Este estudo apresenta um método para avaliar a função do PAK5 no ESCC, mostrando que sua superexpressão prevê um prognóstico ruim e promove a progressão tumoral através do eixo de sinalização PAK5-GAREM1.
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Artigo de investigação
Este estudo apresenta um método para avaliar a função do PAK5 no ESCC, mostrando que sua superexpressão prevê um prognóstico ruim e promove a progressão tumoral através do eixo de sinalização PAK5-GAREM1.
O carcinoma de células escamosas esofágicas (ESCC) é uma das principais causas de mortalidade relacionada ao câncer globalmente, especialmente na Ásia. Devido à falta de sintomas iniciais, a maioria dos pacientes é diagnosticada em estágios avançados, limitando a eficácia do tratamento e piorando o prognóstico. Compreender os mecanismos subjacentes à ESCC e identificar biomarcadores ou alvos terapêuticos são cruciais para melhorar os resultados dos pacientes. A proteína quinase 5 ativada por P21 (PAK5), membro da família das proteínas quinases ativadas por mitógeno, tem sido implicada em várias malignidades ao regular o ciclo celular, migração e invasão. No entanto, seu papel no ESCC permanece incerto. Este estudo avaliou a expressão do PAK5 em tecidos ESCC e tecidos normais adjacentes usando imunohistoquímica e realizou análise de sobrevivência de Kaplan-Meier para avaliar a associação entre PAK5 e prognóstico. Modelos celulares ESCC com superexpressão e knockdown do PAK5 foram estabelecidos, e ensaios funcionais, incluindo CCK-8, formação de colônias e ensaios Transwell, foram realizados. Além disso, foi realizado sequenciamento de mRNA para identificar alvos a jusante e vias de sinalização reguladas pelo PAK5. Esses resultados mostraram que a expressão de PAK5 foi significativamente elevada nos tecidos ESCC em comparação com tecidos normais e esteve associada a um prognóstico ruim. Ensaios funcionais revelaram que o PAK5 promovia a proliferação celular de ESCC, formação de colônias, migração e invasão, enquanto a análise transcriptômica destacou o GAREM1 como um efetor-chave a jusante. Esses achados indicam que o PAK5 contribui para a progressão das CCES e pode servir como biomarcador prognóstico e alvo terapêutico.
Globalmente, o câncer de esôfago está entre os tumores malignos mais letais. Na China, o carcinoma de células escamosas esofágicas (CCE) representa o subtipo histológico predominante. Embora avanços terapêuticos tenham sido alcançados, o prognóstico para pacientes com CCE continua desanimador, manifestando-se como uma taxa de sobrevivência a 5 anos de apenas 10% a 25%. Isso se deve em grande parte aos desafios da detecção precoce e à disponibilidade limitada de terapias molecularmente direcionadaseficazes 2. Ao contrário de outros tumores sólidos, onde terapias direcionadas mostraram grande potencial, tais abordagens no ESCC ainda estão em sua infância, prejudicadas pela escassez de alvos moleculares acionáveis.
PAK5, um PAK do grupo II, integra dinâmica do citoesqueleto e sinalização pró-sobrevivência e tem sido associado à quimiorresistência em váriasmalignidades 3,4,5,6,7,8,9,10,11. Dado o papel proeminente da sinalização MAPK na biologia ESCC e na respostaterapêutica 1,2,12, foi hipotetizado que o PAK5 é regulado para cima no ESCC e promove fenótipos malignos por meio da modulação da sinalização MAPK, potencialmente envolvendo GAREM1 como adaptador/regulador 13,14,15,16. IHC quantitativa, perturbação genética funcional e perfil transcriptômico foram empregados para testar essa hipótese.
O manejo da CCE normalmente envolve uma combinação de esofagectomia, quimioterapia e radioterapia. Embora a esofagectomia possa ser curativa, ela apresenta alto risco demorbidade 4,8. Além disso, tanto a quimioterapia quanto a radioterapia frequentemente falham em eliminar todas as células cancerígenas, resultando em resistência, recidiva e metástase. A imunoterapia tem se tornado um foco proeminente na oncologia recentemente, demonstrando eficácia no tratamento de cânceres avançados. Esse interesse crescente destaca a necessidade urgente de novos biomarcadores que possam auxiliar no diagnóstico precoce e no planejamento do tratamento para a ESCC. Estudos anteriores mostraram que outros membros da família PAK, como PAK1 e PAK4, promovem proliferação, invasão e resistência à terapia no ESCC, ressaltando a importância dessa família de quinases na biologia do ESCC. No entanto, o papel do PAK5, um PAK menos estudado do grupo II, permanece pouco definido, motivando o estudoatual 17,18.
