Isolamento e Purificação de Cardiomiócitos Adultos de Camundongos por Perfusão de Langendorff e Sedimentação por Gravidade

Resumo

Este estudo visa otimizar e agilizar o procedimento de extração de cardiomiócitos de camundongos adultos, com o objetivo final de aprimorar as metodologias de pesquisa em doenças cardiovasculares. Esse protocolo obtém cardiomiócitos de alta viabilidade e pureza de forma eficiente em um tempo de processamento reduzido, permitindo experimentação mais confiável e acelerando avanços terapêuticos.

Resumo

As doenças cardiovasculares continuam sendo um grande desafio global de saúde, criando uma necessidade crítica de modelos in vitro confiáveis. Este estudo apresenta um protocolo otimizado para o isolamento e cultivo de cardiomiócitos adultos de camundongos, a fim de abordar limitações de baixa viabilidade e contaminação não por cardiomiócitos nos métodos existentes. O protocolo é baseado na perfusão de Langendorff retrógrada, utilizando heparina sódica para anticoagulação e empregando apenas colagênase tipo II (1,2 mg/mL) para a digestão. Os cardiomiócitos eram purificados por sedimentação gravitacional e cultivados em superfícies revestidas com laminina. Esse método consistentemente produziu 8,75 ± 0,36 × 10⁵ cardiomiócitos por coração, com alta proporção de células em formato de bastonete (91,2% ± 2,11%) e alta pureza (a porcentagem de células cTNT⁺DAPI⁺ em relação às DAPI⁺ foi aproximadamente 97,47% ± 1,365%), que exibiu estruturas sarcoméricas claras. Ao fornecer um método padronizado e reprodutível para obter cardiomiócitos adultos de alta qualidade, esse protocolo preenche efetivamente a lacuna entre estudos in vitro e relevância fisiopatológica, apoiando assim pesquisas cardiovasculares avançadas.

Introdução

As doenças cardiovasculares continuam sendo a principal causa de mortalidade em todo^{o mundo 1}. Os cardiomiócitos, como foco central na pesquisa cardíaca, há muito tempo servem como ferramentas essenciais para investigar a fisiologia e patologia^{cardíacas 2}. Embora as linhagens celulares de cardiomiócitos comercialmente disponíveis e os recentemente popularizados cardiomiócitos derivados de células-tronco humanas (hPSC-CMs) ofereçam maiores vantagens em termos de acessibilidade e facilidade de ^{manipulação 3,4,5}, os cardiomiócitos primários isolados ex vivo demonstram correlação estrutural e funcional superior com mecanismos fisiológicos e patológicos cardíacos. Portanto, dominar técnicas para isolamento de cardiomiócitos in vitro é de suma importância.

Os cardiomiócitos apresentam transformações morfológicas e funcionais distintas ao longo do desenvolvimento. Notavelmente, essas células mantêm potencial proliferativo durante o desenvolvimento embrionário e o período neonatal (dentro de 7 dias após o nascimento), mas essa capacidade regenerativa é permanentemente perdida depois^disso. Por meio da maturação pós-natal, os cardiomiócitos passam por uma remodelação morfológica substancial, adquirindo seu fenótipo adulto característico até os 2 meses de idade – com morfologia em forma de bastonete e estrutura sarcomérica altamente^{organizada 7,8}. Essas características dependentes do estágio do desenvolvimento ressaltam a importância crítica de utilizar cardiomiócitos adultos de camundongos para estudos mecanicistas da fisiopatologia cardíaca.

Fundamental para o avanço desse campo é a obtenção confiável de cardiomiócitos de alta fidelidade, especialmente células de origem adulta que emulam com precisão a fisiologia cardíaca humana. Os protocolos atuais de isolamento para cardiomiócitos muros adultos enfrentam vários desafios persistentes: (i) viabilidade celular comprometida, (ii) características populacionais heterogêneas e (iii) procedimentos tecnicamente exigentes – todos os quais coletivamente dificultam o progresso da^{pesquisa 9,10}. Isso ressalta a necessidade urgente de otimizar metodologias de isolamento para alcançar tanto rendimento quanto pureza aprimorados, fornecendo assim plataformas celulares mais relevantes fisiologicamente para a investigação de doenças cardiovasculares.

