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Geração de organoides de pele planar com pêlos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos usando um sistema de cultura de interface ar-líquido

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DOI:

10.3791/69088

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17 de outubro de 2025

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1Department of Anatomy and Embryology, Leiden University Medical Center, 2The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), Leiden University Medical Center, 3CEA, Inserm, IRIG, UA13 BGE, Biomics, University of Grenoble Alpes

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um método para produzir organoides da pele contendo folículos pilosos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos usando um sistema de cultura de interface ar-líquido planar e fisiologicamente relevante para replicar a arquitetura e a função da pele.

Resumo

Os organoides da pele (SOs) derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSC) contendo folículos pilosos fornecem um modelo in vitro sofisticado para investigar interações intercelulares dentro do microambiente da pele. Inicialmente desenvolvidos em uma configuração cística invertida, onde a derme é exposta ao ambiente e a epiderme voltada para dentro em direção ao centro organoide, os SOs podem ser posteriormente transferidos para uma configuração planar em um sistema de cultura de interface ar-líquido (ALI), que se assemelha mais à fisiologia da pele humana. Este manuscrito apresenta um protocolo abrangente para gerar e selecionar SOs císticos que podem ser dissecados em SOs planares e posteriormente desenvolvidos em um sistema de cultura ALI. O protocolo inclui pontos de verificação definidos para avaliação qualitativa macroscópica em estágios críticos do desenvolvimento de organoides, detalha as etapas técnicas necessárias para achatar SOs císticos em pele plana, especifica condições ideais para cultura de LPA e demonstra resultados por meio de análise molecular. No dia 27, a coloração por imunofluorescência com marcadores específicos da linhagem revelou um epitélio pigmentado pluriestratificado com apêndices cutâneos, incluindo folículos pilosos e estruturas semelhantes a glândulas sebáceas. Este protocolo fornece um método robusto para gerar SOs planares com apêndices, oferecendo um modelo in vitro fisiologicamente relevante. Este sistema suporta diversas aplicações na pesquisa da pele e já foi usado com sucesso para modelar infecção por patógenos, danos teciduais induzidos por radiação ultravioleta e respostas a medicamentos.

Introdução

A pele forma uma barreira protetora crucial entre os organismos e seu ambiente, ao mesmo tempo em que regula a temperatura corporal, o equilíbrio hídrico e a entrada sensorial. É composto por três camadas principais: a epiderme, um epitélio de queratinócitos estratificado com superfície cornificada; a derme, um tecido conjuntivo rico em matriz extracelular, fibroblastos, nervos, vasos sanguíneos e células imunológicas; e a hipoderme, que consiste principalmente de adipócitos subcutâneos. A função da pele humana também depende de apêndices especializados, como folículos pilosos (HFs), glândulas sebáceas e glândulas sudoríparas1.

As doenças de pele estão entre as condições médicas mais comuns em todo o mundo 2,3. Historicamente, a maioria dos estudos focados na pele foi conduzida usando modelos animais4, que replicam a complexidade fisiológica do órgão dentro de um contexto sistêmico. No entanto, diferenças significativas entre espécies4, juntamente com crescentes preocupações éticas, impulsionaram o desenvolvimento de modelos de pele humana fisiologicamente relevantes.

Os modelos convencionais de pele humana se enquadram em duas categorias: epiderme humana reconstruída, que consiste em queratinócitos estratificados, e pele humana reconstruída, que adicionalmente incorpora um compartimento dérmico subjacente composto de fibroblastos embutidos em uma matriz de colágeno5. Embora ambos os tipos de modelo tenham avançado significativamente nossa compreensão da fisiologia da pele, eles carecem da fidelidade arquitetônica total e da diversidade celular da pele humana nativa. Uma das principais limitações desses modelos é a ausência de apêndices cutâneos, como HFs, tornando-os inadequados para pesquisas e testes de drogas relacionadas a doenças de pele que envolvem crescimento e regeneração de pelos6. Embora sistemas mais avançados que incorporam HFs tenham sido relatados, eles não conseguem recapitular totalmente a complexidade da estrutura e do microambiente do HF ou dependem de tecnologias complexas, como bioimpressão ou micromoldagem 7,8,9,10.

Um novo modelo de pele que aborda vários desses desafios é o organoide da pele (SO), gerado a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs)11. Imitando o desenvolvimento embrionário, as hiPSCs podem ser direcionadas para as linhagens de ectoderma da superfície craniana e crista neural craniana, auto-organizando-se em estruturas císticas que se assemelham muito à pele humana. Esses SOs contêm quase todos os tipos de células da pele não imunes, organizadas em uma epiderme estratificada e uma derme rica em matriz extracelular. É importante ressaltar que os SOs apoiam o desenvolvimento de apêndices cutâneos: HFs e glândulas sebáceas. Dada a escalabilidade virtualmente ilimitada dos hiPSCs, os SOs permitem engenharia genética sofisticada e o desenvolvimento de novas ferramentas funcionais. Como tal, os SOs representam um grande avanço no campo e são promissores para aplicações em biologia do desenvolvimento, modelagem de doenças, testes de drogas e medicina regenerativa.