A quinase 5 ativada por P21 (PAK5), membro da subfamília PAK II, foi identificada pela primeira vez como uma quinase específica do cérebro em 2002. Localizado no cromossomo 20p12, o PAK5 codifica uma proteína de aproximadamente 80 kDa e é encontrado principalmente nas mitocôndrias e no núcleo, onde desempenha papéis diversos na regulação celular 10,11,13. Suas funções nas mitocôndrias incluem metabolismo e regulação da energia, enquanto sua presença nuclear está ligada à transcrição gênica e ao controle do ciclo celular. Embora o PAK5 seja menos estudado do que seus equivalentes, acredita-se que ele seja crucial para o neurodesenvolvimento, sobrevivência celular e progressão do câncer10. Notavelmente, o PAK5 tem sido implicado na regulação do citoesqueleto, mecanismos antiapoptóticos e proliferaçãocelular 12. Sua regulação positiva em células neoplásicas tem sido associada à resistência emergente de medicamentos, ressoando com achados que associam a superexpressão do PAK5 ao aumento da resistência das células tumorais àquimioterapia 10,11,13,14. No entanto, a função precisa do PAK5 na progressão do ESCC permanece difícil de alcançar. Este estudo investiga a influência do PAK5 no meio transcriptômico do ESCC e suas ramificações funcionais. O perfil transcriptômico foi realizado para identificar alterações na expressão gênica associadas à atividade do PAK5 em células ESCC. Além disso, foi gerado um modelo celular ESCC com modulação controlada de PAK5 para elucidar seu papel no crescimento tumoral e no potencial metastático. Diferentemente das estratégias convencionais de descoberta de biomarcadores no ESCC, que dependem principalmente de Western blotting ou medições de transcritos de modalidade única, o fluxo de trabalho atual integra imunohistoquímica quantitativa, perfil transcriptômico e ensaios funcionais. Essa abordagem combinada permite validação molecular e fenotípica simultânea, fornecendo insights mecanicistas enquanto melhora a relevância biológica. Além disso, o protocolo enfatiza a reprodutibilidade experimental, utilizando amostras pareadas de tumores e tecidos adjacentes, procedimentos padronizados de imunocoloração e entradas de RNA de alta qualidade (número de integridade do RNA ≥ 7) para sequenciamento. Essas características aumentam a robustez e aplicabilidade dos ensaios em laboratórios, especialmente para estudos que buscam definir redes regulatórias baseadas em quinases clinicamente significativas no ESCC.
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Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética do Segundo Hospital Afiliado da Universidade Médica de Hainan (Aprovação nº LW2022602), e o consentimento informado foi obtido de cada participante de acordo com a Declaração de Helsinque. Os reagentes e os equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Coleta de amostras de pacientes e tecidos
Um total de 40 pacientes com CCE patologicamente confirmada foi inscrito, todos com função hepática e renal normais antes da cirurgia. Amostras tumorais (Grupo T) e tecidos normais adjacentes (Grupo N; ≥2 cm da margem tumoral) foram coletados imediatamente após a resseção cirúrgica. Os tecidos foram fixados em paraformaldeído (PFA) a 4% em PBS em temperatura ambiente por 7 dias antes da incorporação da parafina.
2. Coloração imunohistoquímica
Blocos embutidos em parafina foram seccionados a 5 μm e cozidos a 60 °C por 1 hora. As seções foram desparafinizadas com substituto de xileno, reidratadas por etanol graduado e submetidas à coleta de antígeno em tampão de citrato de sódio de 10 mM (pH 6,0) a 95-98 °C por 20 minutos. A atividade endógena da peroxidase foi apagada com peróxido de hidrogênio a 3% por 10 minutos, seguida de bloqueio com soro normal a 5% por 30 minutos em temperatura ambiente. As seções foram incubadas durante a noite (12-16 h) a 4 °C com anticorpo primário anti-PAK5 (diluição 1:100, veja Tabela de Materiais). Após lavagens com PBS, as lâminas foram incubadas com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de raiz-forte por 30 minutos em temperatura ambiente, desenvolvidas com DAB até a coloração aparecer (1-5 min, monitoradas ao microscópio para evitar supercoloração) e contra-coloridas com hematoxilina por 30-60 segundos. As seções foram desidratadas, montadas e fotografadas sob um microscópio de campo claro. A intensidade da coloração e a proporção de células positivas foram quantificadas usando software de análise de imagem com pelo menos cinco campos aleatórios por seção (ampliação 200×). O método de quantificação adotou o cálculo do escore H, com a fórmula: H-score = ∑ (grau de intensidade de coloração × porcentagem de células positivas) (intensidade classificada como 0 = negativa, 1 = fraca, 2 = moderada, 3 = forte; percentual categorizada como 0-25%, 26-50%, 51-75%, 76-100%). Para garantir a confiabilidade, dois patologistas independentes realizaram pontuação às cegas, com um acordo entre observadores de valor κ ≥ 0,75. Critérios de controle de qualidade foram rigorosamente implementados: controles positivos (tecido ESCC PAK5 positivo conhecido) e controles negativos (anticorpo primário substituídos por PBS) devem passar pela validação; a intensidade da coloração de fundo deve estar abaixo de um limite pré-definido (por exemplo, H-score < 50); o coeficiente de variação (CV) dos resultados de coloração entre lotes duplicados deve ser <20% para excluir variabilidade experimental.
