].
Protocolo cirúrgico de ooforectomia bilateral (OVX):
Os camundongos foram anestesiados por injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico a 0,3% (0,5 mL/100 g de peso corporal). A pelagem dorsal foi depilada cirurgicamente e os animais foram posicionados em decúbito dorsal em uma plataforma cirúrgica aquecida e estéril. Após preparo asséptico com etanol a 75%, foram feitas incisões paravertebrais bilaterais (1 cm lateral à coluna vertebral) ao nível dos coxins gordurosos renais. A bursa ovariana foi exteriorizada e o oviduto foi ligado proximalmente ao ovário com pontos de seda 5-0, seguidos de excisão de ovários bilaterais, tecido adiposo associado e estruturas ovidutais parciais. As camadas musculofascial e cutânea foram fechadas sequencialmente com pontos absorvíveis 4-0. A antissepsia pós-operatória foi realizada com etanol a 75%.
Controles de cirurgia simulada:
Camundongos operados de forma simulada foram submetidos a etapas de procedimento idênticas, incluindo exposição ovariana e ressecção do tecido adiposo periovariano, sem extirpação ovariana.
Manejo pós-operatório:
A recuperação pós-anestésica foi facilitada com o uso de almofadas térmicas de água circulante até a deambulação completa. A analgesia foi mantida por meio da administração subcutânea de carprofeno (5 mg/kg por dia) por 72 h de pós-operatório, suplementada com penicilina G profilática (50.000 UI/kg) por 48 h para prevenir infecções de sítio cirúrgico. A massa corporal foi monitorada semanalmente durante a fase de modelagem osteoporótica de 6 semanas, com critérios de exclusão aplicados aos animais que apresentaram perda de peso de >20% ou sofrimento clínico.
Construção de modelo animal experimental OP+PD
O modelo experimental de PD foi desenvolvido com base no modelo animal OP previamente estabelecido. Para evitar a quebra do fio e garantir a inserção suave entre os molares, foi utilizada sutura de seda 5-0 para a ligadura. Durante o procedimento, o canto da boca do camundongo foi suavemente retraído e o fio foi agarrado com uma pinça e cuidadosamente colocado na região cervical entre o primeiro e o segundo molares. O fio e a ponta da pinça foram mantidos nivelados para minimizar o trauma na mucosa bucal, reduzindo assim o risco de sangramento ou mortalidade. A outra mão puxou suavemente a extremidade oposta do fio, guiando-o gradualmente para o espaço interproximal entre os molares. Uma vez que o fio foi posicionado corretamente, um corte próximo ao lado vestibular foi pinçado com pinça e cuidadosamente passado entre o segundo e o terceiro molares usando a mesma técnica. A tração suave para baixo garantiu a passagem suave da seda. Finalmente, o fio foi amarrado firmemente ao redor do segundo molar na região cervical média. Os ratos foram posteriormente autorizados a se recuperar.
Reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa (RT-qPCR)
A Tabela de Materiais lista sequências específicas de primers diretos e reversos para RT-qPCR direcionados a genes relacionados à inflamação, coagulação e adesão celular, incluindo CD44, CDH13, VWF e GAPDH. As sequências de primers usadas para análise de RT-qPCR estão resumidas na Tabela 1.
Análise de Western blot
As características de expressão das principais vias de sinalização Os tecidos periodontais foram submetidos à homogeneização por congelamento e descongelamento usando tampão RIPA, contendo inibidores de protease e fosfatase, para extrair eficientemente a proteína total. Após centrifugação de alta velocidade (12.000 × g, 4 °C, 10 min) para separar o lisado, o sobrenadante foi usado para medir com precisão a concentração de proteína com um kit de BCA, fornecendo dados confiáveis para experimentos subsequentes.
Para cada grupo experimental, 30 μg de proteína total foram carregados e separados por meio de um sistema SDS-PAGE a 10%. As proteínas resolvidas foram então transferidas para membranas de PVDF usando um método de blotting semi-seco. Para minimizar a interferência de fundo, as membranas foram bloqueadas com 5% de leite em pó desnatado por h à temperatura ambiente. Posteriormente, as membranas foram mantidas a 4 °C em um ambiente estável para processamento posterior.