No entanto, uma limitação considerável permanece: os SOs formam estruturas císticas invertidas nas quais a epiderme está localizada dentro do cisto dérmico, protegida de forças mecânicas e submersa em meio aquoso. Essa configuração não é apenas fisiologicamente imprecisa, mas também impede o estabelecimento da interface ar-líquido (ALI). Como resultado, os SOs císticos têm aplicação limitada para estudos envolvendo a barreira epidérmica, forças mecânicas ou tratamentos apicais diretos. Para resolver esse problema, um método reprodutível para achatar mecanicamente os SOs císticos e, posteriormente, cultivá-los como pele plana sob uma condição de LPA é apresentado abaixo. Essa abordagem, originalmente relatada por Jung et al., reorganiza a arquitetura do tecido para que a epiderme apical fique exposta ao ar, promovendo maior estratificação e função de barreira12. Os organoides planares resultantes retêm a arquitetura complexa da pele humana, ao mesmo tempo em que refletem a orientação fisiologicamente precisa do tecido, permitindo o acesso experimental à superfície apical. Embora o procedimento seja demorado (~ 100 dias) e envolva algumas etapas tecnicamente desafiadoras, particularmente ao dissecar SOs císticos em SOs planares, pode ser de particular interesse para pesquisadores que já trabalham com SOs ou outros equivalentes de pele humana que desejam aumentar a relevância fisiológica de seus sistemas modelo.

Protocolo

A Figura 1 apresenta o fluxo de trabalho para gerar SOs planares usando um sistema de cultura ALI. A primeira seção descreve a geração de SOs císticos a partir de hiPSCs com base na metodologia pioneira de Karl R. Koehler11, com pequenas modificações (Figura 2). A segunda seção detalha o procedimento para desenvolver ainda mais SOs císticos em SOs planares usando um sistema de cultura ALI conforme descrito anteriormente12, com modificações (Figura 3). Todos os produtos químicos e materiais estão listados na tabela de materiais. Três linhagens hiPSC descritas anteriormente (LUMCi001-A, LUMCi004-A e WT2) foram usadas para gerar SOs (https://hpscreg.eu/)13.

1. Geração de SOs císticos

A Figura 2 apresenta as morfologias esperadas e aberrantes nas principais etapas.