3. Linhas celulares e cultura
As células KYSE-150 (ESCC humana) e HEK-293 (embalagem viral) foram autenticadas por perfilamento de repetição em tandem (STR) e confirmadas como livres de micoplasma. Células KYSE-150 foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina (100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina). As células HEK-293 foram mantidas em DMEM suplementadas com os mesmos aditivos. As células foram subcultivadas usando 0,25% de tripsina-EDTA quando atingiram 70%-80% de confluência, e foram semeadas até densidades apropriadas 24 horas antes de cada experimento.
4. Construção do vetor lentiviral e infecção
Vetores lentivirais foram projetados para sobreexpressar PAK5 (pLV-EF1α-PAK5-PGK-Puro) ou silenciar PAK5 (pLV-U6-shRNA-PAK5-PGK-Puro). As células HEK-293 foram semeadas em placas de 10 cm e transfectadas em 70%-80% de confluência com o plasmídeo de transferência, os plasmídeos de embalagem (gag/pol e rev) e o plasmídeo de envelope (VSV-G) em uma proporção 4:3:1 usando um reagente transfeccionante à base de lipídios, com uma quantidade total de DNA de ~20 μg por prato de 10 cm. O meio foi substituído 6-8 horas após a transfecção. Supernadantes virais foram coletados em 48 h e 72 h, centrifugados a 500 × g por 10 minutos para remover detritos, filtrados por um filtro de 0,45 μm e concentrados ou armazenados a −80 °C. Para a transdução, as células de KYSE-150 foram semeadas um dia antes da infecção e expostas a supernadante viral em uma multiplicidade de infecções (MOI) de 5-10 na presença de 8 μg/mL de polibrene. MOI foi definido como a proporção de unidades infecciosas para número de células-alvo. Foi realizado um pré-experimento para estimar o MOI usando contagem de GFP ou qPCR, e um MOI de 5 a 10 foi selecionado. O meio foi substituído após 12-16 horas, e uma curva de matança da puromicina foi estabelecida ao tratar células não transduzidas com concentrações de puromicina variando de 0-4 μg/mL durante 72-96 horas para determinar a concentração letal mínima. A concentração selecionada para seleção foi de 1-2 μg/mL, e a concentração de manutenção foi de 0,5-1 μg/mL. As células foram selecionadas com puromicina (1-2 μg/mL) a partir de 48 horas depois. A superexpressão ou silenciamento do PAK5 foi verificada por RT-qPCR usando espoletas específicas para PAK5 (direto 5′-CCAAAGCCTATGGTGGGACCC-3′, reverso 5′-AGGCCGTTGATGGAGGTTTC-3′) e GAPDH (adiante 5′-GTGGACATCCCCGCAAAGAC-3′, reverso 5′-AAAGGGTGTTAACGCAACTA-3′). A expressão relativa do PAK5 foi calculada usando o método 2−ΔΔCt . Todos os experimentos foram realizados com pelo menos três réplicas biológicas.
5. Ensaio de viabilidade de células CCK-8
A viabilidade celular foi avaliada usando o Kit de Contagem Celular-8 (CCK-8), que se baseia na redução do reagente WST-8 por desidrogenases celulares. Células KYSE-150 de crescimento logarítmico foram semeadas a 2.000 células por poço em placas de 96 poços em meio completo de 100 μL. Em 0 h, 24 h, 48 h, 72 h e 96 h, 10 μL do reagente CCK-8 (contendo WST-8) foram adicionados a cada poço. Após a incubação a 37 °C por 2 horas, a absorvância a 450 nm (A450) foi medida com um leitor de microplacas. Poços em branco contendo apenas meio foram incluídos. Cada grupo experimental continha pelo menos três réplicas biológicas, e cada medição era realizada com cinco réplicas técnicas.
