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Artigo de método

Isolamento de RNA do epitélio da lente ocular de camundongo e massas em massa de células de fibra

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⸱

DOI:

10.3791/69079

⸱

10 de outubro de 2025

 ,  , 
1School of Optometry and Vision Science Program, Indiana University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo detalha a separação do epitélio da lente ocular do camundongo e da massa em massa da célula da fibra, seguida pelo isolamento de RNA e análise de qPCR. Este método permite separar os compartimentos das células do cristalino para uma análise mais detalhada do transcriptoma e dos processos biológicos em células epiteliais versus células de fibra diferenciadas.

Resumo

O cristalino é um tecido transparente especializado na câmara anterior do olho que é composto por dois tipos principais de células, células epiteliais e células de fibra. Uma monocamada de células epiteliais do cristalino cobre o hemisfério anterior do cristalino, enquanto a maior parte do cristalino é composta por uma massa de células de fibra do cristalino. Uma membrana basal colagenosa, conhecida como cápsula, envolve e encapsula todo o tecido. As células epiteliais do cristalino são fortemente aderidas à cápsula do cristalino e podem ser facilmente separadas da massa de fibra a granel retirando a cápsula do tecido. As dificuldades em obter concentração suficiente de RNA a partir do baixo número de células epiteliais na monocamada do cristalino impediram anteriormente o estudo dos transcriptomas de células epiteliais versus células de fibra. Este protocolo apresenta um método para separar e isolar de forma limpa os compartimentos de células epiteliais e de fibra e as etapas de concentração de RNA para permitir experimentos transcriptômicos subsequentes em amostras de células epiteliais de um único par de lentes de camundongo. A capacidade de investigar os principais tipos de células do cristalino individualmente auxilia na investigação de mecanismos biológicos de manutenção e desregulação do cristalino, permitindo a caracterização de interrupções específicas do tipo de célula responsáveis por patologias do cristalino relacionadas à idade.

Introdução

A lente ocular é um órgão transparente que focaliza finamente a luz na retina para produzir uma imagem clara. O cristalino é composto por dois tipos principais de células: uma monocamada de células epiteliais que cobre o hemisfério anterior e células de fibra que compõem a massa maior do tecido (Figura 1). O cristalino é envolvido por uma membrana basal colágena conhecida como cápsula do cristalino, à qual as células epiteliais estão firmemente aderidas. À medida que o cristalino cresce, as células epiteliais no equador proliferam e se diferenciam em conchas nascentes de células de fibra que são colocadas em camadas no cristalino de maneira concêntrica 1,2,3. O crescimento do cristalino ao longo da vida depende da proliferação contínua dessa pequena população de células epiteliais equatoriais que compõem a zona germinativa4. À medida que as células das fibras amadurecem, todas as organelas celulares são degradadas para eliminar objetos de dispersão de luz 5,6,7,8,9,10,11 e manter a transparência do tecido, e as células da fibra mais internas são eventualmente compactadas, resultando em um centro de lente rígido 9,12. Devido à cápsula do cristalino circundante, não há renovação celular no cristalino, e as fibras seminais permanecem no centro do cristalino ao longo da vida, à medida que novas fibras são adicionadas na periferia do tecido ou no córtex. As células de fibra do cristalino têm propriedades ópticas diferentes dependendo de sua idade e podem fornecer um instantâneo temporal das características biológicas variáveis em cada estágio13.

Apesar das opções cirúrgicas disponíveis, a catarata, definida como qualquer opacidade no cristalino normalmente transparente, continua sendo a principal causa de cegueira no mundo14. A catarata pode se manifestar no epitélio, córtex ou núcleo do cristalino com diferentes fisiopatologias15. No entanto, os mecanismos celulares e moleculares da formação de catarata permanecem obscuros16,17. Para entender melhor como prevenir esses diferentes tipos de catarata e desenvolver alternativas à cirurgia, devemos entender melhor como esses diferentes tipos de células mantêm sua homeostase no cristalino.