  1. Agregação celular (Dia -2)
    1. Cultive hiPSCs em uma placa padrão de 6 poços até que atinjam 70-80% de confluência.
    2. Lave as células com 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (DPBS) de Dulbecco. Adicione 1 mL de Reagente de Dissociação Celular (CDR) e incube a 37 °C com 5% de CO2 por ~6 min para soltar os hiPSCs sem separá-los da matriz (evite a digestão excessiva).
    3. Aspirar o CDR e adicionar 1 ml de meio de manutenção hiPSC (hiMM) contendo 10 μM de inibidor de ROCK. Separe suavemente as células pipetando para cima e para baixo com uma pipeta P1000 e prepare uma suspensão celular a 3,5 × 103 células / mL.
    4. Dispense 100 μL da suspensão celular em cada poço de uma placa de fixação ultrabaixa com fundo em U de 96 poços usando uma pipeta multicanal. Centrifugue a placa a 110 × g durante 6 min à temperatura ambiente e incube a 37 °C com 5% de CO2.
  2. Diluição do inibidor de ROCK (Dia -1)
    1. Prepare hiMM contendo 100 μg / mL de suplemento antibiótico-antimicótico (AAS).
    2. Dispensar 100 μL por alvéolo e incubar a 37 °C com 5% de CO2.
  3. Indução do ectoderma de superfície (Dia 0)
    1. Descongele o volume apropriado da matriz da membrana basal no gelo antes de prosseguir para a próxima etapa. Prepare o meio mínimo hiPSC (hiMinM) suplementado com matriz de membrana basal (2%), BMP4 (2,5 ng/mL), SB431542 (10 μM) e bFGF (4 ng/mL) (referido como hiMinM+SFB) no gelo.
      NOTA: A concentração de BMP4 pode precisar ser ajustada dependendo da linha celular usada (consulte a discussão).
    2. Colete os agregados celulares em um tubo de fundo redondo de 2 mL usando uma ponta de pipeta P200 de orifício largo.
      NOTA: Use pontas de orifício largo disponíveis comercialmente. Selecione um orifício com um diâmetro interno de pelo menos 2 mm para minimizar os danos aos agregados. Como alternativa, aqueça um bisturi com um esterilizador de alça infravermelho e use-o para criar um orifício largo a partir de uma ponta de pipeta convencional.
    3. Permitir que os agregados se depositem no fundo do tubo. Aspire cuidadosamente o meio e adicione 2 mL de hiMinM para lavar os agregados. Repita a lavagem para um total de 3x.
    4. Transfira os agregados de células em hiMinM + SFB frio para um poço de uma placa pré-resfriada de 6 poços usando uma ponta de pipeta P1000 de orifício largo. Em seguida, transfira cada agregado em 100 μL de hiMinM + SFB para uma placa de fixação ultrabaixa com fundo em U de 96 poços usando uma ponta de pipeta P200 de orifício largo. Coloque a placa de volta na incubadora a 37 °C com 5% de CO2.
      NOTA: Use um estereomicroscópio colocado sob uma capa de fluxo de ar laminar (LAF) para esta etapa.
  4. Indução de populações de células não epiteliais (Dia 3)
    1. Prepare hiMinM contendo LDN193189 (1 μM), bFGF (250 ng/mL) e AAS (100 μg/mL). Dispense 25 μL em cada poço usando uma pipeta multicanal.
    2. Agite suavemente a placa para garantir uma distribuição uniforme do meio. Coloque a placa de volta na incubadora a 37 °C com 5% de CO2.
  5. Fornecimento de nutrientes (Dia 6)
    1. Prepare hiMinM contendo AAS (100 μg/mL). Dispense 75 μL em cada poço usando uma pipeta multicanal.
    2. Agite suavemente a placa para garantir uma distribuição uniforme do meio. Coloque a placa de volta na incubadora a 37 °C com 5% de CO2.
  6. Refresco médio (dia 8 e dia 10)
    1. Prepare hiMinM contendo AAS (100 μg/mL). Remova cuidadosamente 100 μL de meio de cada poço usando uma pipeta multicanal. Dispense 100 μL de meio fresco em cada poço usando uma pipeta multicanal.
    2. Agite suavemente a placa para garantir uma distribuição uniforme do meio. Coloque a placa de volta na incubadora a 37 °C com 5% de CO2.
  7. Transição para placas de 24 poços de baixa fixação (Dia 12)
    1. Descongele o volume apropriado da matriz da membrana basal no gelo antes de prosseguir para a próxima etapa. Prepare o meio de maturação organoide (OMM) usando meio avançado (49% v / v), meio basal neural (49% v / v), suplemento de glutamina (1x), suplemento B-27 menos vitamina A (0,5x), suplemento N2 (0,5x), 2-mercaptoetanol (0,1 mM) e AAS (100 μg / mL). Prepare o volume apropriado de OMM frio contendo 1% de matriz de membrana basal (OMM1%M) e mantenha no gelo.
      NOTA: Use equipamento de proteção individual e trabalhe em uma área bem ventilada ao manipular o 2-mercaptoetanol.
    2. Colete os agregados celulares em um tubo de fundo redondo de 2 mL usando uma ponta de pipeta P1000 de orifício largo.
    3. Permitir que os agregados se depositem no fundo do tubo. Aspire cuidadosamente o meio. Adicione 1,5 mL de meio avançado para lavar os agregados. Repita a lavagem para um total de 3x.
    4. Transfira os agregados de células em OMM1%M frio para um poço de uma placa pré-resfriada de 6 poços usando uma ponta de pipeta P1000 de orifício largo. Em seguida, transfira cada agregado em 500 μL de OMM1%M para uma placa de baixa fixação de 24 poços usando uma ponta de pipeta P1000 de orifício largo. Coloque a placa de volta na incubadora a 37 °C com 5% de CO2.
      NOTA: Use um estereomicroscópio colocado sob um capuz LAF para esta etapa.
  8. Refresco médio (Dia 15)
    1. Descongele o volume apropriado da matriz da membrana basal no gelo antes de prosseguir para a próxima etapa. Prepare o volume apropriado de OMM1%M. Frio Mantenha no gelo.
    2. Usando pontas P1000, remova cuidadosamente 250 μL de meio de cada poço. Em seguida, adicione 250 μL de OMM1%M a cada poço. Colocar a placa de volta na incubadora a 37 °C com 5% de CO2 num agitador orbital regulado para 65 rpm.
  9. Entre o dia 18 e o dia 45, faça uma mudança meio média (250 μL) com OMM às segundas, quartas e sextas-feiras.
  10. Entre o dia 45 e o dia 90, realize uma mudança de meio meio (250 μL) com OMM às segundas e quartas-feiras e uma mudança de meio completo às sextas-feiras.