Por meio da otimização sistemática dos parâmetros de perfusão, protocolos de digestão enzimática e formulações de reagentes, este estudo estabeleceu com sucesso uma metodologia aprimorada para isolar e cultivar cardiomiócitos murinos adultos. O protocolo otimizado produz cardiomiócitos com integridade morfológica bem preservada, caracterizados por altas proporções em forma de bastonetes e estruturas sarcoméricas claramente visíveis. Esses avanços fornecem uma plataforma experimental robusta para investigação aprofundada da fisiopatologia dos cardiomiócitos, facilitando significativamente pesquisas em doenças cardiovasculares focadas em mecanismos celulares do miocárdio.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais neste estudo foram rigorosamente realizados de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) aprovadas pelo Comitê de Ética do Hospital Popular Deqing. O estudo utilizou camundongos machos C57BL/6 de 8 a 12 semanas de idade adquiridos da GemPharmatech Co., Ltd. Todos os animais foram alojados em instalações barreiras de grau SPF, com parâmetros ambientais que atendem aos padrões nacionais (temperatura ambiente 22 ± 2 °C, umidade relativa 50 ± 10%, ciclo luz/escuro de 12/12 horas). Ao longo dos experimentos, este estudo seguiu rigorosamente os princípios "3R" (Substituição, Redução, Refinamento) e implementou procedimentos padrão, incluindo anestesia e analgesia para minimizar o sofrimento animal.

NOTA: Resumidamente, o coração intacto é rapidamente excisado da cavidade torácica murina e submetido a perfusão retrógrada com solução de colagênase tipo II via o aparelho de Langendorff para digerir enzimaticamente a matriz extracelular. Após a digestão completa do tecido, o miocárdio amolecido é cuidadosamente dissociado em uma suspensão unicelular. A suspensão celular resultante é sequencialmente filtrada para remover fragmentos de tecido não digeridos, seguida por sedimentação por gravidade para enriquecer cardiomiócitos viáveis. Os cardiomiócitos purificados podem então ser utilizados para aplicações experimentais subsequentes.

1. Preparação do dispositivo de perfusão Langendorff

NOTA: O sistema Langendorff tem um volume total de tubos de 15,5 mL. A taxa de fluxo de perfusão é de 3,5 mL/min para perfusão cardíaca e de 10-15 mL/min para lavagem do sistema.

1. Lave o sistema de perfusão Langendorff com 50 mL de etanol a 75%.
   NOTA: Realize a limpeza mensal dos tubos de vidro com 1 M HCl para garantir a esterilidade.
2. Enxágue com 250 mL de ddH_2Oestéril para remover resíduos de etanol e eliminar bolhas de ar.
3. Ajuste a temperatura do banho-maria para 42 °C. Ligue a bomba para iniciar o aquecimento circulante e encha a cavidade externa do tubo serpentino com água morna.
   NOTA: Isso garante que a perfusidade chegue ao coração a 37 °C.

2. Preparação do tampão

1. Prepare o tampão de solução de Krebs-Bicarbonato (KB), tampão de perfusão (PB), tampão de digestão (DB), meio de placagem de miócitos (MPM) e meio de cultura de miócitos (MCM) de acordo com as formulações listadas na Tabela 1.
   NOTA: Prepare fresco no dia do uso.
2. Pré-resfriar 10 mL de KB buffer no gelo.
3. Encha o lúmen com pasta de cacauina. Ajuste a vazão para 3,5 mL/min e meça a temperatura do efluente (37 °C é o ideal).
4. Lave 7 mL de DB no pipeline e depois feche a linha de perfusão.
5. Prepare uma solução de heparina sódica (0,5%, 62,5 KU) e coloque 300 μL em uma seringa de insulina.
6. Aliquota 10 mL de manteiga de manteiga e 10 mL de KB em duas placas de Petri separadas e pré-resfrie no gelo.
7. Coloque um filtro de célula de 100 μm na tampa de um tubo centrífugo de 50 mL, pré-umedeça com 1 mL de KB e fixe-o em um tubo de centrífuga de 50 mL.

3. Extração cardíaca e canulação

NOTA: Neste protocolo, luvas estéreis, instrumentos, gaze e cotonetes foram usados durante todo o procedimento para minimizar a contaminação externa. Embora a técnica asséptica completa seja essencial para a cultura celular primária, aqui servia para apoiar o bem-estar animal e a integridade dos tecidos para análises histológicas e moleculares posteriores, em vez de manter a esterilidade para isolamento celular.

