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Artigo de investigação
Este estudo demonstra que a decocção de Yangjing Zhongyu melhora os resultados de reprodução assistida em mulheres com reserva ovariana diminuída, melhorando a qualidade do oócito e do embrião. Em um modelo de rato com insuficiência ovariana prematura, a decocção restaurou o equilíbrio hormonal, promoveu o desenvolvimento do folículo e modulou a autofagia e o metabolismo lipídico.
A decocção de Yangjing Zhongyu (YZD), uma fórmula tradicional chinesa de ervas, foi sugerida para melhorar a função ovariana e os resultados de fertilidade, mas as evidências clínicas padronizadas permanecem limitadas. Este estudo avaliou os efeitos da YZD em mulheres com reserva ovariana diminuída (DOR) submetidas a FIV/ICSI-ET, juntamente com a validação mecanicista em um modelo de rata de insuficiência ovariana prematura (POF). No ensaio clínico, os pacientes com DOR receberam o protocolo padrão do antagonista de GnRH sozinho ou em combinação com YZD. As características basais entre os grupos foram comparáveis, e o grupo YZD apresentou maior número de oócitos recuperados e embriões de alta qualidade, bem como melhores escores de síndrome da medicina tradicional chinesa. Paralelamente, a POF foi induzida em ratas, e os animais tratados com YZD exibiram melhora da ciclicidade estral, restauração dos níveis séricos de estradiol, redução do hormônio folículo-estimulante e histologia ovariana mais saudável. A microscopia eletrônica revelou que o YZD reduziu a formação excessiva de autofagossomos e o acúmulo de lipídios nas células ovarianas, sugerindo regulação do eixo autofagia-metabolismo lipídico. Juntos, esses achados indicam que o YZD aumenta a função de reserva ovariana, melhora o desenvolvimento embrionário e pode aumentar o potencial de gravidez em mulheres com DOR. Este protocolo padronizado fornece uma estrutura reprodutível para integrar o YZD em ciclos de tecnologia de reprodução assistida, apoiando seu potencial translacional na medicina reprodutiva clínica.
A reserva ovariana diminuída (DOR) é uma condição clínica que compromete a saúde reprodutiva feminina e é caracterizada por uma redução no número ou na qualidade dos folículos ovarianos1. Clinicamente, isso se reflete na diminuição da contagem de folículos antrais, redução dos níveis de hormônio anti-Mülleriano (AMH) ou concentrações elevadas de hormônio folículo-estimulante (FSH)2. A DOR é responsável por aproximadamente 10% dos casos de infertilidade e representa uma grande barreira para o sucesso da concepção3. No contexto da tecnologia de reprodução assistida (TRA), a prevalência de DOR é estimada em 19%-26% nos Estados Unidos4, e está associada a taxas de gravidez reduzidas, maior incidência de pré-eclâmpsia e aumento do risco de aborto espontâneo recorrente5. Apesar da disponibilidade de múltiplas abordagens terapêuticas, melhorar os resultados da TARV em pacientes com DOR continua sendo um desafio considerável, ressaltando a necessidade de intervenções novas e eficazes6.
A decocção de Yangjing Zhongyu (YZD), uma formulação clássica da medicina tradicional chinesa (MTC), tem sido aplicada há muito tempo na prática reprodutiva7. Acredita-se que melhore o equilíbrio endócrino e apoie a função ovariana, melhorando assim os resultados na fertilização in vitro e nos ciclos de injeção intracitoplasmática de espermatozóides e transferência de embriões (FIV/ICSI-ET)8. Dados clínicos preliminares sugerem que o YZD pode melhorar a resposta ovariana, mas estudos mecanicistas e translacionais rigorosos ainda são limitados. As vias biológicas precisas pelas quais o YZD atua em pacientes com DOR permanecem obscuras 9,10. A literatura atual indica que os compostos fitoterápicos chineses podem influenciar o microambiente ovariano por meio de vários mecanismos, como modular a expressão de AMH, inibir as vias de sinalização relacionadas à atresia folicular, incluindo PI3K / AKT / mTOR, e reduzir a lesão por estresse oxidativo. No entanto, essas hipóteses mecanicistas são em grande parte indiretas e carecem de validação experimental.
