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Artigo de método

Análise automatizada de imagens de fluorescência de C. elegans usando SegElegans

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DOI:

10.3791/69094

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10 de outubro de 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Basic Sciences, Faculty of Medicine, University of Crete, 2Institute of Molecular Biology and Biotechnology, Foundation for Research and Technology-Hellas, 3Instituto de Automática e Informática Industrial, Universitat Politècnica de València

Neste artigo

Resumo

Aqui, fornecemos instruções sobre como utilizar efetivamente o SegElegans, um sistema de aprendizado profundo que desenvolvemos para a segmentação automatizada de worms individuais em imagens de microscopia de campo amplo, para uso subsequente em software de análise de imagens, como o ImageJ. Fornecemos maneiras de usar o sistema online e offline.

Resumo

A microscopia, particularmente do tipo fluorescente, é uma ferramenta freqüentemente usada na pesquisa de C. elegans . A análise de dados de experimentos de microscopia pode, no entanto, ser bastante tediosa e demorada. Assim, a automação é desejável. Desenvolvemos o SegElegans, um sistema de rede neural convolucional baseado em U-net de duas cabeças projetado especificamente para a segmentação automatizada de vermes, mesmo em imagens com grande número de indivíduos tocando ou sobrepostos. A primeira parte do SegElegans consiste em um codificador e dois decodificadores. O encoder, baseado no modelo SmaAt AT, aplica camadas duplas de convolução seguidas por um Módulo de Atenção de Bloco Convolucional (CBAM). Ambos os decodificadores usam LSTMs convolucionais: um executa a segmentação semântica de imagens de worms (corpo, borda, plano de fundo ou sobreposição), enquanto o outro extrai um esqueleto linear ao longo de cada worm. A segunda parte é um algoritmo de pós-processamento que combina as saídas dos dois decodificadores e as usa para gerar segmentações de instância precisas. Essas segmentações podem ser alimentadas no ImageJ ou em outras ferramentas de análise de imagem apropriadas. Aqui apresentamos instruções sobre como acessar e executar este sistema. Fornecemos uma implementação on-line baseada em computação em nuvem, bem como dois métodos para usar os modelos SegElegans off-line, em uma máquina local, caso o hardware necessário esteja disponível.

Introdução

Caenorhabditis elegans é um organismo modelo eucariótico com ampla utilização nas áreas de biologia celular e molecular 1,2,3. É um pequeno verme nematóide do solo (~ 1 mm para adultos do tipo selvagem) com um ciclo de vida rápido (~ três semanas) e um grande número de descendentes (normalmente geneticamente idênticos ao pai hermafrodita autofecundante). Apesar de sua relativa simplicidade, o animal ainda é um organismo multicelular complexo, com tecidos e órgãos definidos e distintos, que, graças ao seu pequeno tamanho e transparência, podem ser estudados in vivo sem a necessidade de fixação ou outros tratamentos invasivos4. A capacidade do verme para estudo in vivo através de microscopia pode ser ainda mais amplificada através do uso de repórteres fluorescentes, que permitem a fácil distinção de células individuais ou mesmo a visualização direta de organelas/componentes subcelulares, como mitocôndrias, gotículas lipídicas ou agregados de proteínas, e de processos como transdução de sinal, expressão gênica, fusão de vesículas, autofagia, potenciais de ação neuronais e musculares, etc.5,6,7,8,9,10,11. Além disso, o nematóide também é altamente passível de manipulação genética por meio de mutagênese12, transgênese por microinjeção ou bombardeio de micropartículas13, edição CRISPR14 e, o mais importante, quando se trata de triagem genética fácil e econômica, RNAi15. Essa manipulação permite o estudo extensivo dos genes e seu papel no próprio nematóide, ao mesmo tempo em que, graças à significativa homologia genética que C. elegans exibe a outros organismos modelo, faz descobertas fundamentais com relevância até os humanos16,17. Finalmente, essa homologia/conservação também torna o verme um campo de testes inicial ideal para drogas e agentes químicos, permitindo a elucidação dos mecanismos de atividade da droga, a identificação de potenciais variações genéticas modificadoras da atividade e a descoberta de potenciais interações indesejadas e efeitos fora do alvo 18,19,20.