1. Anestesiar o camundongo por meio de injeção intraperitoneal de 80 mg/kg de pentobarbital sódico (grau farmacêutico) combinado com 5 UI/g de peso corporal de heparina sódica. Monitore de perto até que a anestesia profunda seja alcançada. Belisque os dedos do rato e observe o desaparecimento do reflexo de beliscão para confirmar o sucesso da anestesia.
2. Remova os pelos torácicos usando creme depilatório.
3. Fixe o rato em uma placa de espuma e desinfete a pele do peito com álcool 75%.
4. Levante a pele torácica com pinças e faça uma incisão no processo xifoide.
5. Eleve o xifoide e corte as costelas bilateralmente em direção às regiões axilares, depois transecte completamente o diafragma.
   NOTA: Evite danificar o coração.
6. Imobilize o esterno e as costelas usando uma pinça hemostática para expor totalmente o coração.
7. Absorva sangue e desloce suavemente o fígado em direção aos membros posteriores com tecido. Use cotonetes cuidadosamente para manipular o coração e expor a veia cava inferior.
8. Injete 300 μL de solução de heparina sódica (do passo 2.5) na veia cava inferior usando a seringa de insulina preparada.
   NOTA: Tenha cuidado para evitar a introdução de bolhas de ar.
9. Retire o tecido tímico e depois corte as veias e artérias ao redor. Transfira o coração para o buffer de PB pré-resfriado (a partir do passo 2.6) imediatamente.
   NOTA: A remoção do timo melhora a visibilidade da aorta. Preserve um segmento aórtico durante a excisão. A contração do miocárdio foi retardada pela solução de PB pré-resfriada. A excisão cardíaca sob anestesia alcança a eutanásia humana.
10. Usando microfórceps, segure a aorta e monte-a na cânula do sistema de perfusão de Langendorff. Fixe com sutura de seda 5-0.
    NOTA: Realize essa etapa rapidamente. Certifique-se de que o sistema de perfusão esteja desligado durante a montagem do coração.

4. Perfusão cardíaca

1. Ligue o sistema de perfusão e inicie o tempo de 2 minutos e 30 segundos. Durante esse período, o efluente consiste em um tampão de PB e não necessita de coleta.
2. Ao concluir o intervalo de 2 minutos e 30 segundos, comece a coletar e recircular o buffer de base de dados enquanto cronometra por 15 minutos.
   NOTA: Monitore o status miocárdico – a digestão ideal é indicada por redução da elasticidade dos tecidos e aumento da translucidez. Se a digestão parecer incompleta, a duração pode ser moderadamente prolongada, mas não deve exceder 20 minutos no total para evitar danos aos cardiomiócitos.
3. Após o período cronometrado, troque de DB para PB buffer e continue a perfusão por mais 4 minutos e 30 segundos. O efluente durante essa fase contém buffer DB; Pegue.
4. Encerre a perfusão desligando o sistema após o intervalo final de tempo.

5. Dissociação e purificação celular

1. Remova o coração da cânula e transfira-o para o buffer KB pré-resfriado (preparado no passo 2.6).
   NOTA: A digestão enzimática foi interrompida pela transferência imediata do coração para o tampão KB. Isso dilui rapidamente a enzima residual, prevenindo a digestão excessiva e garantindo alta viabilidade celular.
2. Usando tesouras finas, excise cuidadosamente os tecidos auricular e aórtico, retendo apenas o miocárdio.
3. Dissocie mecanicamente o tecido miocárdico em pequenos fragmentos (<1 mm³) usando microfórceps.
4. Sopre suavemente os fragmentos de tecido usando um conta-gotas de 2 mL para obter uma suspensão de célula única.
   NOTA: Tenha extremo cuidado durante o sopramento para preservar a morfologia dos cardiomiócitos em forma de bastonete. Evite usar pontas padrão de pipeta, pois seu cano estreito pode prejudicar mecanicamente a integridade celular.
5. Filtre a suspensão resultante da célula através do filtro de célula pré-umido de 100 μm (montado no passo 2.7) para um tubo de 50 mL.
6. Transfira a suspensão filtrada para um tubo de 15 mL e permita que os cardiomiócitos se sedimentem por gravidade (15 min, 4 °C).
   NOTA: A área de superfície basal reduzida dos tubos de 15 mL melhora significativamente a eficiência da recuperação celular em comparação com tubos de 50 mL.
7. Aspire cuidadosamente o sobrenadante, ressuspenda os cardiomiócitos em pellets em 10 mL de tampão KB gelado usando uma pipeta de transferência de 2 mL e repita a sedimentação (15 min, 4 °C).
8. Repita os passos 5.4-5.7 para obter uma preparação purificada de cardiomiócitos intactos em forma de haste, adequados para aplicações.