2. Transição de SOs císticos para SOs planares

NOTA: Os OS císticos apresentam morfologia invertida, com a epiderme voltada para dentro em direção ao centro do organoide e a derme em contato com o meio externo. Entre o dia 70 e o dia 90, dependendo da linha celular e da eficiência de diferenciação, a diferenciação suprabasal precoce da epiderme está bem avançada e os grampos de cabelo são desenvolvidos. Este é o estágio em que os SOs císticos são transferidos para um sistema de cultura ALI para obter tecido que se assemelha mais à pele humana nativa.

  1. Seleção de SOs císticos entre o dia 70 e o dia 90 para transição para SOs planares
    1. Selecione SOs císticos com diâmetro de pelo menos 5 mm e conteúdo mínimo de subproduto (células mesenquimais que se acumulam em um pólo do cisto e também podem conter cartilagem). Use a presença de placódios/pinos capilares como um indicador de qualidade do desenvolvimento organoide da pele (Figura 1A e Figura 2B).
      NOTA: Achate 2-4 SOs planares de cada OS cístico, dependendo de seu tamanho.
  2. Preparação de inserto revestido com colágeno (formato de 12 poços)
    1. Preparar uma solução de NaOH (1 M) dissolvendo a quantidade adequada de grânulos de NaOH em água destilada. Filtre e esterilize a solução de NaOH usando um filtro de membrana de tamanho de poro de 0,2 μm.
      NOTA: Use equipamento de proteção individual e trabalhe em uma área bem ventilada ao manipular a solução de NaOH (1 M).
    2. No gelo, dilua a solução de colágeno tipo I para uma concentração final de 2 mg / mL usando 10x PBS (para uma concentração final de 1x), NaOH (5 mM) e água destilada para ajustar o volume final. Distribua 150 μL da solução de colágeno em cada inserto colocado em uma placa padrão de 12 poços. Incube a placa a 37 °C por 30 min para permitir que o gel de colágeno polimerize.
  3. Achatamento do SO cístico (Figura 3)
    NOTA: Use um estereomicroscópio colocado sob um capuz LAF para esta etapa.
    1. Coloque o SO cístico selecionado com uma pequena quantidade de meio na tampa de uma placa de Petri de 10 cm usando uma pipeta P1000 de orifício largo. Extirpar cuidadosamente os subprodutos do SO utilizando um bisturi estéril. Use uma pinça estéril no lado oposto para estabilizar o organoide durante a excisão (Figura 3A).
      NOTA: Nesta fase, o SO cístico se assemelha a um balão vazio com duas camadas de pele posicionadas uma em cima da outra.
    2. Extirpar cerca de 1 mm das extremidades do organoide adjacente à primeira incisão com um bisturi (figura 3B,F). Desdobre suavemente a camada superior da pele usando uma pinça estéril (Figura 3C, G).
    3. Corte o pedaço de tecido em 2-4 pedaços, dependendo do tamanho. Transfira delicadamente cada pedaço de tecido e coloque-o em uma inserção revestida de colágeno com a epiderme voltada para cima, usando uma pinça estéril (Figura 3D, H).
      NOTA: Avalie os pinos sob um estereomicroscópio para garantir a orientação correta da epiderme.
    4. Transfira o inserto de volta para uma placa padrão de 12 poços contendo 600 μL de OMM. Coloque a placa de volta na incubadora a 37 ° C com 5% de CO2 ( Figura 3E ).
  4. Manutenção de cultura de interface ar-líquido de longo prazo
    1. Entre o dia 1 e o dia 21 após o achatamento, execute uma mudança média completa (600 μL) com OMM às segundas, quartas e sextas-feiras. Coloque a placa de volta na incubadora a 37 °C com 5% de CO2 e 95% de umidade relativa.
    2. Entre o dia 21 e o dia 27 após o achatamento, coloque a placa em uma incubadora a 37 °C com 5% de CO2 sem umidade para fortalecer a barreira cutânea. Realize uma troca completa do meio (800 μL) com OMM diariamente.

Resultados

A otimização e os pontos de verificação para a geração de SOs císticos foram amplamente descritos14. O método apresentado aqui, portanto, concentra-se nos principais pontos de verificação a serem avaliados durante o desenvolvimento de organoides císticos (Figura 2A), na seleção daqueles adequados para a transição para SOs planares (Figura 2B) e nos critérios usados para avaliar a qualidade dos SOs planares resultantes (Figura 1B-D e Figura 4).