Todas as vantagens acima mencionadas tornaram C. elegans um modelo atraente para estudos de biologia celular e molecular, particularmente para cientistas interessados no monitoramento in vivo e muitas vezes em tempo real de processos via microscopia. Tais estudos geralmente envolvem uma quantidade significativa de análise de imagens por meio de software especial, sendo a opção mais amplamente utilizada o ImageJ 21,22,23. Uma característica comum da análise por meio de tais softwares é a necessidade de o usuário/pesquisador especificar Regiões de Interesse (ROIs) para análise por meio do uso de ferramentas de seleção. Com bastante frequência, cada verme individual em uma imagem será selecionado como seu próprio ROI, com o objetivo de adquirir informações por verme sobre características morfológicas simples (como dimensões do corpo) ou leituras experimentais mais "avançadas", como os níveis de expressão de um gene (medido com um repórter fluorescente), a leitura de um repórter raciométrico, o número e o tamanho das gotículas lipídicas, a formação de agregados proteicos, a morfologia de organelas individuais e suas redes, etc.5,8,10,24,25,26,27. Essas seleções por verme são normalmente feitas manualmente, uma vez que os métodos de seleção automática baseados em algoritmos de processamento de imagem padrão geralmente não são capazes o suficiente para distinguir as formas e características do verme, especialmente em imagens de campo escuro onde os contornos dos vermes não são claramente visíveis ou em imagens de campo claro com um número significativo de animais que se tocam e se sobrepõem. O processo manual é, no entanto, lento (20 s a 1 min por worm, dependendo da precisão necessária e da experiência do usuário), trabalhoso e sujeito a vieses e erros do usuário.

Uma abordagem alternativa e muito mais poderosa para a geração de ROIs individuais de C. elegans (uma tarefa normalmente chamada de segmentação no campo da visão computacional) é automatizá-la com a ajuda de técnicas de aprendizado profundo/redes neurais. Redes neurais convolucionais baseadas principalmente nas arquiteturas Mask R-CNN28 e U-net29 produziram resultados decentes em tarefas de segmentação em vários sistemas de modelos biológicos 30,31,32 incluindo em C. elegans33,34,35,36,37,38,39, mas nenhum forneceu uma solução satisfatória para o problema de gerar segmentações de corpo inteiro que distinguem corretamente animais individuais (segmentação de instância) em imagens de alta resolução com grande número de vermes tocando ou sobrepostos. Para atender a essa necessidade, desenvolvemos o SegElegans, um modelo de aprendizado profundo projetado e otimizado especificamente para essa tarefa40.

SegElegans é composto por duas partes principais (Figura 1). A primeira parte é uma rede neural convolucional variante U-net de duas cabeças. É composto por um bloco codificador e dois blocos decodificadores. O bloco codificador é baseado no modelo SmaAt AT41 e usa blocos de convolução dupla para cada camada que alimenta um Módulo de Atenção de Bloco Convolucional (CBAM) 42 . Os dois blocos decodificadores são baseados na rede convolucional de memória de longo prazo e curto (LSTM)43. Um decodificador é responsável por categorizar cada pixel das imagens como parte do corpo principal de um worm, uma parte da borda de um worm, uma parte do plano de fundo ou uma parte de uma área onde os worms se sobrepõem (isso é normalmente chamado de segmentação semântica). O outro decodificador é responsável por desenhar um "esqueleto" linear ao longo do comprimento de cada verme. A segunda parte é um algoritmo de pós-processamento que combina as saídas dos dois decodificadores e as usa para gerar segmentações de instância precisas. Inicialmente, ele identifica os segmentos de sobreposições verdadeiras comparando a saída da segmentação semântica com a do esqueleto. Em seguida, ele gera a segmentação da instância diretamente para worms sem sobreposições ou montando-a a partir de segmentos para os sobrepostos40. Essas segmentações são salvas como máscaras binárias, bem como ROIs compatíveis com ImageJ.

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Protocolo

As seções a seguir incluem instruções detalhadas sobre como fazer uso eficaz de SegElegans (Figura 2). Eles incluem instruções sobre aquisição de imagem preparatória (Seção 1), como executar o modelo online (Seção 2) ou offline (Seções 3-5) e a importação de ROIs para o ImageJ ou outras ferramentas (Seção 6). Como a avaliação de imagens por meio do modelo requer um PC com uma Unidade de Processamento Gráfico (GPU) compatível com CUDA que tenha pelo menos 6 GB (idealmente mais) de memória de acesso aleatório (VRAM) de vídeo, a maioria dos usuários (desde que tenham acesso aos serviços do Google) são aconselhados a utilizar a versão on-line do modelo que satisfaz e supera esses requisitos de hardware por meio da computação em nuvem (Seção 1 > Seção 2 > Seção 6). Como alternativa, os usuários que têm acesso a hardware adequadamente poderoso e uma compreensão básica do uso de linha de comando/terminal (ou usuários que não têm acesso às opções de computação em nuvem mencionadas acima) podem achar a execução do modelo localmente mais conveniente (Seção 1 > Seção 3 > Seção 4 ou 5 > Seção 6).