As células epiteliais e fibrosas desempenham diferentes papéis fisiológicos no cristalino. A proliferação celular, por exemplo, é restrita ao epitélio do cristalino18. Enquanto isso, as fibras da lente compreendem a massa total da lente, fornecendo estrutura e propriedades de refração à lente9. Para obter uma perspectiva mais sutil dos processos biológicos envolvidos nos diferentes compartimentos do cristalino, as células epiteliais e fibrosas devem ser investigadas separadamente. Aqui, apresentamos um método para isolar o epitélio da massa a granel da célula da fibra, extrair mRNA de cada fração e analisar esses transcritos usando a reação em cadeia da polimerase quantitativa de transcrição reversa (RT-qPCR).

figure-introduction-1
Figura 1: Diagrama de anatomia da lente. O cristalino é composto por dois tipos de células, uma célula epitelial monocamada (azul e laranja) cobrindo o hemisfério anterior e uma massa em massa de fibras do cristalino (brancas). O tecido é circundado por uma fina membrana colágena, conhecida como cápsula do cristalino (bronzeado). As células epiteliais anteriores (azul) são quiescentes, enquanto as células epiteliais equatoriais (laranja) proliferam, diferenciam-se e alongam-se para se tornarem novas camadas de células fibrosas (brancas) na periferia do cristalino. Novas gerações de células de fibra são sobrepostas às gerações anteriores de fibras em conchas concêntricas. As células de fibra do cristalino mais antigas são compactadas no centro do tecido. Esta figura foi modificada de Cheng (2024)38. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Protocolo

Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com o "Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório" do National Institutes of Health e um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Indiana.

1. Área de trabalho, equipamento e preparação de reagentes

  1. Autoclave as pontas da pipeta antes de usar e designe caixas de pontas autoclavadas para experimentos de RNA para evitar a contaminação por RNase.
  2. Trate a área da superfície de trabalho na capela de exaustão e nos pilões de homogeneização de tecidos com solução de descontaminação RNase, enxágue abundantemente com água deionizada e seque.
  3. Mergulhe as ferramentas de dissecção (pinça curva, pinça reta e tesoura de microdissecção) em etanol a 70% por 5 min e seque com uma limpeza delicada antes de usar.
  4. Use novas bandejas de dissecação e placas de Petri para as etapas de dissecção e isolamento de tecidos.
  5. Alíquota de 400 μL de reagente de ácido-guanidínio-fenol de TRIzol frio em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL sem DNAse e RNAse na capela de exaustão.

2. Dissecção da lente do mouse

  1. Eutanásia de camundongos adultos usando overdose de CO2 seguida de luxação cervical como medida secundária.
  2. Enuclear os olhos usando uma pinça curva.
    1. Pressione suavemente o tecido ao redor do olho com a pinça, fazendo com que o olho se projete da órbita. Feche a pinça embaixo do olho e remova-a puxando firmemente para cima.
    2. Transfira os olhos para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL com 750-1000 μL de solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS).
  3. Para dissecção, transfira os olhos para os poços em uma bandeja de dissecação com 1x PBS fresco.
  4. Sob um microscópio de dissecação, use uma pinça reta para segurar a base do nervo óptico e corte o nervo o mais próximo possível do olho com uma tesoura de microdissecção afiada.
  5. Insira cuidadosamente uma pinça reta fina na abertura onde o nervo óptico foi conectado e aperte para manter o tecido no lugar.
  6. Insira a ponta da tesoura de microdissecção na mesma abertura e corte cuidadosamente do pólo posterior do olho em direção à junção córnea-escleral. Não insira os instrumentos muito profundamente para evitar danificar a lente.
    NOTA: A lente do roedor ocupa um grande volume no olho e, portanto, cortes superficiais são recomendados para evitar perfurar a lente.
  7. Corte ao longo da junção córnea-escleral usando a tesoura de microdissecção, separando pelo menos metade da circunferência do olho.
  8. Use a pinça reta para inverter suavemente os tecidos oculares enquanto empurra a córnea, expulsando a lente através da incisão córnea-escleral.
  9. Remova cuidadosamente todos os tecidos grandes e presos da lente usando uma pinça reta fina.
  10. Se necessário, enrole suavemente a lente em um lenço limpo e delicado usando uma pinça curva para remover qualquer tecido extralenticular aderente restante.
    NOTA: Role o lenço rapidamente pela limpeza de tarefas e não permita a secagem excessiva do lenço. Pode haver pequenas opacidades na superfície da lente devido a manchas secas na cápsula da lente. Essas opacidades geralmente são reversíveis quando a lente é colocada de volta em 1x PBS e não afetarão as etapas subsequentes.
  11. Transfira a lente limpa para uma placa de Petri de 6 cm com 1x PBS.
  12. Usando uma pinça reta fina, perfure superficialmente a cápsula do cristalino perto do equador e retire suavemente a cápsula do cristalino da massa a granel da fibra. As células epiteliais do cristalino permanecerão presas à cápsula. Remova cuidadosamente quaisquer pedaços grandes de fibra da cápsula que possam ter saído com a descapsulação.
  13. Segure suavemente a cápsula com uma pinça reta fina e gire no PBS 1x para remover quaisquer fibras restantes. Quaisquer células de fibra frouxamente ligadas se dissociarão da cápsula e das células epiteliais.