Este estudo aborda essas lacunas integrando a avaliação clínica com a verificação experimental. Especificamente, examinamos os efeitos do YZD em mulheres com DOR submetidas a ART e investigamos seus fundamentos mecanicistas usando um modelo de rato DOR induzido por glicosídeo tripterygium. Nos experimentos com animais, monitoramos marcadores endócrinos (estradiol e FSH), contagem de folículos antrais, formação de autofagossomos e acúmulo de lipídios no tecido ovariano. Ao combinar resultados clínicos com dados mecanicistas experimentais, este trabalho fornece um protocolo padronizado para incorporar YZD em ciclos de fertilização in vitro / ICSI-ET e oferece novas evidências que apóiam seu potencial como terapia adjuvante para melhorar a reserva ovariana e os resultados reprodutivos em pacientes com DOR. A novidade deste estudo reside em sua abordagem dupla - ligando a aplicação clínica padronizada com insights mecanicistas - que avança tanto a tradução clínica quanto a compreensão teórica do YZD na medicina reprodutiva.
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Todos os procedimentos clínicos foram conduzidos de acordo com a Declaração de Helsinque e foram aprovados pelo Comitê de Ética do Hospital Changhai de Xangai (Aprovação nº. CHEC2022-156). O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes. Os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina de Changhai (Aprovação nº. CHEC2022-156) e cumpriu os padrões nacionais de cuidados com animais de laboratório.
Características clínicas
Recrutamento e agrupamento de pacientes
De agosto de 2022 a março de 2023, 78 pacientes com infertilidade diagnosticados com síndrome de deficiência de rim-yin10 e em busca de TARV foram recrutados no Centro de Medicina Reprodutiva do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica Naval e no departamento ambulatorial do Hospital Yueyang, Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Xangai. Os participantes foram aleatoriamente designados para um grupo de controle ou um grupo de tratamento (39 casos cada) usando a geração de números aleatórios SPSS 23.0.
Critérios diagnósticos
O diagnóstico médico ocidental seguiu o parecer do Comitê de 2020 da Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva (ASRM) sobre os indicadores de reserva ovariana11. Os critérios incluíram FSH ≥ 10 UI/L, estradiol ≥ 80 pg/mL, contagem de folículos antrais (AFC) < 7 e AMH < 0,5-1,1 ng/mL. A síndrome de deficiência de rim-yin foi diagnosticada de acordo com a Ginecologia da Medicina Tradicional Chinesa12 e os Critérios de Eficácia Diagnóstica das Síndromes MTC13.
Critérios de inclusão e exclusão
Os critérios de inclusão foram FIV/ICSI-ET planejados usando um protocolo antagonista; história de má resposta ovariana (< 5 oócitos recuperados); idade 20-40 anos; atender aos critérios da síndrome DOR e MTC; e assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. Os critérios de exclusão incluíram patologia endometrial (pólipos, tuberculose, displasia, câncer), malformação uterina, comorbidades (diabetes, lúpus), terapia hormonal recente (< 3 meses), história de cirurgia pélvica, anormalidades cromossômicas ou alergia a medicamentos. Os critérios de eliminação foram aplicados para desvio de protocolo, eventos adversos, retirada ou concepção espontânea dentro de 2 semanas após a inscrição.
Método de medicação
Ambos os grupos foram submetidos à avaliação inicial no dia menstrual 2-3 por ultrassonografia transvaginal e teste hormonal. O grupo controle recebeu o regime antagonista: FSH recombinante ou gonadotrofina menopausal humana, dose inicial de 225 UI/dia por via intramuscular por 5 dias, seguida de ajuste da dose com base no crescimento folicular. Quando o diâmetro do folículo principal excedeu 12 mm, o antagonista do GnRH (0,125 mg/dia subcutâneo) foi iniciado e continuado até o gatilho. Quando ≥ folículo 1 atingiu 18 mm, ≥ 2 atingiu 17 mm ou ≥ 3 atingiu 16 mm, a ovulação foi desencadeada com 250 μg de hCG recombinante, seguida de recuperação do oócito após 34-36 h.