1. Aquisição de amostras e imagens de guia

  1. Use SegElegans para adquirir segmentações de vermes adultos de qualquer cepa de verme, independentemente de quais repórteres fluorescentes eles possam ou não expressar. Se o(s) fenótipo(s)/dados de interesse forem medidos em imagens de campo claro, adquira-os normalmente usando um microscópio de campo amplo e software compatível, usando uma lente objetiva 4x ou similar.
    NOTA: SegElegans podem analisar imagens com uma ampla gama de brilho e contraste, embora seja preferível que não haja pixels claros ou escuros saturados. Em relação às dimensões, o sistema foi treinado com imagens de 1328 x 1048, mas deve funcionar com qualquer imagem que tenha pelo menos 512x512 de tamanho.
  2. Se o(s) fenótipo(s)/dados de interesse forem medidos em imagens de campo escuro (típico ao usar um ou mais repórteres ou corantes fluorescentes transgênicos), adquira imagens de campo claro ao lado dos dados a serem usados como imagens guia (conforme explicado na etapa 1.1). Certifique-se de que as imagens-guia correspondam perfeitamente às imagens de campo escuro do(s) canal(is) de fluorescência espacialmente e o mais próximo possível no tempo, de preferência usando as opções de aquisição multicanal fornecidas pelo software operacional do microscópio. Salve as imagens-guia em uma pasta separada das imagens de dados de campo escuro correspondentes, usando o mesmo nome para ambas.

2. Executando a versão online do SegElegans

  1. Faça login em uma conta do Google em um navegador da web. Recomenda-se a criação de uma nova conta de laboratório dedicada para essa finalidade.
  2. Entre no Google Drive (https://drive.google.com) e carregue a pasta com as imagens de campo claro (dados ou guia). Como mencionado anteriormente, se as imagens-guia forem usadas para gerar ROIs para imagens de campo escuro, não inclua essas imagens de dados de campo escuro nesta pasta.
  3. Vá para https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOnline/tree/v1.0 e clique no arquivo SegElegans Body Prediction Interface.ipynb . Clique no botão Abrir no Colab na parte superior do arquivo que é aberto. O notebook/interface Jupyter para SegElegans será aberto no Google Colab.
  4. Execute o bloco de código 1 pressionando o botão play (figure-protocol-1) abaixo do título. Conceda permissão ao runtime para executar o código e observe a saída após o término da execução (uma marca de seleção verde aparece ao lado do botão reproduzir). O Colab deve executar automaticamente o tempo de execução correto e compatível com CUDA e exibir uma tabela de saída NVIDIA-SMI. Caso contrário, force o uso de um runtime de GPU T4 por meio do menu Runtime > Change runtime type .
  5. Execute o bloco de código 2 para carregar o conteúdo do Google Drive no ambiente de execução. Aceite todas as caixas de diálogo de confirmação e conceda todas as permissões solicitadas.
  6. Execute os blocos de código 3 e 4. O bloco 3 levará alguns minutos para ser concluído, portanto, certifique-se de que a marca de seleção verde tenha aparecido antes de prosseguir para o 4.
  7. Abra o ícone com a guia de pasta à esquerda da interface do Colab. Isso exibirá os arquivos carregados no ambiente de execução, incluindo o conteúdo importado do Drive como /content/drive/MyDrive. Clique com o botão direito do mouse na pasta com as imagens, copie o caminho e cole-o na forma de entrada test_images do bloco de código 5. Certifique-se de que tenha a seguinte aparência: /content/drive/MyDrive/Imagefolder. Da mesma forma, especifique um caminho para a saída da análise (por exemplo, /content/drive/MyDrive/Imagefolder/Output). Observe que os caminhos nesse ambiente usam uma barra para separar pastas (/).
  8. Execute o bloco de código 5.
  9. Especifique a extensão exata das imagens a serem analisadas pelo modelo na forma fornecida do bloco de código 6. Para efeitos da presente entrada, ".tif", ". TIF" e ".tiff" são tratados como extensões diferentes.
  10. Não ajuste a entrada batch_crop_img no bloco de código 6 se o sistema estiver sendo executado no tempo de execução padrão da GPU T4 (que é fornecido gratuitamente a todos os usuários por um número limitado de horas por dia, dependendo dos níveis de uso). Reduza-o se o tempo de execução gerar problemas de disponibilidade de memória.
  11. Execute o bloco de código 6. Isso levará algum tempo, portanto, certifique-se de que a marca de seleção verde tenha aparecido antes de prosseguir.
  12. Execute o bloco de código 7. Não ajuste suas entradas para o runtime T4 padrão, mas reduza o número de subprocessos ou desabilite completamente o processamento paralelo se surgirem problemas de disponibilidade de memória. Isso também levará um tempo significativo.
  13. Acesse o Google Drive em uma janela ou guia diferente do navegador e navegue até a pasta de saída designada em 2.7.
    NOTA: Neste ponto, SegElegans concluiu a avaliação inicial e o pós-processamento das segmentações e criou várias subpastas com saídas. 0_summary resultados contêm gráficos resumindo a saída de cada imagem, com um número de índice atribuído a cada worm. 1_complete_mask contém as máscaras binárias selecionadas para todas as segmentações que o algoritmo decidiu serem boas para análise. 1_edge_small_mask contém máscaras binárias para todas as segmentações que o algoritmo decidiu rejeitar porque os animais são muito pequenos ou parcialmente obscurecidos na borda da imagem. 1_overlap_mask contém máscaras binárias para todas as segmentações de worms que exibiram sobreposições reais e, por padrão, não são adicionadas à saída selecionada. 1_all_rois_results contém as segmentações de TODOS os 3 tipos, independentemente da curadoria, no formato ImageJ (arquivos zip com ROIs).
  14. Neste ponto, escolha uma das três opções:
    1. Use os ROIs fornecidos no 1_all_rois_results no ImageJ e rejeite ROIs indesejados após a importação para lá (consulte a seção 6 do protocolo).
    2. Aceite as boas máscaras selecionadas sem qualquer correção manual (e sem a inclusão de vermes sobrepostos) (pule para 2.16).
    3. Ajuste manualmente a curadoria selecionando os worms (incluindo os sobrepostos) a serem incluídos na saída (continue para 2.15).
  15. Para ajustar manualmente a curadoria, use o bloco de código 8. Examine os resultados da curadoria inicial dos gráficos de resumo na pasta 0_summary resultados . Para cada imagem que precisa de correção, insira o nome completo (com extensão) da imagem de entrada original na forma "name_image_change" e os números das máscaras a serem mantidas (do gráfico de resumo), separados por vírgulas na forma "index_images". Execute o bloco de código 8. Repita esta etapa para qualquer outra imagem que precise de correção.
  16. Após a correção ou se os usuários optarem por aceitar a curadoria inicial sem correções (e sem os worms sobrepostos), execute o bloco de código 9. Uma nova subpasta será criada na pasta de saídas no Google Drive chamada 2_curated_rois_results. Ele inclui todas as segmentações finais selecionadas no formato ImageJ (arquivos zip com ROIs).
  17. Para executar o processo novamente para uma pasta diferente de imagens, reinicie o tempo de execução através do menu Tempo de execução > Reiniciar sessão e comece do início.