3. Isolamento de RNA

NOTA: Um fluxo de trabalho resumido para isolamento de RNA é mostrado na Figura 2.

  1. Deposite 2 cápsulas de lente ou 2 massas de fibra a granel nos respectivos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 400 μL de reagente TRIzol frio.
    NOTA: As massas de fibra devem ser movidas do prato para o tubo usando uma pinça curva para recolher o tecido.
  2. Tampe firmemente e mova os tubos para uma capela de exaustão química para as etapas subsequentes.
  3. Homogeneizar suavemente as massas a granel da fibra da lente usando um pilão de pellets limpo.
    NOTA: Certifique-se de quebrar completamente a massa de fibra.
  4. Incubar amostras (cápsulas de lentes ou massas a granel de fibras homogeneizadas) em TRIzol por 30 min à temperatura ambiente na capela de exaustão.
  5. Na hotte, adicionar 200 μl de clorofórmio por 400 μl de reagente TRIzol a cada tubo. Feche bem os tubos e agite vigorosamente com a mão por 15 s, mantendo o polegar na parte inferior do tubo e o indicador na tampa.
    NOTA: Os tubos de microcentrífuga de 1.5 mL indicados na lista de materiais são usados devido à vedação hermética. Se estiver usando outras marcas de tubos de microcentrífuga, teste o fechamento e a vedação do tubo antes de agitar, pois a solução de TRIzol e clorofórmio pode vazar por baixo da tampa dos tubos que não possuem vedação hermética.
  6. Incube as amostras por 10-15 min em temperatura ambiente para permitir a separação de fases.
    NOTA: Deve haver uma camada rosa de reagente de TRIzol na parte inferior do tubo contendo lipídios e proteínas, uma camada branca entre as fases contendo DNA e uma fase aquosa clara na parte superior contendo RNA. A camada branca de DNA pode ser mais difícil de ver nas amostras de células epiteliais.
  7. Centrifugue amostras a 14.000 x g por 15 min a 4 °C.
    NOTA: Mova cuidadosamente os tubos para dentro e para fora da centrífuga, tomando cuidado para não perturbar as fases da transferência.
  8. Monte tubos e reagentes de um kit RNA Clean and Concentrator. Os tubos da coluna de rotação são encaixados em um tubo de coleta do kit.
  9. Na hotte, transferir cuidadosamente a fase aquosa límpida (a camada superior) para um tubo de microcentrífuga limpo de 1,5 ml, anotando o volume.
    NOTA: Evite perturbar, tocar ou desenhar a camada branca de DNA abaixo da fase aquosa. Incline o tubo ao transferir a fase aquosa para evitar perturbar a camada branca. É preferível deixar uma pequena quantidade da fase aquosa no tubo em vez de contaminar a amostra. Normalmente, para 200 μL de clorofórmio adicionado, 180-190 μL de fase aquosa podem ser recuperados.
  10. Adicione etanol à prova de 200 à fase aquosa em uma proporção volumétrica de 1:1.
    NOTA: O tampão de ligação de RNA do kit concentrador pode ser adicionado em uma proporção volumétrica de 2:1 à fase aquosa antes da adição de etanol. Esta etapa é ignorada para aumentar o rendimento do RNA e porque o RNA tem pureza suficiente após o isolamento.
  11. Misture delicadamente invertendo o tubo várias vezes ou pipetando a solução para cima e para baixo. Transfira a solução misturada para uma coluna de rotação de RNA usando um pipetador.
    NOTA: Tenha cuidado para não tocar no filtro com a ponta da pipeta.
  12. Centrifugar colunas de centrifugação a 16.000 x g durante 30 s a 4 °C.