6. Cultura celular

1. Revestir os pratos de cultura com 10 μg/mL de laminina e incubar a 37 °C por 2 horas.
   NOTA: Para minimizar danos mecânicos aos cardiomiócitos em forma de haste e reduzir o tempo de processamento prolongado associado ao revestimento diferencial, este estudo utilizou revestimento de laminina em vez do revestimento diferencial, uma estratégia que não apenas aumenta a eficiência da fixação celular, mas também preserva as características fisiológicas nativas dos cardiomiócitos.
2. Ressuspenda os cardiomiócitos em 4 mL de MPM pré-aquecido (37 °C). Após remover a solução de laminina, seme os cardiomiócitos nas panelas revestidas. Incube a 37 °C com 2% de_CO2 por 1 hora. Observe a morfologia, tamanho e densidade celular ao microscópio.
3. Após a incubação, decante cuidadosamente o MPM e substitua-o por MCM pré-aquecido (37 °C). Mantenha a incubação a 37 °C com 2% de_CO2 por 24 horas.
4. Após 24 horas, examine os cardiomiócitos quanto à integridade estrutural e morfologia.
   NOTA: Mantenha uma técnica asséptica rigorosa durante todo o procedimento.
   ATENÇÃO: A colagenase tipo II pode causar alergias respiratórias, irritação na pele e nos olhos. Certifique-se de operar em um local bem ventilado e evite inalar poeira ou entrar em contato com pele e membranas mucosas. Todos os tecidos cardíacos descartados, amostras de sangue e quaisquer suprimentos descartáveis que tenham entrado em contato com eles devem ser coletados como resíduos bio-perigosos em recipientes dedicados e à prova de vazamentos, marcados com o símbolo de risco biológico. Esses materiais são posteriormente submetidos a procedimentos centralizados de descontaminação e descarte.

Resultados

O procedimento de isolamento e cultivo de cardiomiócitos adultos de camundongos é demonstrado no protocolo, com a instrumentação necessária e a configuração de tubos ilustradas na Figura 1. A avaliação morfológica revelou que os cardiomiócitos recém-isolados, assim como aqueles cultivados por 1 e 24 horas, apresentaram morfologia característica em forma de bastonete ou fusiforme, com estrias claramente visíveis (Figuras 2A-C...

Discussão

Este estudo representa um avanço metodológico significativo na pesquisa cardiovascular ao estabelecer um protocolo otimizado para isolamento e cultura de cardiomiócitos em camundongos adultos. Por meio do refinamento sistemático da composição do tampão e dos parâmetros enzimáticos de digestão, essa abordagem melhora significativamente a confiabilidade do sistema de cultura, ao mesmo tempo em que melhora tanto a pureza quanto a viabilidade dos cardiomiócitos. Esses avanços técnicos fornec...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
BDM	Aladdin Scientific Corporation, Xangai, China	D111028
BSA	Aladdin Scientific Corporation, Xangai, China	B265994
C57BL/6 camundongos	GemPharmatech Co., Ltd		8– Menino de 12 semanas
CaCl2	Aladdin Scientific Corporation, Xangai, China	C431202
Colagenose tipo II	Worthington Biochemical Corporation (EUA)	LS004176	LOT#:43D23502    Unidades de atividade enzimática: 270u/mg dw
FBS	Beyotime Biotechnology, China	C0226
Glicose	Aladdin Scientific Corporation, Xangai, China	D639737
HEPES	Sigma-Aldrich	H7006
KCl	Aladdin Scientific Corporation, Xangai, China	P112134
KH2PO4	Aladdin Scientific Corporation, Xangai, China	P104075
L-glutamina	Thermo Fisher Scientific	25030081
MEM	Thermo Fisher Scientific	11095080
MgSO4	Aladdin Scientific Corporation, Xangai, China	M116444
Na2HPO4	Aladdin Scientific Corporation, Xangai, China	S274390
NaCl	Aladdin Scientific Corporation, Xangai, China	C111547
NaH2PO4	Aladdin Scientific Corporation, Xangai, China	S108339
NaHCO3	Aladdin Scientific Corporation, Xangai, China	S112338
Penicilina-estreptomicina (100x)	Beyotime Biotechnology, China	C0222
Microscópio Primovert de Cultura Celular Invertida	Carl Zeiss
Taurina	Aladdin Scientific Corporation, Xangai, China	T103829