3. Preparando a versão offline do SegElegans antes do primeiro uso

  1. Como alternativa à execução do SegElegans online no Colab, uma versão offline do SegElegans está disponível para usuários que não podem ou preferem não usar os serviços de computação em nuvem do Google. Isso requer um PC (Windows ou Linux) com uma GPU compatível com CUDA (https://developer.nvidia.com/cuda-gpus) que tenha pelo menos 6 GB de VRAM (embora 16 seja recomendado, se disponível e acessível).
    NOTA: As instruções a seguir nas seções 3-5 estão focadas no Windows, mas o software também pode ser executado em sistemas baseados em Linux com algumas pequenas alterações nos comandos usados.
  2. Baixe o instalador do kit de ferramentas CUDA de https://developer.nvidia.com/cuda-downloads seguindo as instruções para obter a versão apropriada para o dispositivo usado.
    NOTA: O SegElegans foi testado com as versões 12.9 e 13.0 do kit de ferramentas e CUDA versão 11 no Windows, no entanto, espera-se que as versões futuras mantenham a compatibilidade com versões anteriores.
    1. Instale o kit de ferramentas, seguindo as instruções do próprio instalador. O Visual Studio não é necessário.
  3. Baixe a versão apropriada do instalador do Python para o dispositivo no https://www.python.org/downloads/. Instale o Python, seguindo as instruções do próprio instalador e garantindo python.exe seja adicionado ao PATH.
    NOTA: O SegElegans foi construído e testado no Python 3.13, mas espera-se que as versões futuras mantenham a compatibilidade com versões anteriores.
  4. Vá para https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOffline/releases/tag/v1 . Clique no link Código-fonte (zip) para baixar o pacote com os arquivos necessários para configurar e executar o SegElegans localmente.
  5. Extraia o arquivo zip. Coloque-o em uma pasta de nível alto ou até superior, como C:\SegElegans. O conteúdo do arquivo zip já vem dentro de uma subpasta SegElegansOffline-1.
  6. Abra o prompt de comando do Windows (cmd.exe). Digite o comando python -m venv "fullsegeleganspath" onde "fullsegeleganspath" é o caminho completo, entre aspas, na subpasta SegElegansOffline-1 .
    NOTA: Por exemplo, se o arquivo zip foi extraído em C:\SegElegans, o caminho completo é C:\SegElegans\SegElegansOffline-1 e o comando será python -m venv "C:\SegElegans\SegElegansOffline-1" . Observe que os caminhos nesse ambiente usam uma barra invertida para separar pastas ("\").
  7. No prompt de comando, use controles padrão para navegar dentro da pasta SegElegansOffline-1 e execute o comando Scripts\activate. Um rótulo (SegElegansOffline-1) deve aparecer antes do próximo cursor de prompt, indicando que o ambiente Python agora está ativo.
  8. Enquanto estiver dentro do ambiente ativo (SegElegansOffline-1), execute o comando pip install -r requirements.txt . O processo levará algum tempo.
  9. Insira e execute o comando python assemblenetworks.py .
    NOTA: SegElegans agora está pronto para ser executado. Duas maneiras de conseguir isso são fornecidas: um script rápido que fornecerá automaticamente todas as segmentações como ROIs do ImageJ sem a opção de corrigir manualmente a curadoria (seção 4) e um bloco de anotações Jupyter local que fornecerá a opção de visão geral e corrigir a curadoria (seção 5). A última abordagem é recomendada para a maioria dos usuários.