As membranas foram então incubadas com anticorpos primários específicos (ver Tabela de Materiais) por 2 h a °C. No dia seguinte, o tampão TBST foi usado para lavagem completa e as membranas foram tratadas com anticorpos secundários conjugados com HRP em uma diluição de 1:10.000 por 1,5 horas à temperatura ambiente. Todas as etapas de imunodetecção foram realizadas em estrita conformidade com protocolos padronizados para garantir a consistência e validade da análise da via de sinalização20.
Usando substratos de quimioluminescência aprimorada (ECL) para capturar sinais e equipamentos de imagem de alta resolução para localizar com precisão as bandas de proteínas, os valores de densidade óptica das bandas foram analisados quantitativamente usando o software ImageJ. Em última análise, comparando sistematicamente os níveis de expressão relativa de proteínas-alvo / β-actina em cada grupo com o grupo controle, o grau de ativação e as mudanças dinâmicas da via PI3K / Akt sob diferentes intervenções foram avaliados com precisão.
Ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA)
Usando kits ELISA (ver Tabela de Materiais), este estudo alcançou a quantificação precisa de várias citocinas inflamatórias, incluindo TNF-α, IL-6, IL-1β e IL-4, em amostras de soro. Também avaliou as concentrações de TRAP5b, ALP e TGF-β como marcadores da atividade dos osteoclastos. Uma placa de 96 poços pré-revestida com anticorpos de captura foi incubada a 25 ° C com amostras de soro diluídas 1:10 em PBS por 2 h, permitindo que os antígenos se ligassem especificamente aos anticorpos de captura imobilizados. Após a incubação, as substâncias não ligadas foram removidas por meio de três lavagens usando PBS-T (solução salina tamponada com fosfato com Tween-20). Posteriormente, anticorpos de detecção marcados com biotina foram adicionados e incubados por 1 hora na mesma temperatura. Em seguida, estreptavidina-HRP foi introduzida para ligar os anticorpos biotinilados, e a mistura foi incubada por mais 20 minutos em temperatura ambiente sob condições de proteção contra a luz. A reação enzimática foi então encerrada usando a solução de parada e a absorbância foi medida a 450 nm usando um leitor de microplacas para determinar as concentrações de citocinas.
Coloração de hematoxilina e eosina (H&E)
Métodos padrão foram usados para realizar a coloração de H & E em seções de tecido periodontal embebidas em parafina para analisar as alterações microestruturais. O processo de preparo da amostra envolveu a fixação inicial em solução de paraformaldeído a 4% por 24 h, seguida de desidratação graduada com etanol (70%, 80%, 95% e 100%) e clareamento em xileno e, finalmente, inclusão em parafina para produzir cortes de 4 μm de espessura21. Após a desparafinação em xileno, as amostras foram reidratadas através de concentrações decrescentes de etanol (100% a 70%). O processo de coloração iniciou-se com uma imersão de 5 min em hematoxilina (Meisner), seguida de enxágue em água corrente, diferenciação em álcool ácido a 1% em etanol e outro enxágue. Os cortes foram então corados com eosina a 0,5% por 10 s para completar o protocolo.
Após a coloração, as lâminas foram desidratadas novamente em uma série graduada de etanol, limpas em xileno e seladas com meio de montagem. As observações foram feitas sob um microscópio equipado com objetivas de 10x e 40x para aquisição de imagens de alta resolução. A análise histológica avaliou a integridade estrutural do tecido conjuntivo periodontal, a infiltração de células inflamatórias e a morfologia da reabsorção óssea alveolar. O nível de inflamação foi pontuado usando um índice Loe-Silness aprimorado, com dois patologistas cegos para a identidade da amostra avaliando independentemente as amostras por meio de uma escala semiquantitativa para garantir objetividade e reprodutibilidade22.