6. Ensaio de formação de colônias
Suspensões de célula única de KYSE-150 foram semeadas a 1.000 células por poço em placas de 6 poços e cultivadas por 14 dias, com o meio substituído a cada 2-3 dias. As colônias foram fixadas com 4% de PFA por 15 minutos, coradas com 0,1% de violeta cristalino em metanol a 20% por 15 minutos, enxaguadas com água e secas ao ar. Colônias contendo mais de 50 células foram contadas usando software de análise de imagem, e a taxa de formação da colônia foi calculada.
7. Ensaio de invasão Transwell
Inserts com poros de 8 μm foram pré-revestidos com matriz de membrana basal (50 μL por inserção, diluição 1:8) e incubados a 37 °C por 1 hora; O controle de qualidade foi realizado antes da semente das células: inserções em branco (sem células) e insertos de controle negativo (sem quimioatrativo) foram configurados para verificar a validade do ensaio, e a uniformidade da camada da matriz da membrana basal foi confirmada por inspeção visual (ou medição de peso para controle mais rigoroso). As células foram privadas de soro em meio FBS a 1% por 6 a 12 horas, e 2 células × 10⁵ por mL (200 μL por inserção) foram semeadas na câmara superior. A câmara inferior continha 600 μL de meio com 20% de FBS como quimioatrator. Após 24 horas de incubação, as células não invadidas na superfície superior foram removidas, e as células invadidas na superfície inferior foram fixadas com metanol por 10 minutos e coradas com 0,1% de violeta cristalino por 15 minutos. As células coloridas foram imagens sob um microscópio de campo claro e contadas em pelo menos cinco campos microscópicos aleatórios por inserto (ampliação 200×); A contagem foi realizada usando um método cego (o pessoal da contagem não tinha conhecimento das atribuições em grupo) para evitar viés subjetivo.
8. Detecção citométrica de fluxo da apoptose
As células foram colhidas (incluindo as células flutuantes), lavadas duas vezes com PBS e ressuspensas em tampão de ligação a 1 × 106 células/mL. Anexina V-FITC (5 μL) e iodeto de propidio (5 μL) foram adicionados a 100 μL da suspensão, seguidos por incubação em temperatura ambiente por 15 minutos no escuro; após a incubação, um tampão de ligação de 400 μL foi adicionado a cada amostra. Antes da análise citométrica de fluxo, o ajuste de compensação era realizado usando controles com coloração única (células com coloração única Annexin V-FITC e células coloridas únicas PI) para eliminar o vazamento de fluorescência, e a porta FSC/SSC foi configurada para selecionar células individuais (excluindo detritos e agregados celulares). As amostras foram analisadas em 1 hora em um citômetro de fluxo equipado com um laser de 488 nm, com pelo menos 10.000 eventos adquiridos por amostra. Índices apoptóticos foram quantificados usando software de análise de citometria de fluxo: um limiar uniforme de gate foi aplicado em todas as amostras para garantir consistência, e as proporções de células apoptóticas iniciais (Annexin V⁺/PI⁻) e células apoptóticas tardias (Annexin V⁺/PI⁺) foram reportadas separadamente para caracterizar o perfil apoptótico de cada grupo.
9. Sequenciamento de RNA e análise de bioinformática
O RNA total foi extraído e avaliado quanto à pureza (A260/280 entre 1,8 e 2,1) e integridade (RIN ≥7 como limiar de controle de qualidade). O mRNA foi purificado usando esferas de oligo(dT), fragmentado a 94 °C por 5-7 minutos e transcrito reversamente em cDNA. As bibliotecas eram preparadas por reparo de extremidade, ligação de adaptadores e amplificação por PCR (8-12 ciclos), e sequenciadas em uma plataforma Illumina para gerar leituras de 150 bp em extremidade pareada a uma profundidade de 30-50 milhões de pares de leitura por amostra. As leituras foram cortadas e alinhadas ao genoma de referência humano usando STAR ou HISAT2. Contagens de genes foram obtidas com featureCounts, e análise diferencial de expressão foi realizada com DESeq2, aplicando limiares de FDR < 0,05 e |log2 fold change| ≥ 1. A análise de enriquecimento funcional de genes diferencialmente expressos foi realizada usando clusterProfiler para vias de Ontologia Gênica e KEGG (com Benjamini-Hochberg (BH) corrigido FDR < 0,05), e redes de interação proteína-proteína foram construídas usando o banco de dados STRING.