O primeiro passo fundamental no desenvolvimento de SOs císticos é a formação de um agregado celular único e denso que incorpora a maioria das células presentes no poço no Dia 0 (Figura 2A). Isso é conseguido por meio do manuseio cuidadoso e rápido de hiPSCs, combinado com centrifugação eficiente, resultando em uma distribuição homogênea de células no centro do poço (Figura 2A, Dia -2). A indução adequada do ectoderma de superfície leva à formação de um epitélio fino e claro na camada mais externa do agregado no Dia 3 (Figura 2A), que subsequentemente se desenvolve, após a indução de células mesenquimais, em agregados císticos transparentes contendo um núcleo escuro de células mesenquimais no Dia 8. Entre os dias 12 e 20, o cisto epitelial fica coberto por uma fina camada de células mesenquimais que se acumulam em um pólo do cisto (Figura 2A, Dia 12). A co-indução bem-sucedida de células epiteliais e mesenquimais resulta em um epitélio estratificado, permitindo a formação de placódios e pinos capilares, que se tornam visíveis entre os dias 50 e 80 (Figura 2A, B). Ao selecionar SOs apropriados com base nesses pontos de verificação de desenvolvimento, a variabilidade morfológica e de tamanho pode ser minimizada no momento da transição para SOs planares.

A presença de placódios ou pinos de cabelo é o principal critério de inclusão para a seleção de SOs císticos para posterior desenvolvimento em SOs planares. A ausência de placódios visíveis geralmente resulta de um defeito na estratificação epidérmica, que então parece extremamente fina (Figura 2B, Dia 50, painel do meio). Para o achatamento, são utilizados apenas cistos grandes (pelo menos 5 mm de diâmetro) com subprodutos concentrados em um polo e subprodutos mínimos gerais, enquanto aqueles com subprodutos não polarizados são excluídos (Figura 2B).

Uma vez em sua configuração planar, a verificação primária da qualidade dos SOs depende do monitoramento macroscópico do crescimento de HF sob um estereomicroscópio. Os HFs se alongam progressivamente ao longo dos 27 dias de cultura de LPA, com as glândulas sebáceas tornando-se visíveis por volta do dia 14 e a pigmentação aumentando gradualmente ao longo do tempo (Figura 1B, C). Devido às restrições espaciais impostas pela membrana de inserção logo abaixo do fino gel de colágeno, apenas os HFs localizados na periferia do SO planar podem crescer totalmente, e o fazem em uma orientação paralela à inserção ( Figura 1C ). Notavelmente, a haste do cabelo raramente se projeta além da superfície da pele. Para avaliar melhor a qualidade dos SOs planares desenvolvidos, eles podem ser incluídos em parafina ou OCT, seccionados e corados para examinar sua composição e morfologia. A coloração H&E revela que sua estrutura se assemelha muito à da pele humana (Figura 4A), com um epitélio totalmente estratificado e uma derme separada por uma membrana basal. A coloração por imunofluorescência usando marcadores específicos para as diferentes camadas epidérmicas, glândulas sebáceas e melanócitos confirma ainda mais a arquitetura do tecido semelhante à pele humana dos SOs planares (Figura 1D e Figura 4B).