O grupo de tratamento seguiu o mesmo protocolo com a adição de Decocção Yangjing Zhongyu (YZD), administrada por via oral 2x ao dia (manhã e noite), uma decocção por dia, a partir dos dias 2-3 do ciclo menstrual até o dia do gatilho. A fórmula clínica continha Rehmannia 12 g, Paeonia lactiflora 12 g, Cornus officinalis 10 g e Angelica sinensis 12 g.
Indicadores de observação
Os desfechos clínicos incluíram parâmetros basais de idade, IMC (calculado como peso (kg)/altura² (m²)), duração da infertilidade, FSH, dose/duração da gonadotrofina, escores da síndrome de deficiência renal-yin, número de folículos antrais (avaliados por ultrassom transvaginal, 2-9 mm de diâmetro), oócitos recuperados, oócitos da metáfase II (MII) (identificados na recuperação do oócito), embriões fertilizados, clivagens, embriões de alta qualidade (definidos por critérios laboratoriais de embriologia padrão), e taxa de gravidez clínica, que foi definida como a presença de um saco gestacional na ultrassonografia em 6-7 semanas de gestação.
Animais experimentais
Aqui, 30 ratas Sprague-Dawley fêmeas de grau SPF (8 semanas de idade, 160-200 g) foram aclimatadas sob condições controladas (23 ± 2 °C, 40%-45% de umidade, ciclo claro/escuro de 12 h) com comida e água ad libitum .
Preparação de medicamentos
O YZD foi preparado com Rehmannia 30 g, Angelica 15 g, Paeonia lactiflora 15 g e Cornus officinalis 15 g. As ervas foram decoctadas em água, filtradas através de um filtro de 200 malhas e concentradas sob pressão reduzida a 70 °C. As soluções finais para doses baixas, médias e altas foram 0,34 g/mL, 0,68 g/mL e 1,35 g/mL, correspondendo a 0,5x, 1,0x e 1,2x da dose clínica de YZD. As decocções foram armazenadas a 4 °C.
Modelagem e agrupamento
Um modelo de DOR foi induzido por injeção intraperitoneal de glicosídeos tripterygium (40 mg/kg por dia durante 15 dias). Os ratos foram aleatoriamente designados para os grupos de tratamento em branco (n = 6), modelo (n = 6) e YZD (doses baixas, médias e altas; n = 6 cada). A administração de gavagem (10 mL/kg de peso corporal) foi feita 1x ao dia, a partir do primeiro dia de injeção de glicosídeos tripterygium continuada por 15 dias.
Citologia vaginal
Os estágios do ciclo estral foram avaliados por citologia esfoliativa vaginal. Os esfregaços vaginais foram coletados uma vez ao dia (08:00-10:00) com cotonetes estéreis, diluídos em 30 μL de soro fisiológico e examinados ao microscópio óptico com aumento de 100x. O período de observação durou 15 dias consecutivos. O índice de ciclo estral normal foi definido como a proporção de ratos exibindo ciclos estrais regulares de 4-5 dias durante esse período.
Ensaios hormonais
O sangue total foi coletado sob anestesia por punção cardíaca ao final do período de tratamento de 15 dias, deixado coagular em temperatura ambiente por 30 min e centrifugado a 1000 x g por 15 min a 4 °C para obtenção do soro. Os níveis de E2 e FSH foram medidos por ELISA de acordo com as instruções do fabricante.
Histologia ovariana
O tecido ovariano foi coletado imediatamente após a eutanásia por remoção cirúrgica de ambos os ovários, enxaguado em solução salina fria para remoção de sangue e, em seguida, fixado em paraformaldeído a 4% a 4 ° C por 24-48 h. Os tecidos foram desidratados em etanol graduado, limpos em xileno, embebidos em parafina e seccionados a 4-5 μm. Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina, desidratados, limpos e montados.
Análise estatística
Os dados foram analisados no SPSS 26.0. As variáveis normais foram expressas como média ± DP e comparadas pelo teste t; variáveis não normais como mediana (IIQ) e comparadas pelo teste U de Mann-Whitney. As variáveis categóricas foram expressas em % e comparadas pelo teste do qui-quadrado. p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Para consistência, os mesmos métodos estatísticos foram aplicados às análises de figuras (sem descrição separada do teste t de Student).