Coloração com azul de metileno
Este estudo empregou o método de coloração com azul de metileno em cortes ósseos alveolares superiores padronizados e processados para quantificar o grau de reabsorção óssea. O procedimento experimental iniciou-se com a fixação tecidual: os tecidos periodontais foram fixados em solução de formalina neutra a 10% por 24 h, seguido de tratamento de descalcificação por 21 dias em solução de EDTA a 10% (pH 7,4). Após a descalcificação, as amostras foram incluídas em parafina e preparadas em cortes de tecido de 4 μm de espessura, que foram então montados em lâminas silanizadas. O processo de pré-tratamento da seção incluiu desparafinação de xileno, hidratação com etanol gradiente e incubação em banho-maria a 60 °C. As lâminas foram então coradas com solução de azul de metileno a 0,1% por 15 min.
Após a coloração, os cortes foram lavados por 1 min com água destilada pré-aquecida a 60 °C, garantindo a remoção efetiva do excesso de corante sem danificar a estrutura do tecido. Eles foram então contracorados com fucsina ácida a 0,1% por 5 min para aumentar o contraste entre as estruturas dos tecidos. Esse protocolo de coloração forneceu visualização consistente e confiável para análise quantitativa da reabsorção óssea alveolar23. Por fim, as lâminas foram desidratadas com etanol graduado, limpas em xileno e montadas. O tecido ósseo corado foi analisado em microscópio de campo de luz e imagens de alta resolução foram adquiridas para avaliar com precisão a reabsorção da borda óssea alveolar para posterior avaliação morfológica.
Análise de microtomografia computadorizada (Micro-CT)
A micro-tomografia computadorizada foi realizada para avaliar as alterações microestruturais 3D no osso alveolar de camundongos modelo OP + PD, visando especificamente a região do primeiro molar superior. Após 8 semanas de monitoramento pós-operatório, os camundongos foram eutanasiados humanamente por inalação de CO2 , método adequado para preservar estruturas maxilofaciais. Os espécimes maxilares foram então colhidos e fixados em paraformaldeído a 4% a 4 °C por 48 h24.
A análise de micro-CT foi realizada com as imagens DICOM reconstruídas da região maxilar importadas para o software, selecionando o conjunto de dados correspondente aos espécimes digitalizados. Uma região de interesse padrão (ROI) foi definida manualmente como a porção vestibular mesial de um terço da raiz do primeiro molar superior, delineando a estrutura óssea alveolar nas incidências sagital e coronal, e aproximadamente 50 cortes consecutivos foram normalmente incluídos para cobrir totalmente a região.
Para separar o osso trabecular do tecido mole circundante e do fundo, foi aplicado um limiar de densidade de 180-220 mgHA/cm3 . A segmentação foi então realizada para gerar uma estrutura binária representando apenas o osso trabecular. A análise morfométrica foi realizada usando o Módulo de Morfometria Óssea dentro do software. Os parâmetros foram calculados automaticamente, incluindo fração de volume ósseo (BV/VC), espessura trabecular (Tb.Th), número trabecular (Tb.N), relação entre superfície óssea e volume ósseo (BS/BV) e densidade mineral óssea (DMO). Após a análise, os resultados numéricos foram exportados em forma de planilhas.
Essas medidas foram usadas para avaliar a extensão do dano microestrutural no osso alveolar associado à condição patológica OP+PD e para avaliar a eficácia terapêutica da gliciteína na restauração da qualidade óssea. Essa abordagem permitiu uma avaliação quantitativa, reprodutível e de alta resolução da integridade estrutural no ambiente ósseo periodontal, oferecendo informações morfológicas importantes sobre os resultados do tratamento.