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Figura 1: Fluxo de trabalho para gerar SOs planares contendo HFs de hiPSCs usando um sistema de cultura ALI. A representação esquemática e as imagens representativas das principais etapas são mostradas. (A) Geração de SOs císticos, essencialmente como descrito anteriormente10, até que placódios / pinos de cabelo visíveis se formem por volta do dia 80. (B) Os SOs císticos são incisados e achatados, com o lado da epiderme voltado para cima, em uma inserção de cultura de células revestida de colágeno tipo I. As culturas de LPA são mantidas por 21 dias em condições umidificadas, seguidas de 6 dias em condições secas. (C) Vista de alta ampliação de uma região mostrada em (B), ilustrando o crescimento do folículo piloso, desenvolvimento da estrutura semelhante à glândula sebácea (pontas de setas) e pigmentação progressiva ao longo do tempo. (D) Imagens confocais de seções planares de SO no dia 27 após o achatamento, marcadas com anticorpo anti-colágeno tipo IV junto com vermelho do Nilo, que marca estruturas semelhantes a glândulas sebáceas, ou anticorpo anti-PMEL, que cora os melanócitos. Os núcleos são contracorados com DAPI. Barras de escala: 200 μm (A); 500 μm (B,C); 50 μm (D). Abreviaturas: SOs = organoides da pele; HFs = folículos pilosos; hiPSCs = células-tronco pluripotentes induzidas por humanos; ALI = interface ar-líquido; Col IV = colágeno tipo IV; PMEL = proteína pré-melassoma; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Imagens representativas da morfologia do agregado celular nas principais etapas durante a produção de SO. (A) Imagens representativas de SOs císticos com morfologias apropriadas (painéis esquerdo) e inadequadas (painéis médio e direito) em diferentes estágios. No Dia -2, os agregados celulares devem apresentar uma distribuição uniforme (painel esquerdo), enquanto o manuseio inadequado da placa após a centrifugação pode interromper a distribuição celular (painel direito). No Dia 0, agregados bem formados aparecem como aglomerados celulares compactos e densos (painel esquerdo), enquanto a baixa viabilidade celular resulta em morte celular generalizada e perda das estruturas 3D compactas (painel direito). No dia 3, uma camada epitelial externa distinta torna-se visível (painel esquerdo), sua ausência pode indicar que a concentração de BMP4 precisa de otimização (painel direito). No dia 12, as células mesenquimais se acumulam em um pólo e migram para envolver o cisto epitelial (painel esquerdo), enquanto a diferenciação epitelial excessiva (painel do meio) ou mesenquimal (painel direito) impede a estratificação epitelial adequada. No dia 50, os SOs exibem morfologia bipolar, com pele cística de um lado e subprodutos, predominantemente cartilagem, do outro (painel esquerdo). A diferenciação epitelial excessiva (painel médio) ou mesenquimal (painel direito) dificulta o desenvolvimento adequado da pele. (B) Imagens representativas de SOs císticos com grampos de cabelo visíveis por volta do dia 80. Observe a proporção variável de subprodutos (à esquerda para a curva tracejada) em relação à pele. Os três painéis mais à esquerda permitem a geração de 2-4 SOs planares, enquanto o painel mais à direita mostra um SO de qualidade insuficiente para achatamento. Barras de escala: 500 μm para o Dia -2, Dia 50 e Dia 80; 200 μm para o dia 0, dia 3 e dia 12. Abreviatura: SO = organoide da pele. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Representação esquemática das etapas técnicas para a produção de SOs planares. Realize o achatamento de SOs císticos sob um estereomicroscópio dentro de um capuz LAF. (A) Extirpar o poste que acumula subprodutos do SO cístico usando um bisturi estéril. (B) Apare as extremidades superior e inferior do SO para facilitar o desdobramento do tecido. (C) Corte o tecido planar em 2-4 pedaços. Transfira e alise cada peça, com o lado epidérmico para cima, em uma inserção revestida de colágeno usando uma pinça estéril. (D) Coloque o inserto de cultura contendo o tecido achatado em uma placa padrão de 12 poços contendo 600 μL de meio. (E) Incubar a placa a 37 °C com 5% de CO2. (F) Vista transversal esquemática do organoide da pele representado em (B). (G) Vista transversal esquemática do organoide da pele representado em (C). (H) Imagem de um SO planar colocado em um gel de colágeno tipo I derramado em um inserto de cultura de células posicionado em uma placa de 12 poços contendo 600 μL de meio. Abreviaturas: SO = organoide da pele; LAF = fluxo de ar laminar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Caracterização de SOs planares derivados de hiPSC. (A) Imagens representativas de campo claro de SO planar corado com H & E nos dias 1 e 27 após o achatamento. No dia 27, os SOs planares mostram maturação da pele com epiderme pluriestratificada e HFs contendo estruturas semelhantes a glândulas sebáceas (pontas de setas). (B) Imagens confocais de seções planares de SO coradas com integrina anti-β4 e anticorpos anti-queratina 10 ou anti-loricrina mostram diferenciação suprabasal precoce (células KRT10+ ) no Dia 1 e diferenciação tardia (camada LOR+ ) no Dia 27. Os núcleos são contracorados com DAPI. Barras de escala: 50 μm (A); 100 μm (B). Abreviaturas: SO = organoide da pele; hiPSC = célula-tronco pluripotente induzida por humanos; H&E = hematoxilina e eosina; β4 = integrina b4; KRT10 = queratina 10; LOR = loricrina; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O protocolo descrito aqui supera uma limitação fundamental do sistema cístico de SO, restaurando a orientação e o ambiente do tecido nativo por meio do achatamento do tecido e da exposição da epiderme apical ao ar. Este método preserva a complexidade celular e estrutural intrínseca do organoide, promove a organização fisiologicamente relevante e fornece acesso direto à superfície epidérmica pluriestratificada para manipulação experimental.

Várias etapas do protocolo são críticas para alcançar SOs planares de alta qualidade, começando com a geração de SOs císticos de alta qualidade. As principais verificações de controle de qualidade e possíveis pontos de modificação de protocolo foram amplamente descritos antes12. Resumidamente, o ponto de partida deve ser culturas hiPSC indiferenciadas e bem mantidas com 70-80% de confluência, exibindo células compactadas com uma alta proporção nuclear-citoplasmática. A geração de SOs císticos requer modulação precisa da sinalização BMP4 durante a indução do ectodermade superfície 12. Como a sensibilidade do BMP4 pode variar entre as linhas de hiPSC, a titulação pode ser necessária para obter os melhores resultados. Recomenda-se testar as concentrações de BMP4 entre 2,5 e 15 ng/mL, pois nenhum caso bem-sucedido foi relatado fora dessa faixa. A consistência na fonte do reagente também é importante; Portanto, os estoques a granel de um único fornecedor devem ser preparados e armazenados nas condições recomendadas e usados antes da data de validade para garantir a atividade biológica completa e minimizar a variabilidade.