    NOTA: Recomenda-se rotular a tampa da coluna e a lateral do tubo de coleta para manter os conjuntos de tubos organizados e caso a tampa se quebre na etapa de centrifugação subsequente.
  13. Descarte o fluxo e adicione 400 μL de tampão de preparação de RNA à coluna de rotação.
  14. Centrifugar colunas de centrifugação a 16.000 x g durante 30 s a 4 °C.
  15. Descarte o fluxo e adicione 700 μL de tampão de lavagem de RNA à coluna de centrifugação.
  16. Centrifugar colunas de centrifugação a 16.000 x g durante 30 s a 4 °C.
  17. Descarte o fluxo e adicione 400 μL de tampão de lavagem de RNA à coluna de rotação.
  18. Centrifugue colunas de centrifugação a 16.000 x g por 1 min a 4 °C.
  19. Descarte o fluxo e centrifugue mais uma vez a 16.000 x g por 30 s a 4 ° C para garantir que a coluna de centrifugação esteja seca.
  20. Mova a coluna giratória para um novo tubo de microcentrífuga rotulado de 1.5 mL.
  21. Adicione 15 μL de água livre de RNase no filtro de membrana. Incube por 2 min em temperatura ambiente.
    NOTA: Tenha cuidado para não tocar no filtro com a ponta da pipeta.
  22. Centrifugue a coluna de centrifugação a 16.000 x g por 30 s a 4 ° C para eluir o RNA purificado.
    NOTA: A tampa do tubo de microcentrífuga de 1.5 mL permanecerá aberta durante a centrifugação. Coloque cuidadosamente as colunas giratórias e os tubos de microcentrífuga de forma que as tampas abertas fiquem encostadas na tampa do rotor para que não balance e quebre durante a centrifugação. As tampas devem seguir a direção de rotação do rotor.
  23. Remova e descarte as colunas de rotação. O RNA estará no líquido coletado nos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
  24. Feche bem os tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e incube amostras de RNA a 55-65 °C por 10 min para promover a resolubilização.
  25. Coloque imediatamente as amostras no gelo após a etapa de aquecimento.
  26. Armazene amostras a -80 °C ou transcreva reversamente em cDNA para armazenamento de longo prazo.
    NOTA: As amostras de RNA foram armazenadas por até 3 meses sem perda perceptível de concentração. Alíquota de amostras de RNA para volumes menores para armazenamento para minimizar os ciclos de congelamento e descongelamento e evitar a degradação.

4. Medição da concentração de RNA usando um espectrofotômetro UV-Vis

  1. Mantenha as amostras de RNA no gelo, ligue o NanoDrop (espectrofotômetro UV-Vis) e permita que o instrumento inicialize.
  2. No menu Ácidos nucléicos , selecione o módulo de quantificação de RNA.
  3. Limpe o espectrofotômetro UV-Vis pipetando 2,0 μL de eluente da etapa de concentração de RNA no pedestal, neste caso, água de grau molecular. Abaixe o braço do instrumento e leia a amostra em branco.
  4. Levante o braço do instrumento, limpe o pedestal do sensor usando um lenço de tarefas delicado limpo e seco e, em seguida, outro pano umedecido com água deionizada, seguido por um pano seco novamente.
  5. Se desejar, insira os detalhes da amostra na interface do espectrofotômetro UV-Vis.
  6. Carregue 2,0 μL da amostra de RNA no pedestal, abaixe o braço e quantifique.
  7. Repita as etapas 4.4 a 4.6 para limpar o pedestal entre as amostras.
  8. Quando terminar, salve e exporte o experimento para quantificação adicional, se necessário.