Segurança e eliminação de resíduos
Os glicosídeos de paraformaldeído, xileno e tripterygium foram manuseados em capelas de exaustão certificadas com luvas, óculos de proteção e jalecos; derramamentos e descartáveis contaminados foram coletados em recipientes rotulados de resíduos perigosos e descartados de acordo com o SOP de biossegurança institucional. Todos os procedimentos envolvendo paraformaldeído, xileno e glicosídeos tripterígio foram realizados em capelas com equipamentos de proteção individual adequados (luvas, jalecos, óculos de proteção). Resíduos químicos e carcaças de animais foram descartados de acordo com as diretrizes institucionais de biossegurança.
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Características clínicas
Durante o estudo, 3 pacientes do grupo controle se retiraram devido à infecção por COVID-19 e 1 foi excluído devido à função hepática anormal, deixando 35 pacientes. No grupo de tratamento, 4 se retiraram devido ao COVID-19 e 35 pacientes completaram o estudo. Assim, um total de 70 sujeitos foram incluídos na análise final. Não houve diferenças significa...
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Neste estudo, investigamos o papel potencial da Decocção Yangjing Zhongyu (YZD) como terapia adjuvante para diminuição da reserva ovariana (DOR) na tecnologia de reprodução assistida (ART). Os achados clínicos demonstraram que as pacientes que receberam YZD, além do protocolo antagonista padrão, alcançaram um número significativamente maior de oócitos recuperados e embriões de alta qualidade. Embora as taxas de prenhez não tenham diferido significativamente entre os grupos, observou-se u...
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Os autores declararam que não existem interesses conflitantes.
O apoio para este trabalho vem do Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (Grant number: 2018YFC1004900): estudo sobre o efeito e mecanismo da Decocção de Yangjing Zhongyu na regulação do metabólito microbiano erucamida no fluido folicular para melhorar a função ovariana em ratos (Grant number: 2024QN027)
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Centrifuga | Separação sérica (1000 x g, 15 min, 4 e graus; C) | Eppendorf 5810R | 5811 000.012 |
| Cotonetes (estéreis) | Coleta de amostras de citologia vaginal | Suprimentos Médicos Kangjian de Jiangsu | KJ-MW-01 |
| Kit ELISA para E2 | Quantificação de estradiol sérico (rat) | Elabscience Biotechnology Inc. | E-EL-0152 |
| Kit ELISA para FSH | Quantificação sérica de FSH (rat) | Elabscience Biotechnology Inc. | E-EL-R0391 |
| Etanol (70– 100%) | Desidratação graduada para histologia | Sinopharm Chemical Reagent Co., China | 100092683 |
| Slides de vidro & Coberturas | Montagem de amostras | Citotest Scientific, China | 7101/1812 |
| Hematoxilina & Eosina | Solução de coloração para histologia | Beyotime Biotechnology, China | C0105S |
| Microscópio Óptico | Observação em histologia e citologia | Olympus (genérico, sem marca registrada) | CX23 |
| Parafina | Meio de incorporação | Leica Biosystems | 39601095 |
| Paraformaldeído (4%) | Fixador para preparação de tecidos | Sigma-Aldrich | P6148 |
| Solução salina (0,9%) | Preparação do esfregaço vaginal | Sinopharm Chemical Reagent Co., China | 10019318 |
| Sprague– Ratos-de-Dawley | Animais experimentais (fêmea, 8 semanas, 160 e ndash; 200 g) | Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Tech Co., Ltd. | SCXK (Pequim) 2024-0011 |
| SPSS Software | Análise estatística (ver. 26.0) | IBM Corp. | RRID:SCR_002865 |
| Microscópio Eletrônico de Transmissão | Observação ultraestrutural | JEOL Ltd. | JEM-1400Plus |
| Glicosídeos tripterígios | Indução do modelo de rato DOR | Fornecedor genérico (sem marca registrada) | TG-001 |
| Xileno | Reagente de limpeza para histologia | Sinopharm Chemical Reagent Co., China | 10023418 |
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