A seleção de SOs císticos com morfologia e tamanho apropriados é crucial para o achatamento bem-sucedido do SO. A maturação dos SOs císticos e, consequentemente, a formação de pinos e placódios capilares podem variar entre as linhas de hiPSC, portanto, o momento do achatamento pode variar do dia 70 ao dia 90. A adição de CHIR99021, um inibidor de GSK3 e agonista de sinalização WNT, no dia 3 da formação de SO cístico pode ser considerada, pois demonstrou aumentar o tamanho do organoide e reduzir a formação de cartilagem, promovendo a proliferação e inibindo a migração da crista neural12. Apesar de promissor, não observamos resultados consistentes com essa modificação em nossas culturas.

O processo de achatamento requer destreza manual e familiaridade com o tecido. Notavelmente, durante a transferência do fragmento de pele para a inserção revestida, deve-se tomar cuidado para garantir a orientação correta do tecido. Recomenda-se verificar a orientação usando uma pinça fina sob um estereomicroscópio e ajustar suavemente o tecido até que o lado apical esteja voltado para cima. Quando posicionados corretamente, os pinos / placões de cabelo devem estar voltados para baixo. Após a transferência de SOs planares para a cultura ALI, os HFs geralmente começam a mostrar crescimento perceptível e pigmentação da haste capilar em poucos dias.

As principais limitações do modelo descrito são o tempo e o alto nível de manutenção exigido, e a imaturidade do modelo. O desenvolvimento de SOs císticos dotados de grampos de cabelo leva entre 70 a 90 dias e é seguido por 4 semanas de cultura de LPA. Esse cronograma estendido, combinado com um procedimento de achatamento trabalhoso, torna o sistema menos adequado para aplicações de alto rendimento, especialmente em comparação com os equivalentes de pele humana disponíveis comercialmente. Embora pequenas otimizações possam reduzir ligeiramente o tempo de cultivo, uma redução substancial é improvável. A alta diversidade celular e estrutural da pele depende de uma sequência complexa de interações epitelial-mesenquimais e pistas mecânicas, que provavelmente não podem ser aceleradas pela adição de fatores exógenos in vitro 15,16,17,18. A formação de SOs císticos e sua progressão para a forma planar requerem um alto nível de manutenção. Um dos períodos mais intensivos em manuseio - além dos primeiros 18 dias de cultura cística - ocorre quando os SOs planares são mantidos em uma atmosfera de baixa umidade e requerem reposição diária do meio. Semelhante a outros modelos derivados de hiPSC, os SOs retêm um fenótipo semelhante ao fetal in vitro. Além disso, as glândulas sudoríparas e os músculos eretores do pelo estão em grande parte ausentes nos SOs14, provavelmente devido à falta de vascularização, células imunes e forças mecânicas, como estresse de cisalhamento, alongamento e fricção - todos essenciais para a maturação adequada 15,16,17,18,19. Algumas dessas limitações podem ser resolvidas aumentando a complexidade do modelo. A co-cultura com macrófagos autólogos derivados de hiPSC17, a integração de um sistema de perfusão9 ou a aplicação de alongamento mecânico17 podem ajudar a promover a maturidade do modelo20,21.

Deve-se notar que o formato de inserção transwell restringe um pouco o crescimento descendente de HFs nos SOs planares. Como resultado, os HFs tendem a se espalhar lateralmente e podem ficar expostos ao ar. Como os HFs são normalmente protegidos dentro da pele in vivo, isso deve ser considerado ao projetar experimentos. Modificar o revestimento da pastilha aplicando uma camada de hidrogel mais espessa pode ajudar a mitigar esse problema. Além disso, os fios de cabelo raramente se projetam além da superfície da pele neste modelo. Nossas observações indicam que os HFs em SOs planares permanecem em anágena, a fase de crescimento ativo, até o dia 27 da cultura de LPA. Dada a duração prolongada do anágeno em HFs humanos, isso não é totalmente inesperado. Embora a cultura de longo prazo possa eventualmente apoiar a transição de fase, isso é improvável na ausência de pistas sistêmicas. Identificar e suplementar os sinais moleculares necessários para o ciclo folicular pode permitir a indução artificial das fases catágena e telógena.