10. Análise estatística
Dados contínuos foram expressos como média ± DS de pelo menos três experimentos independentes. Comparações entre dois grupos foram realizadas com testes t despareados de duas caudas, e comparações entre três ou mais grupos foram realizadas com ANOVA unidirecional seguidas pelo teste pós-hoc de Tukey. Testes não paramétricos foram aplicados quando apropriado. As distribuições de sobrevivência foram estimadas por análise de Kaplan-Meier com testes de classificação logarítmica. Para dados de RNA-seq, a correção de múltiplos testes foi realizada usando o método de Benjamini-Hochberg. Os valores p exatos são relatados em legendas de figuras; A significância estatística foi considerada em p < 0,05, com * indicando p < 0,05 e **indicando p < 0,01.
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PAK5 é altamente expresso no ESCC e está associado a um prognóstico ruim
A Figura 1 ilustra o fluxo de trabalho geral, desde a validação clínica do PAK5 até a análise funcional e transcriptômica, que identifica o GAREM1 como um alvo a jusante. Para testar a hipótese de que o PAK5 promove a progressão das ESCC modulando a via MAPK via GAREM1, foram examinados os padrões de expressão do PAK5 nos tecidos das ESCC e sua associação c...
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Este estudo oferece um exame aprofundado do papel do PAK5 na progressão do carcinoma escamoso esofágico (ESCC), combinando amostras clínicas, ensaios funcionais e análise transcriptômica. Esses achados ampliam a compreensão do envolvimento do PAK5 no ESCC, destacando seu potencial tanto como marcador prognóstico quanto como alvo terapêutico.
A superexpressão marcada do PAK5 nos tecidos da CCE e sua associação com a menor sobrevivência do paciente é consistente...
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Os autores declaram que não possuem interesses financeiros ou relacionamentos pessoais concorrentes que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.
Esse trabalho foi apoiado pela Fundação Provincial de Ciências Naturais de Hainan da China (Bolsa nº 822QN474).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Kit de detecção de apoptose Annexin V-FITC | Beyotime Biotecnologia | C1062S | Kit de manchação para detecção de apoptose |
| Anticorpo anti-PAK5 | Abcam | ab110069 | Anticorpo primário para IHC, diluição 1:100 |
| Sistema automatizado de eletroforese | Agilent | Bioanalisador 2100 | Avaliação da integridade do RNA |
| Kit de síntese de cDNA | Invitrogen | 1896649 | Kit de transcrição reversa |
| Solução de violeta cristalina | Sigma-Aldrich | C3886 | Corante de coloração para colônias e invasão |
| DMEM Medium | Gibco (Thermo Fisher) | 11965092 | Meio de cultura celular |
| Soro Bovino Fetal (FBS) | Gibco (Thermo Fisher) | 16000044 | Suplemento de cultura celular |
| Citômetro de fluxo | BD em Biociências | FACSCanto II | Instrumento para análise celular |
| GraphPad Prisma | GraphPad Software | Versão 8 | Software de análise estatística e gráficos |
| H& Kit de Coloração E | Solarbio | G1120 | Solução de coloração de hematoxilina e eosina |
| IgG Anti-Rato conjugado com HRP | Abcam | ab150165 | Anticorpo secundário para IHC |
| Sequenciador Illumina NovaSeq | Illumina | NovaSeq 6000 | Plataforma de sequenciamento de alta taxa |
| Linha celular KYSE-150 | Banco de Células RIKEN | RCB2057 | Linha celular de carcinoma escamoso esofágico humano |
| Lipofectamina 3000 | ThermoFisher | L3000008 | Reagente de transfecção |
| Leitor de microplacas | Instrumentos Bio-Tek | ELx808 | Instrumento de medição de absorção |
| DynabeadTM Oligo(dT)25s | Thermo Fisher Scientific | 61005 | Para purificação de mRNA |
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco (Thermo Fisher) | 15140122 | Antibióticos para cultura celular |
| Prodídio iodeto (PI) | Sigma-Aldrich | P4864 | Corante de coloração de DNA |
| RPMI-1640 Médio | Gibco (Thermo Fisher) | 11875093 | Meio de cultura celular |
| Espectrofotômetro | Thermo Fisher | NanoDrop ND-1000 | Medição de concentração e pureza de RNA |
| Software SPSS | IBM | Versão 23 | Software de análise estatística |
| Inserts Transwell | Corning | 3422 | Inserções de ensaio de invasão celular |
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