5. Transcrição reversa

  1. Usando uma transcriptase reversa altamente processiva e termoestável, transcreva reversamente 2,0 μg de RNA de fibra de lente e todo o RNA epitelial extraído usando o protocolo recomendado pelo fabricante. Misture reagentes e RNA para cada amostra em um tubo de PCR limpo. Mantenha todas as soluções e amostras de RNA no gelo.
    NOTA: Esta transcriptase pode transcrever reversamente até 2,5 μg de RNA por reação. Uma conversão completa de RNA em cDNA é assumida, então a concentração inicial de RNA é usada como a concentração presuntiva de cDNA.
  2. Execute a reação no termociclador usando as condições listadas na Tabela 1.
  3. Armazene o cDNA transcrito reversamente a -80 °C ou prossiga para a etapa de qPCR.
    NOTA: as amostras de cDNA foram armazenadas por até 4 meses sem degradação perceptível, pois o cDNA é mais estável que o RNA. As amostras provavelmente podem ser armazenadas por mais tempo, desde que os ciclos de congelamento e descongelamento sejam minimizados.
PassoTemperatura (°C)Tempo (min)Ciclos
Recozimento25101
Transcrição reversa50101
Inativação enzimática8551
Segurar4∞1

Tabela 1: Condições do termociclador para transcrição reversa. Essas condições estão sintonizadas com uma transcriptase reversa específica, altamente processiva e termoestável. As condições de funcionamento podem variar dependendo da enzima e do kit utilizado.

6. PCR quantitativo em tempo real

  1. Antes de iniciar as reações, prepare as soluções de estoque de cDNA até a concentração desejada, diluindo com água de grau molecular. Nesses experimentos, 1 μL de cDNA será usado a 5 ng/μL para reações de 5 ng/poço. Mantenha todas as soluções e amostras de cDNA no gelo.
    NOTA: As placas de matriz TaqMan (formato de 0,1 mL) são recomendadas para acomodar reações de 5-50 ng de cDNA por poço. Fazer alíquotas de cDNA é útil para limitar os ciclos de congelamento e descongelamento. Neste estudo, as amostras foram limitadas a um máximo de 5 ciclos de congelamento e descongelamento.
  2. Prepare uma master mix funcional composta por Advanced Master Mix e sondas para recomendações comerciais. Consulte a seção 7 para obter um exemplo de preparação. Mantenha todas as soluções e amostras de cDNA no gelo.
    NOTA: Um par de sondas com dois corantes diferentes é comumente usado por poço. Por exemplo, neste estudo, Crygs-FAM-MGB foi usado como o gene de sonda de interesse e Ppia-VIC-MGB como controle interno. As recomendações comerciais para as concentrações finais da sonda e do primer são 250 nM e 900 nM, respectivamente. Se um alvo for muito expresso, uma sonda limitada por primer pode ser necessária para evitar o esgotamento dos reagentes de reação.
  3. Carregue o estoque de cDNA (1 μL) em poços apropriados na placa qPCR, seguido pela mistura principal de trabalho (9 μL). Misture as soluções pipetando para cima e para baixo lentamente enquanto adiciona a mistura principal. Certifique-se de que a gota de cDNA seja misturada à solução e evite bolhas.
    NOTA: Dependendo da sensibilidade do alvo, a placa pode precisar ser carregada no gelo.
  4. Sele a placa qPCR aplicando cuidadosamente uma tampa adesiva óptica. Use um aplicador de filme adesivo para alisar a tampa e garantir uma vedação firme ao redor de cada poço.
  5. Placas de vórtice a 1000 RPM por 10 s para misturar.
  6. Centrifugue as placas a 1000 x g por 2 min em temperatura ambiente para garantir que não haja bolhas de ar no fundo dos poços.
  7. Carregue a placa em um termociclador PCR quantitativo e execute usando os ciclos listados na Tabela 2.
    NOTA: Os protocolos convencionais de qPCR são normalmente limitados a 40 ciclos. É improvável que o aumento da contagem de ciclos produza resultados significativos, pois em 40 ciclos, uma única cópia de destino pode, teoricamente, render aproximadamente 1 trilhão de amplicons19.
PassoTemperatura (°C)Tempo(s)Ciclos
Inativação de uracila-N-glicosilase (UNG)501201
Desnaturação951201
Desnaturação95145
Recozimento6020
Segurar4∞1