4. Executando a versão offline do SegElegans com um script rápido

  1. Abra o prompt de comando do Windows (cmd.exe). Conforme descrito na etapa 3.7, navegue até a pasta de ambiente SegElegans e ative-a.
  2. Para usar o script rápido, enquanto estiver no prompt de comando com o ambiente ativo (SegElegansOffline-1) insira e execute o comando python SegElegansBodyQuickEval.py -i "pathtoinputfolder" -x onde "pathtoinputfolder" é o caminho completo, entre aspas, para a pasta com as imagens de campo claro (por exemplo, "D:\Data\Experiment12365\Condition 1") e é a extensão de arquivo precisa das imagens que os usuários desejam analisar (Exemplo ". TIF"). Digite o comando python SegElegansBodyQuickEval.py -h para obter instruções sobre parâmetros adicionais que podem ser alterados para acelerar o processamento pelo script se o dispositivo puder lidar com isso.
    NOTA: A pasta de saída, neste caso, será criada dentro da pasta de entrada (portanto, para o exemplo acima: "D:\Data\Experiment12365\Condition 1\Output"). Dentro, há uma série de subpastas. 0_summary resultados contêm gráficos resumindo a saída de cada imagem, com um número de índice atribuído a cada worm. 1_complete_mask contém as máscaras binárias selecionadas para todas as segmentações não sobrepostas que o algoritmo decidiu serem boas para análise. 1_edge_small_mask contém máscaras binárias para todas as segmentações que o algoritmo decidiu rejeitar porque os animais são muito pequenos ou parcialmente obscurecidos na borda da imagem. 1_overlap_mask contém máscaras binárias para todas as segmentações de vermes que exibiram sobreposições reais. 1_all_rois_results contém as segmentações de TODOS os 3 tipos, independentemente da curadoria, no formato ImageJ (arquivos zip com ROIs). Como não há como corrigir manualmente a curadoria aqui, 2_curated_rois_results inclui por padrão todas as segmentações consideradas boas pelo algoritmo E todas as segmentações sobrepostas no formato ImageJ (arquivos zip com ROIs).

5. Executando a versão offline do SegElegans com um notebook Jupyter

  1. Abra o prompt de comando do Windows (cmd.exe). Conforme descrito na etapa 3.7, navegue até a pasta de ambiente SegElegans e ative-a.
  2. Para usar a interface Jupyter, enquanto estiver no prompt de comando com o ambiente ativo (SegElegansOffline-1), insira e execute o comando jupyter notebook. Isso abrirá uma janela/guia do navegador da Web com um site hospedado localmente. Na primeira tela, selecione o arquivo SegElegansOfflineJupyterInterface.ipynb.
  3. Execute o código no bloco de código 1 selecionando-o (clique à esquerda fora do código real) e pressionando o botão play (figure-protocol-2) na barra de ferramentas acima. Uma mensagem de confirmação aparecerá abaixo do bloco de código quando a execução for concluída.
  4. Execute o bloco de código 2. Isso gerará alguns formulários de entrada na leitura abaixo do bloco de código. Preencha os formulários gerados com o caminho para a pasta de entrada com as imagens de campo claro (Exemplo: "D:\Data\Experiment12365\Condition 1"), o caminho desejado para a saída da análise (Exemplo: "D:\Data\Experiment12365\Condition 1\Output") e a extensão precisa do arquivo das imagens a serem analisadas (Exemplo". TIF"). Ajuste as configurações adicionais fornecidas (aumente o número de subculturas por lote para 9 ou 16 e execute vários processos paralelos de pós-processamento) se o dispositivo for suficientemente capaz.
  5. Execute o bloco de código 3.
  6. Execute o bloco de código 4. Isso levará algum tempo, portanto, certifique-se de que esteja completo antes de prosseguir.
  7. Execute o bloco de código 5. Novamente, isso levará algum tempo. Depois disso, navegue até a pasta de saída designada acima.
    NOTA: Neste ponto, SegElegans concluiu a avaliação inicial e o pós-processamento das segmentações e criou várias subpastas com saídas. 0_summary resultados contêm gráficos resumindo a saída de cada imagem, com um número de índice atribuído a cada worm. 1_complete_mask contém as máscaras binárias selecionadas para todas as segmentações que o algoritmo decidiu serem boas para análise. 1_edge_small_mask contém máscaras binárias para todas as segmentações que o algoritmo decidiu rejeitar porque os animais são muito pequenos ou parcialmente obscurecidos na borda da imagem. 1_overlap_mask contém máscaras binárias para todas as segmentações de worms que exibiram sobreposições reais e, por padrão, não são adicionadas à saída selecionada. 1_all_rois_results contém as segmentações de TODOS os 3 tipos, independentemente da curadoria, no formato ImageJ (arquivos zip com ROIs).
  8. Semelhante à versão online do SegElegans, use qualquer uma das três opções listadas abaixo:
    1. Use os ROIs fornecidos no 1_all_rois_results no ImageJ e rejeite ROIs indesejados após a importação (consulte a seção 6 do protocolo).
    2. Aceite as boas máscaras selecionadas automaticamente sem qualquer correção manual (e sem a inclusão de vermes sobrepostos) (pule para a etapa 5.11).
    3. Ajuste manualmente a curadoria selecionando os worms (incluindo os sobrepostos) a serem incluídos na saída (continue na etapa 5.9).
  9. Para ajustar manualmente a curadoria, use os blocos de código 6 e 7. Primeira execução 6. Isso criará formulários de entrada na leitura abaixo do código.
  10. Examine os resultados da curadoria inicial dos gráficos de resumo na subpasta 0_summary resultados . Para cada imagem que precisa de correção, insira o nome completo da imagem INPUT (com extensão) no formulário Image to correct: e os números das máscaras a serem mantidas (do gráfico de resumo) separados por vírgulas no formulário Masks to keep:. Execute o bloco de código 7 e verifique se a execução foi concluída. Repita esta etapa para qualquer outra imagem que precise de correção.
  11. Depois que a correção de curadoria for feita ou se os usuários optarem por aceitar a curadoria inicial sem correções (e sem os worms sobrepostos), execute o bloco de código 8. Uma nova subpasta será criada na pasta de saídas designada chamada 2_curated_rois_results. Ele inclui todas as segmentações finais selecionadas no formato ImageJ (arquivos zip com ROIs).
  12. Para executar o processo novamente para uma pasta diferente de imagens, reinicie o tempo de execução através do menu Kernel > Reinicie o kernel e limpe as saídas de todas as células e comece do início.