Perfil de farmacologia de rede
Para investigar sistematicamente os componentes bioativos da medicina tradicional chinesa (MTC) que podem modular as principais vias biológicas relevantes para osteoporose comórbida e periodontite (OP + PD), este estudo empregou uma abordagem de farmacologia de rede para analisar Angelica sinensis. Esta planta foi selecionada com base em seu uso histórico na MTC para o tratamento de distúrbios e inflamações relacionados aos ossos, incluindo sintomas associados à osteoporose e à doença gengival crônica. Na fase de triagem de compostos, os ingredientes ativos de Angelica sinensis foram recuperados usando os bancos de dados TCMSP e TCMID [detalhes do banco de dados movidos para ToM] e filtrados usando os critérios de biodisponibilidade oral (OB) ≥ 30% e semelhança com o medicamento (DL) ≥0,18. As interações composto-alvo foram previstas usando STITCH, com validação do local alvo via DisGeNET e OMIM. A análise de enriquecimento de vias foi realizada usando a plataforma DAVID 2021 para identificar vias de sinalização KEGG potencialmente moduladas pelos compostos selecionados. Para visualizar as interações moleculares, uma rede "composto-alvo-via" foi construída com base em índices topológicos (centralidade de grau, centralidade de intermediação). A análise identificou a gliciteína, um flavonóide natural, como um composto com propriedades farmacocinéticas favoráveis e forte conectividade com CD44, sugerindo potencial relevância terapêutica em OP+PD. No entanto, a gliciteína não foi clinicamente aprovada para o tratamento da osteoporose ou periodontite; Esses achados são baseados em previsões in silico e fornecem uma estrutura teórica para experimentos de validação in vivo subsequentes 25.
Validação de docking molecular
As estruturas proteicas de CD44 (PDB ID: 1UUH) e PI3K (PDB ID: 4L23) foram recuperadas do RCSB Protein Data Bank (https://www.rcsb.org). As estruturas dos ligantes (gliciteína, ligustilida) foram otimizadas por meio da minimização de energia usando um campo de força molecular. As simulações de docking foram conduzidas com um algoritmo genético sob os seguintes parâmetros: 100 ensaios, tamanho populacional 150 e 25×106 avaliações energéticas. As bolsas de ligação foram definidas com base nas coordenadas cristalográficas do ligante (CD44: 20×20×20 Å3; PI3K: 25×25×25 Å3). As poses de encaixe resultantes foram classificadas por energia de ligação (ΔG, kcal / mol) e a reprodutibilidade foi validada usando um limite de desvio quadrático médio (RMSD) de <2,0 Å.
Avaliação terapêutica da gliceína em modelos murinos OP+PD
A gliciteína (pureza ≥ 98%) foi obtida de um fornecedor bioquímico certificado em grau analítico para experimentos in vivo é uma isoflavona natural conhecida por estar presente em Angelica sinensis, com propriedades anti-inflamatórias e osteoprotetoras relatadas26. A periodontite osteoporótica foi induzida em camundongos C57BL/6 fêmeas de 11 semanas de idade por meio de ovariectomia bilateral (OVX) e inflamação periodontal induzida por ligadura. Os camundongos foram randomizados em quatro coortes (n = 6 por grupo):
Simulação: Cirurgia simulada + veículo (5% de dimetilsulfóxido [DMSO] em azeite de oliva, gavagem oral diária)
OP+PD: Modelo da doença + veículo
OP+PD + Gliciteína em baixa dose (50 mg/kg): Modelo da doença + suspensão de gliciteína no veículo
OP+PD + Gliciteína em altas doses (100 mg/kg): Modelo de doença + suspensão de gliciteína no veículo
Análise estatística
Foram realizados testes estatísticos inferenciais e criadas representações visuais de dados para geração de gráficos e visualização de dados. Os dados numéricos foram expressos como média ± DP. As comparações entre os grupos foram avaliadas por meio de testes t não pareados bicaudais, considerando valores com &l 0,05 como estatisticamente significativos. Esses métodos garantiram a robustez dos dados e aumentaram a confiabilidade dos resultados analíticos subsequentes.