Tabela 2: Condições do termociclador para reação em cadeia da polimerase quantitativa. Essas condições estão sintonizadas com uma série específica de ensaios comerciais de expressão gênica. Os parâmetros padrão são usados, com exceção do aumento dos ciclos de amplificação de 40 para 45.

7. Exemplo de cálculo de volume para qPCR

NOTA: Um código-fonte R para uma calculadora de volume para as equações descritas abaixo está disponível no Arquivo Suplementar 1. Esta calculadora é para as sondas Taqman e master mix listadas na Tabela de Materiais.

  1. Determine o número de poços a serem pipetados e calcule um mínimo de 12,5% de excesso. Essa constante de excesso (kExcesso) compensa o erro de pipetagem e garante que haja solução suficiente. Para este exemplo, 96 poços serão usados como alvo para a preparação da amostra.
    Equação:
    figure-protocol-1
    Exemplo:
    figure-protocol-2
    NOTA: Se 12,5% de excesso não for um número inteiro, uma maneira fácil de garantir números "bons" nas etapas subsequentes é arredondar para o poço mais próximo e ajustar kExcesso de acordo.
  2. Calcule o volume da mistura principal de trabalho. Nesses experimentos, 1 μL de cDNA e 9 μL de master mix de trabalho são usados por poço. Os volumes de cDNA e master mix podem ser ajustados conforme necessário.
    Equação:
    figure-protocol-3
    Exemplo:
    figure-protocol-4
  3. Calcule o modificador de concentração (kConc). Este modificador é usado para criar uma mistura master de trabalho mais concentrada que se diluirá para 1x quando misturada com cDNA.
    Equação:
    figure-protocol-5
    Exemplo:
    figure-protocol-6
  4. Calcule o volume da sonda (20x).
    Equação:
    figure-protocol-7
    Exemplo:
    figure-protocol-8
  5. Calcule o volume de estoque master mix (2x).
    Equação:
    figure-protocol-9
    Exemplo:
    figure-protocol-10
  6. Levar a mistura principal de trabalho até ao volume calculado utilizando H2O de qualidade molecular.
    Equação:
    figure-protocol-11
    figure-protocol-12
    figure-protocol-13
    figure-protocol-14
    figure-protocol-15
    Exemplo:
    figure-protocol-16
    figure-protocol-17
    figure-protocol-18
    figure-protocol-19
    figure-protocol-20

Arquivo Suplementar 1: Um código-fonte R para uma calculadora de volume. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Resultados

O epitélio e as fibras do cristalino foram isolados de camundongos selvagens de 6 a 7 semanas de idade. Três camundongos foram usados para esses experimentos, e 2 cápsulas de lente ou 2 massas de células de fibra de cada camundongo foram agrupadas para uma réplica biológica. Conforme descrito no protocolo, o RNA foi extraído usando a separação de fases do reagente TRIzol. Em média, um par de epitélio do cristalino e massas a granel de fibra produziram 0,8 μg (DP ± 0,2) e 9,7 μg (DP ± 2,3) de RNA, respectivamente. A conce...