Em resumo, o protocolo para gerar SOs planares permite uma ampla gama de abordagens experimentais que não são viáveis ou relevantes em OS císticos. Os SOs planares já foram usados com sucesso para modelar infecções bacterianas11 e virais22, danos teciduais induzidos por radiação ultravioleta22 e respostas medicamentosas associadas12 , 22 , 23 . A capacidade de acessar a superfície apical de um equivalente de pele complexo e fisiologicamente relevante representa um avanço substancial para o campo e abre as portas para uma variedade de novas aplicações na pesquisa da pele.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Agradecemos aos nossos colegas do hiPSC Hotel, Leiden University Medical Center, por fornecerem linhas hiPSC. Este trabalho foi apoiado pelo Centro de Medicina com Células-Tronco da Fundação Novo Nordisk, apoiado pela Fundação Novo Nordisk, Dinamarca (número de concessão NNF21CC0073729) para K.R. K.R. é Encarregada de Pesquisa no Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
DMEM/F12 AvançadoThermo Fisher Scientific#12634010referido como meio avançado no texto.
ALK5, inibidor. TGFb tipo 1, SB431542Tocris Biociências#1614Aliquot, armazene em -20 & deg; C e   mantenha a 4 graus; C por um máximo de 7 dias  
Anticorpo anticlonal monoclonal de rato Anti-CD104 439-9BBD em Biociências#555719NA
Anticorpo policlonal anticolágeno tipo IVMerckMillipore#Ab769NA
Anticorpo policlonal do coelho anti-citoqueratina 10Biolenda#905401NA
Anticorpo policlonal do coelho anti-loricirinaBiolenda#905101NA
Anticorpo monoclonal de camundongos anti-PMELNovus Biologicals#NBP2-29407 NA
Suplemento de B-27, Menos Vitamina AThermo Fisher Scientific#12587010Aliquot, armazene em -20 & deg; C 
Inserções de cultura celularGreiner Bio-one#66564112-poços, tamanho dos poros 0,4 & micro; m; transparente (48 inserts/caixa); https://shop.gbo.com/en/row/products/bioscience/3d-cell-culture/thincert/3d-thincert-cell-culture-inserts/665641.html
Colágeno Tipo ICorning#354249Mantenha a solução original em 4 graus; C
Bisturi descartável estéril 0507 Nº 21Swann Morton#0507NA
Dulbecco' s Soro Tamponado com Fosfato (DPBS)Thermo Fisher Scientific#14190094NA
Essencial 6 (E6) médioThermo Fisher Scientific#A1516401referido como meio mínimo hiPSC (hiMinM) e nbsp; no texto.
FasudilLC Labs#F-4660Aliquota uma solução 1000x de estoque e armazene a -20 °C. Depois de descongelar, mantenha a 4 graus; C por um máximo de 14 dias  
Dissociação de Células Suaves  ReagenteTecnologias Stemcell#100-0485NA
Suplemento GlutaMAXThermo Fisher Scientific#35050038NA
Grau básico de prenium FGF-2 humanoMiltenyi Biotec#130-093-842Aliquot, armazene em -80 °C; C e   mantenha a 4 graus; C por um máximo de 7 dias  
LDN 193189 diidrocloretoTocris#6053Aliquot, sensível à luz, armazene a -20 & deg; C 
Fator de crescimento Matrigel reduzida matriz de membrana basalCorning#354230Aliquot, armazene em -20 & deg; C e   mantenha a 4 graus; C por um máximo de 7 dias  
2-MercaptoetanolThermo Fisher Scientific#21985023Substância perigosa, tóxica, corrosiva, irritante, risco à saúde e ambiental.
NaOHMerck#567530-250MGSubstância perigosa, corrosiva e irritante. Prepare uma solução de forma espontânea.
Meio NeurobasalThermo Fisher Scientific#21103049referido como meio basal neural   no texto.
Normocin 50 mg/mlInvivogen#ant-nr-1referido como suplemento antibiótico-antimicoótico, no teste. Aliquot, armazene em -20 & deg; C e   mantenha a 4 graus; C por um máximo de 14 dias  
Microplaca Nunclon Sphera 96-Poço de FundoThermo Fisher Scientific#174929NA
Nunclon Sphera 174930 multidício de 24 poçosThermo Fisher Scientific#174930NA
Suplemento N2Thermo Fisher Scientific#17502048Aliquot, armazene em -20 & deg; C 
Agitador orbitalThermo Fisher Scientific#88881102NA
Penicilina-EstreptomicinaThermo Fisher Scientific#15070063NA
Proteína recombinante humana BMP4R& Sistemas D#314-BP-010Aliquot, armazene em -80 °C; C e   mantenha a 4 graus; C por um máximo de 7 dias  
StemFlex (SF) médioThermo Fisher Scientific#A3349401referido como meio de manutenção hiPSC (hiMM) e nbsp; no texto.
SteriMax smart - Esterilizador de Loop InfravermelhoWLD-TEC#4.002.000 Opcional
PinçasMerck#T4537-1EAEstilo 5; Aço inoxidável fino, afiado como agulha e antimagnético
VitronectinaTecnologias Stemcell#07180NA

Referências

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