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Perfil proteômico de coortes OP+PD
A análise proteômica quantitativa do soro de pacientes OP+PD (n=3) e controles saudáveis (n=6) identificou proteínas desreguladas implicadas na patogênese da doença. A análise comparativa revelou nove proteínas reguladas negativamente (APOL1, CST3, IGLV3-27, IGHV3-33, PF4, CLEC3B, SRGN, C6, SELL) e seis proteínas reguladas positivamente (IGLV9-49, A2M, VWF, CETP, CD44, CDH13) em soros OP + PD versus controles ( Figura 2A, B
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Este estudo propõe uma estrutura de pesquisa translacional que combina perfil proteômico, validação de expressão gênica, modelagem animal in vivo e farmacologia de rede para explorar os mecanismos moleculares subjacentes à comorbidade de osteoporose e periodontite (OP + PD). A hipótese central é que o CD44 modula o eixo de sinalização PI3K/Akt, exacerbando assim a perda óssea inflamatória em condições OP+PD, e que a gliciteína, um flavonóide de Angelica sinensis, pode atenuar esse processo inibindo o CD...
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Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Este estudo foi apoiado pela Fundação de Ciência e Tecnologia para a Indústria de Saúde da Província de Gansu, China (Grant No. GSWSKY2020-77), a Fundação Provincial de Ciências Naturais de Gansu (Grant Nos. 25JRRA314 e 21JR7RA620), o Programa de Talentos da Província de Gansu e o Programa de Pesquisa de Incubação de Jovens do Hospital Provincial de Gansu (Grant No. 23GSSYF-35).
Contribuições dos autores:
Jing Qi conduziu a maior parte do trabalho experimental e análise de dados. Yunqing Pang contribuiu para a coleta de amostras, curadoria de dados e análise estatística. Yu Wang auxiliou no projeto experimental e forneceu suporte técnico. Dawei Hou e Jing Wang supervisionaram conjuntamente o projeto, revisaram o manuscrito criticamente quanto ao conteúdo intelectual importante e aprovaram a versão final. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Kits ELISA | Biotecnologia Shanghai Enzyme Link | Quantificação de citocinas inflamatórias (TNF-&alfa;, IL-6, IL-1β, IL-4, ALP, TRAP5b, TGF-β, VWF, CD44) | |
| Kit de extração de RNA | Biotecnologia de Shanghai Yesheng | Extração de RNA sérico | |
| Kit de síntese de cDNA | Biotecnologia de Shanghai Yesheng | Transcrição reversa de alta atividade | |
| kit de qPCR | Biotecnologia de Shanghai Yesheng | Amplificação quantitativa por PCR | |
| Anticorpos (primários/secundários) | Tecnologia de Sinalização Celular / Abcam / Hangzhou Xianli Biotecnologia / Pequim Zhongshan Jinqiao Biotecnologia | Anticorpos primários específicos; controle interno de β-actina; anticorpo secundário IgG anti-coelho caprino | |
| Reagentes histológicos | Beyotime Biotecnologia / Shanghai Shangshang | Hematoxilina– coloração de eosina e azul de metileno | |
| Substrato quimioluminescente | Yakken Biotecnologia | Detecção de Western blot | |
| Sistema Micro-CT | Scanco Medical AG (Viva CT40) | Análise microestrutural de alta resolução | |
| Sistema LC-MS/MS | Thermo Scientific Q Exactive HF-X | Análise proteômica de alta resolução | |
| Software: MaxQuant (v2.1.0), Andrômeda | Instituto Amplo | Pré-processamento de dados proteômicos | |
| Software: GSEA (v4.3.2) | Instituto Amplo | Análise de enriquecimento de vias | |
| Software: R (v4.0.3), WGCNA (v1.73), mapa de dados (v1.0.12) | Fundação R | Computação estatística, análise de redes, clustering, mapas de calor | |
| Software: AutoDock 4.2, AutoDockTools 1.5.7 | O Instituto de Pesquisa Scripps | Docking molecular e definição de grade | |
| Software: Open Babel 3.1.1 | Projeto Open Babel | Otimização da estrutura do ligante | |
| Software: PyMOL 2.5.2 | Schrö dinger, LLC | Visualização de encaixe molecular |
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