6. Importando as segmentações para o ImageJ (ou alternativas)

  1. Abra uma das imagens de dados reais no ImageJ.
  2. Abra o arquivo zip correspondente com os ROIs dessa imagem. Isso carregará as seleções no gerenciador de ROI do ImageJ. Se forem ROIs da saída 2_curated_rois_results , eles estão prontos para análise com os métodos desejados normalmente usados (de preferência com o uso de macros para automatizar e acelerar ainda mais o processo).
  3. Se forem ROIs da saída 1_all_rois_results , remova segmentações indesejadas do gerenciador de ROI. Selecione-os e pressione o botão Excluir na própria janela do gerenciador. Não pressione a tecla Delete no teclado, pois isso exclui o conteúdo da seleção na imagem.
  4. Se for necessário um software diferente do ImageJ para a análise, o formato ROI provavelmente não será compatível. Nesse caso, importe segmentações na forma universalmente utilizada de máscaras binárias, que são fornecidas nas pastas 1_complete_mask e 1_overlap_mask . Consulte as instruções do software receptor sobre como realizar essa importação.

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Resultados

Seguindo este protocolo, os pesquisadores devem ser capazes de extrair segmentações de vermes de alta qualidade, mesmo para a análise de imagens de fluorescência sem bordas visíveis de vermes. Conforme discutido na seção 6 do protocolo, essas segmentações podem ser importadas diretamente para o ImageJ e usadas para a medição rápida de propriedades relevantes, como a intensidade de repórteres fluorescentes (comumente usados para quantificação de expressão) ou o número, tamanho e morfologi...

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Discussão

A metodologia apresentada aqui deve permitir que os usuários analisem experimentos de microscopia de C. elegans em um período de tempo significativamente mais rápido, sem qualquer perda de precisão. Uma vez que extrai segmentações de imagens guia de campo claro independentemente da fluorescência real (conforme discutido na seção 1 do protocolo), ele pode ser usado com qualquer cepa e para qualquer aplicação que exija a medição de fenótipos por verme. Isso pode incluir aplicações...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

