Análise automatizada de imagens de fluorescência de C. elegans usando SegElegans

Resumo

Aqui, fornecemos instruções sobre como utilizar efetivamente o SegElegans, um sistema de aprendizado profundo que desenvolvemos para a segmentação automatizada de worms individuais em imagens de microscopia de campo amplo, para uso subsequente em software de análise de imagens, como o ImageJ. Fornecemos maneiras de usar o sistema online e offline.

Resumo

A microscopia, particularmente do tipo fluorescente, é uma ferramenta freqüentemente usada na pesquisa de C. elegans . A análise de dados de experimentos de microscopia pode, no entanto, ser bastante tediosa e demorada. Assim, a automação é desejável. Desenvolvemos o SegElegans, um sistema de rede neural convolucional baseado em U-net de duas cabeças projetado especificamente para a segmentação automatizada de vermes, mesmo em imagens com grande número de indivíduos tocando ou sobrepostos. A primeira parte do SegElegans consiste em um codificador e dois decodificadores. O encoder, baseado no modelo SmaAt AT, aplica camadas duplas de convolução seguidas por um Módulo de Atenção de Bloco Convolucional (CBAM). Ambos os decodificadores usam LSTMs convolucionais: um executa a segmentação semântica de imagens de worms (corpo, borda, plano de fundo ou sobreposição), enquanto o outro extrai um esqueleto linear ao longo de cada worm. A segunda parte é um algoritmo de pós-processamento que combina as saídas dos dois decodificadores e as usa para gerar segmentações de instância precisas. Essas segmentações podem ser alimentadas no ImageJ ou em outras ferramentas de análise de imagem apropriadas. Aqui apresentamos instruções sobre como acessar e executar este sistema. Fornecemos uma implementação on-line baseada em computação em nuvem, bem como dois métodos para usar os modelos SegElegans off-line, em uma máquina local, caso o hardware necessário esteja disponível.

Introdução

Caenorhabditis elegans é um organismo modelo eucariótico com ampla utilização nas áreas de biologia celular e molecular ^1,2,3. É um pequeno verme nematóide do solo (~ 1 mm para adultos do tipo selvagem) com um ciclo de vida rápido (~ três semanas) e um grande número de descendentes (normalmente geneticamente idênticos ao pai hermafrodita autofecundante). Apesar de sua relativa simplicidade, o animal ainda é um organismo multicelular complexo, com tecidos e órgãos definidos e distintos, que, graças ao seu pequeno tamanho e transparênc....

Protocolo

As seções a seguir incluem instruções detalhadas sobre como fazer uso eficaz de SegElegans (Figura 2). Eles incluem instruções sobre aquisição de imagem preparatória (Seção 1), como executar o modelo online (Seção 2) ou offline (Seções 3-5) e a importação de ROIs para o ImageJ ou outras ferramentas (Seção 6). Como a avaliação de imagens por meio do modelo requer um PC com uma Unidade de Processamento Gráfico (GPU) compatível com CUDA que tenha pelo menos 6 GB (idealmente mais) de memória de acesso aleatório (VRAM) de vídeo, a maioria dos usuários (desde que tenham acesso aos serviços do Google) são aconse....

Resultados

Seguindo este protocolo, os pesquisadores devem ser capazes de extrair segmentações de vermes de alta qualidade, mesmo para a análise de imagens de fluorescência sem bordas visíveis de vermes. Conforme discutido na seção 6 do protocolo, essas segmentações podem ser importadas diretamente para o ImageJ e usadas para a medição rápida de propriedades relevantes, como a intensidade de repórteres fluorescentes (comumente usados para quantificação de expressão) ou o número, tamanho e morfologi.......

Discussão

A metodologia apresentada aqui deve permitir que os usuários analisem experimentos de microscopia de C. elegans em um período de tempo significativamente mais rápido, sem qualquer perda de precisão. Uma vez que extrai segmentações de imagens guia de campo claro independentemente da fluorescência real (conforme discutido na seção 1 do protocolo), ele pode ser usado com qualquer cepa e para qualquer aplicação que exija a medição de fenótipos por verme. Isso pode incluir aplicações.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Computador com acesso à internet (exemplo: Dell Vostro Desktop)	Vários (Dell, por exemplo)	-	Isso permitirá rodar SegElegans online via computação em nuvem conforme recomendado e usando softwares de análise de imagem como o ImageJ.
Unidade de Processamento Gráfico compatível com CUDA com pelo menos 6 GB de VRAM (exemplo: MSI Geforce RTX  RTX3050 Ventus 2X 6GB) (Opcional)	NVIDIA + vários fabricantes (Micro Star International, por exemplo)	https://developer.nvidia.com/cuda-gpus	Isso permitirá rodar SegElegans offline em uma máquina local. chipsets de GPU compatíveis com CUDA podem ser encontrados aqui: https://developer.nvidia.com/cuda-gpus A VRAM depende da implementação real do chipset em uma GPU pelo fabricante. AVISO: Você precisará de uma placa CUDA cara e poderosa muito além dos requisitos mínimos (16+ GB de VRAM) para igualar o desempenho alcançado pela versão de computação em nuvem.
Microscópio de Epifluorescência (Invitrogen EVOS FL Auto 2)	ThermoFisher Scientific	AMAFD2000, por exemplo	Recomendamos o uso de um sistema que possa adquirir automaticamente imagens tanto de campo claro quanto de um ou mais canais de fluorescência quase simultaneamente.
ImageJ (Opcional)	NIH	https://imagej.net/software/fiji/downloads	Recomendamos a distribuição de Fiji, disponível aqui: https://imagej.net/software/fiji/downloads
PC com compatibilidade com GPU NVIDIA (exemplo: Dell Vostro Desktop) (Opcional)	Vários (Dell, por exemplo)	-	Isso é necessário em conjunto com a GPU para rodar SegElegans offline em uma máquina local. Uma GPU exigirá hardware compatível com Windows com os slots PCI apropriados na placa-mãe, espaço para acomodar a placa e uma fonte de alimentação suficientemente potente.
SegElegans	-	https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOnline/tree/v1.0	Veja o manuscrito para instruções completas.