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Discussão

As etapas apresentadas aqui demonstram a capacidade de isolar o RNA de compartimentos de lentes separados que podem ser transcritos reversamente com sucesso em cDNA para métodos de biologia molecular. Devido à natureza sensível dos métodos de análise, é essencial que a lente esteja limpa de tecidos aderidos na fase de dissecção. Isso pode exigir algumas iterações de rolagem da lente em um Kimwipe para obter uma limpeza adequada. Deve-se tomar cuidado para não penetrar muito profundamente...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pela bolsa R01 EY032056 (para CC) do National Eye Institute.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Centrífuga e rotorFisher Científico14285554PM
Clorofórmio, grau HPLCAlfa Aesar22920
Etanol (190 provas)Laboratórios Decon2801
Etanol (à prova de 200)BioReagentes FisherBP2818
Fisherbrand Pellet PilãoFisher Científico12-141-363
Fórceps Curvo; Pinças de Estudante #7Instrumentos de precisão mundiais501981
fórceps reto; Dumont #5Ferramentas de Belas Ciências11252-40
fórceps reto; Pinças de Estudante #4Instrumentos de precisão mundiais501978
Kimwipes pequenosKimberly-Clark34155Limpeza de tarefas delicadas
Aplicador de filme adesivo MicroAmpBiossistemas Aplicados4333183
MicroAmp EnduraPlate Placa de Reação Rápida Rápida de 96 Poços com Código de BarrasBiossistemas Aplicados4483485
MicropipetadoresEppendorf  01-671-120
Microscópio, DissecçãoCarl ZeissSteREO Discovery.V8
Capa adesiva óptica MiniAmpBiossistemas Aplicados4360954
Termociclador MiniAmpBiossistemas AplicadosRolamento A37834
Misturador de vórtice de placas MixMateEppendorf5353000529
Água de grau molecularFisher CientíficoBP28191
Nanodrop One Microvolume UV-Vis EspectrofotômetroThermo CientíficoND-UM-W
Minibandejas Nunc MicroWellFisher Científico12-565-154Bandeja de dissecção
Tubos de PCRVWR201007-012
Placa de Petri, 60 mm x 15 mmFisher CientíficoFB0875713A
Solução salina tamponada com fosfato, 1x Dulbecco'sGibco14190-136
Ponteiras de Pipeta, 10 µ L GraduadoEUA Científico1161-3700
Ponteiras de Pipeta, 1250 µ L XL GraduadoEUA Científico1161-1720
Ponteiras de Pipeta, 200 µ Perfil L GraduadoEUA Científico1163-1700
Sistema de PCR em tempo real QuantStudio 3Biossistemas AplicadosA28567
Transcriptase Reversa, SuperScript IV VILO Invitrogen11756050Transcriptase reversa altamente processiva e termoestável
Kit RNA Clean e Concentrador 5ZymoZR1013
Água sem RNaseBioReagentes FisherBP2819
RNaseZapSigmaR2020Solução de descontaminação de RNase
Microcentrífuga SealRite Tubos de 1,5 mLEUA Científico1615-5500
SuperFine Vannas 8 cmInstrumentos de precisão mundiais501778Tesoura
TaqMan FAST Advanced Master Mix para qPCRBiossistemas Aplicados4444557
Sonda de Ensaio de Expressão Gênica TaqMan (FAM) (MTO)ThermoFisher Scientific4448892
TRIzolInvitrogen15596026Solução de ácido-guanidínio-fenol
Misturador de vórticeThermo Científico88880017

Referências

  1. Lovicu, F. J., Robinson, M. L. Development of the Ocular Lens. , Cambridge University Press. (2004).
  2. Bassnett, S., Winzenburger, P. A. Morphometric analysis of fibre cell growth in the developing chicken lens. Exp Eye Res. 76 (3), 291-302 (2003).
  3. Kuszak, J. R. The ultrastructure of epithelial and fiber cells in the crystalline lens. Int Rev Cytol. 163, 305-350 (1995).
  4. Yamamoto, N., Majima, K., Marunouchi, T. A study of the proliferating activity in lens epithelium and the identification of tissue-type stem cells. Med Mol Morphol. 41 (2), 83-91 (2008).
  5. Bassnett, S. On the mechanism of organelle degradation in the vertebrate lens. Exp Eye Res. 88 (2), 133-139 (2009).
  6. Bassnett, S. The fate of the Golgi apparatus and the endoplasmic reticulum during lens fiber cell differentiation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (9), 1793-1803 (1995).
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