O trabalho no laboratório dos autores é financiado pela Secretaria Geral de
Investigação e Inovação do Ministério do Desenvolvimento da Grécia,
União Europeia - NextGenerationEU (código do projeto: TAEDR-0535850, acrónimo:
BrainPrecision) no âmbito da Ação "Ações emblemáticas em matéria de
Áreas Científicas Interdisciplinares com Especial Interesse em Conexão
ao Tecido Produtivo", no âmbito da Recuperação e Resiliência Nacionais
Plano «Grécia 2.0», Agência de Execução para a Investigação da Comissão Europeia
Centro de Excelência "CHAngeing" (GA-101087071) e a Fundação Helénica
para a Investigação e Inovação (H.F.R.I.) no âmbito da "1ª Convocatória para a H.F.R.I.
Projetos de Investigação de apoio a docentes e investigadores e ao
aquisição de equipamento de investigação de alto custo" (Número do Projeto:
HFRI-FM17C3-0869, NeuroMitofagia).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Computador com acesso à internet (exemplo: Dell Vostro Desktop)Vários (Dell, por exemplo) -Isso permitirá rodar SegElegans online via computação em nuvem conforme recomendado e usando softwares de análise de imagem como o ImageJ.
Unidade de Processamento Gráfico compatível com CUDA com pelo menos 6 GB de VRAM (exemplo: MSI Geforce RTX  RTX3050 Ventus 2X 6GB) (Opcional)NVIDIA + vários fabricantes (Micro Star International, por exemplo)https://developer.nvidia.com/cuda-gpusIsso permitirá rodar SegElegans offline em uma máquina local.
chipsets de GPU compatíveis com CUDA podem ser encontrados aqui:
https://developer.nvidia.com/cuda-gpus
A VRAM depende da implementação real do chipset em uma GPU pelo fabricante.
AVISO: Você precisará de uma placa CUDA cara e poderosa muito além dos requisitos mínimos (16+ GB de VRAM) para igualar o desempenho alcançado pela versão de computação em nuvem.
Microscópio de Epifluorescência (Invitrogen EVOS FL Auto 2)ThermoFisher Scientific AMAFD2000, por exemploRecomendamos o uso de um sistema que possa adquirir automaticamente imagens tanto de campo claro quanto de um ou mais canais de fluorescência quase simultaneamente.
ImageJ (Opcional)NIHhttps://imagej.net/software/fiji/downloadsRecomendamos a distribuição de Fiji, disponível aqui:
https://imagej.net/software/fiji/downloads
PC com compatibilidade com GPU NVIDIA (exemplo: Dell Vostro Desktop) (Opcional) Vários (Dell, por exemplo) -Isso é necessário em conjunto com a GPU para rodar SegElegans offline em uma máquina local.
Uma GPU exigirá hardware compatível com Windows com os slots PCI apropriados na placa-mãe, espaço para acomodar a placa e uma fonte de alimentação suficientemente potente.
SegElegans-https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOnline/tree/v1.0 Veja o manuscrito para instruções completas.

Referências

  1. Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nat Rev Drug Discov. 5 (5), 387-398 (2006).
  2. Markaki, M., Tavernarakis, N. Caenorhabditis elegans as a model system for human diseases. Curr Opin Biotechnol. 63, 118-125 (2020).
  3. Zuryn, S. C. elegans as a model for health and disease. Semin Cell Dev Biol. 154 (Pt A), 1-3 (2024).
  4. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
  5. Kerr, R. A. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. , 1-13 (2006).
  6. Feinberg, E. H., et al. GFP reconstitution across synaptic partners (GRASP) defines cell contacts and synapses in living nervous systems. Neuron. 57 (3), 353-363 (2008).
  7. Hammarlund, M., Jin, Y. Axon regeneration in C. elegans. Curr Opin Neurobiol. 27, 199-207 (2014).
  8. Daniele, J. R., et al. UPR(ER) promotes lipophagy independent of chaperones to extend life span. Sci Adv. 6 (1), eaaz1441(2020).
  9. Yemini, E., et al. NeuroPAL: A multicolor atlas for whole-brain neuronal identification in C. elegans. Cell. 184 (1), 272-288.e11 (2021).
  10. Sinnige, T., et al. Kinetic analysis reveals that independent nucleation events determine the progression of polyglutamine aggregation in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (11), e2021888118(2021).
  11. Gkikas, I., Daskalaki, I., Kounakis, K., Tavernarakis, N., Lionaki, E. MitoSNARE assembly and disassembly factors regulate basal autophagy and aging in C. elegans. Int J Mol Sci. 24 (4), 4230(2023).
  12. Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook. , 1-26 (2014).
  13. Praitis, V., Maduro, M. F. Transgenesis in C. elegans. Methods Cell Biol. 106, 161-185 (2011).
  14. Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. CRISPR-Cas9-guided genome engineering in Caenorhabditis elegans. Curr Protoc Mol Biol. 129 (1), e106(2019).
  15. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  16. Lai, C. H., Chou, C. Y., Ch'ang, L. Y., Liu, C. S., Lin, W. Identification of novel human genes evolutionarily conserved in Caenorhabditis elegans by comparative proteomics. Genome Res. 10 (5), 703-713 (2000).
  17. Kuwabara, P. E., O'Neil, N. The use of functional genomics in C. elegans for studying human development and disease. J Inherit Metab Dis. 24 (2), 127-138 (2001).
  18. Ranganathan, R., Sawin, E. R., Trent, C., Horvitz, H. R. Mutations in the Caenorhabditis elegans serotonin reuptake transporter MOD-5 reveal serotonin-dependent and -independent activities of fluoxetine. J Neurosci. 21 (16), 5871-5884 (2001).
  19. Lackner, M. R., et al. Chemical genetics identifies Rab geranylgeranyl transferase as an apoptotic target of farnesyl transferase inhibitors. Cancer Cell. 7 (4), 325-336 (2005).
  20. Yoon, S., et al. Microfluidics in high-throughput drug screening: Organ-on-a-chip and C. elegans-based innovations. Biosensors (Basel). 14 (1), 55(2024).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Mol Reprod Dev. 82 (7-8), 518-529 (2015).
  23. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).
  24. Valente, A. J., Maddalena, L. A., Robb, E. L., Moradi, F., Stuart, J. A. A simple ImageJ macro tool for analyzing mitochondrial network morphology in mammalian cell culture. Acta Histochem. 119 (3), 315-326 (2017).
  25. Ramki, K., Thiruppathi, G., Ramasamy, S. K., Sundararaj, P., Sakthivel, P. An aggregation-induced emission-based ratiometric fluorescent chemosensor for Hg(II) and its application in Caenorhabditis elegans imaging. Methods. 221, 1-11 (2024).
  26. Boulin, T., Etchberger, J. F., Hobert, O. Reporter gene fusions. WormBook. , 1-23 (2006).
  27. Braeckman, B. P., Smolders, A., Back, P., De Henau, S. In vivo detection of reactive oxygen species and redox status in Caenorhabditis elegans. Antioxid Redox Signal. 25 (10), 577-592 (2016).
  28. He, K., Gkioxari, G., Dollár, P., Girshick, R. Mask R-CNN. arXiv. , (2017).
  29. Ronneberger, O., Fischer, P., Brox, T. U-Net: Convolutional networks for biomedical image segmentation. arXiv. , (2015).
  30. Exploring deep learning architectures in NAECON 2018. Proc IEEE NAECON. Alom, M. Z., Yakopcic, C., Taha, T. M., Asari, V. K. IEEE National Aerospace and Electronics Conference, , 228-233 (2018).
  31. Micallef, N., Seychell, D., Bajada, C. J. Exploring the U-Net++ model for automatic brain tumor segmentation. IEEE Access. 9, 125523-125539 (2021).
  32. Plebani, E., et al. High-throughput segmentation of unmyelinated axons by deep learning. Sci Rep. 12 (1), 1198(2022).
  33. Fudickar, S., Nustede, E. J., Dreyer, E., Bornhorst, J. Mask R-CNN based C. elegans detection with a DIY microscope. Biosensors (Basel). 11 (8), 257(2021).
  34. Lalit, M., Tomancak, P., Jug, F. EmbedSeg: Embedding-based instance segmentation for biomedical microscopy data. Med Image Anal. 81, 102523(2022).
  35. Layana Castro, P. E., Garvi, A. G., Sanchez-Salmeron, A. J. Automatic segmentation of Caenorhabditis elegans skeletons in worm aggregations using improved U-Net in low-resolution image sequences. Heliyon. 9 (4), e14715(2023).
  36. A convolutional neural network model for worm imaging in 2020. Proc IEEE ISBI. Chen, L., et al. IEEE 17th International Symposium on Biomedical Imaging (ISBI), , 508-512 (2020).
  37. Guan, G., et al. Cell lineage-resolved embryonic morphological map reveals signaling associated with cell fate and size asymmetry. Nat Commun. 16 (1), 3700(2025).
  38. Cao, J., et al. Establishment of a morphological atlas of the Caenorhabditis elegans embryo using deep-learning-based 4D segmentation. Nat Commun. 11 (1), 6254(2020).
  39. Zhao, C., et al. EmbSAM: Cell boundary localization and Segment Anything Model for fast images of developing embryos. bioRxiv. , (2024).
  40. Castro, P. E. L., et al. SegElegans: Instance segmentation using dual convolutional recurrent neural network decoder in Caenorhabditis elegans microscopic images. Comput Biol Med. 190, 110012(2025).
  41. Trebing, K., Stańczyk, T., Mehrkanoon, S. SmaAt-UNet: Precipitation nowcasting using a small attention-UNet architecture. Pattern Recognit Lett. 145, 178-186 (2021).
  42. Woo, S., Park, J., Lee, J. Y., Kweon, I. S. CBAM: Convolutional block attention module. arXiv. , (2018).
  43. Shi, X., et al. Convolutional LSTM network: A machine learning approach for precipitation nowcasting. arXiv. , (2015).
  44. Stuhr, N. L., et al. Rapid lipid quantification in Caenorhabditis elegans by Oil Red O and Nile Red staining. Bio Protoc. 12 (5), e4340(2022).
  45. Kuzmic, M., et al. In situ visualization of carbonylation and its co-localization with proteins, lipids, DNA and RNA in Caenorhabditis elegans. Free Radic Biol Med. 101, 465-474 (2016).
  46. Fang, E. F., et al. In vitro and in vivo detection of mitophagy in human cells, C. elegans, and mice. J Vis Exp. (129), e56301(2017).

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