O ensaio de tecido animal utiliza detecção de cintilação nuclear para determinar a atividade enzimática da glicogênio sintase medindo a incorporação de glicose radiomarcada no glicogênio.
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Artigo de método
Avaliação radioquímica da atividade da enzima glicogênio sintase em tecido animal
Neste artigo
Resumo
Resumo
O glicogênio é um metabólito importante para muitas células eucarióticas, essencial para o armazenamento de energia e liberação rápida de energia. A construção da molécula depende da glicogênio sintase, uma enzima altamente regulada com a função primária de facilitar a ligação sequencial de unidades de glicose em um polímero de glicogênio em crescimento. Esta enzima é alostericamente ativada pela glicose-6-fosfato e inibida em vários locais pela fosforilação. O conhecimento da atividade enzimática da glicogênio sintase é um componente chave para entender o metabolismo do glicogênio, os níveis de energia muscular e os distúrbios metabólicos, como diabetes e doenças de armazenamento de glicogênio. Aqui está descrito um método altamente sensível e eficaz de determinar a atividade da glicogênio sintase no tecido muscular animal, medindo a quantidade de glicose integrada, de glicose [14C] -UDP marcada com rádio, em moléculas de glicogênio. Este procedimento utiliza 14C radioativo e exigirá a devida autorização e espaço de laboratório para uso e descarte. Este procedimento também exigirá acesso a um contador de cintilação líquida.
Introdução
O glicogênio, um polissacarídeo altamente ramificado composto por unidades de glicose, serve como uma importante reserva de energia em vários tecidos, incluindo músculos, fígado e cérebro1. Sua síntese e degradação são orquestradas por um complexo sistema de enzimas especializadas e proteínas reguladoras. Vital para sua biossíntese é a enzima glicogênio sintase (GYS), da qual existem duas isoformas (GYS1 e GYS2). A GYS1 é uma enzima reguladora diretamente responsável pela criação de glicogênio a partir da glicose em células não hepáticas, enquanto a GYS2 funciona no fígado. Esse processo, conhecido como glicogênese, é a adição sequencial de uma unidade individual de glicose em uma cadeia de glicogênio em crescimento. O GYS catalisa a transferência de glicose da glicose difosfato de uridina intermediária (UDP-glicose) para o final de uma cadeia de glicogênio, criando uma ligação alfa-1,4-glicosídica2. Em coordenação com a enzima de ramificação do glicogênio, essa reação estende as moléculas de glicogênio, fornecendo armazenamento e liberação de energia eficientes.
Existem técnicas de ensaio para medir a atividade da enzima, com um dos agrupamentos mais comuns de métodos consistindo naqueles da variedade espectrofotométrica 3,4. Esses ensaios normalmente dependem de um sistema de reações acopladas indiretas e medem a absorbância do produto a jusante, NADH, a 340 nm. Uma unidade de NADH é consumida para cada unidade de UDP liberada da UDP-glicose pela glicogênio sintase, produzindo uma excitação mensurável que se correlaciona diretamente com a atividade da glicogênio sintase 5,6. Embora os ensaios de espectrofotometria sejam relativamente baratos e acessíveis, eles vêm com a pequena desvantagem de depender de uma reação indireta e grandes desvantagens de interferência pela turbidez da amostra e menor sensibilidade, especialmente um problema para amostras menores ou amostras com glicogênio sintase pouco / altamente fosforilada. Ensaios fluorométricos, usando as reações acopladas descritas acima, foram desenvolvidos para melhorar a sensibilidade no tecido muscular de humanos7 e camundongos8. Existem outras técnicas para quantificar a glicogênio sintase, como immunoblotting9 e imuno-histoquímica10; no entanto, essas técnicas só são capazes de quantificar a quantidade física da enzima e, na melhor das hipóteses, podem inferir a atividade da fosforilação, mas não quantificar diretamente a atividade enzimática11.
Dentre essas técnicas de ensaio enzimático, os métodos radioquímicos continuam sendo os mais utilizados para determinar a atividade da glicogênio sintase em tecidos de mamíferos devido à sua falta de interferência pela turbidez da amostra e sua alta sensibilidade 8,9. Esses ensaios incorporam glicose radiomarcada de UDP-glicose marcada com 14C12 ou 3H13 em glicogênio, permitindo a medição direta da atividade enzimática durante um determinado período de tempo. No procedimento a seguir, uma amostra de tecido contendo glicogênio sintase é exposta a UDP-glicose e primer de glicogênio. A glicogênio sintase catalisa a reação mostrada na equação abaixo:
UDP-[14C]glicose + (glicogênio)n → (glicogênio)n+1[14C] + UDP
Após um determinado período de tempo, a reação é encerrada e o glicogênio contendo glicose radiomarcada é precipitado em papel de filtro12 (conforme descrito abaixo) ou submetido a filtração em gel, conforme descrito por Niederwanger et al.14 e medido usando um detector de cintilação. Este método também inclui uma reação idêntica separada que inclui glicose-6-fosfato (G6P), um ativador alostérico da glicogênio sintase. Em condições com níveis suficientes de G6P, a atividade da glicogênio sintase é ativada ao máximo, mostrando o potencial absoluto de atividade da glicogênio sintase de uma determinada amostra. O método descrito aqui foi modificado de Suzuki e colegas15 para um formato de 96 poços e é otimizado para uso em tecido muscular de camundongo; no entanto, o protocolo pode ser alterado para outros tecidos e espécies animais.
Apesar das considerações inerentes de custo e segurança associadas aos materiais radioativos, os ensaios radioquímicos oferecem vantagens significativas sobre as alternativas não radioativas, desde que os instrumentos estejam disponíveis. O procedimento a seguir detalha um meio altamente sensível e robusto de determinar a atividade da glicogênio sintase, uma enzima chave no metabolismo do glicogênio, no tecido muscular animal.
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Protocolo
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Ball State University. Coortes masculinas e femininas de B6; Camundongos selvagens 129-Gaatm1Rabn / J, com 3 meses de idade, são usados como um exemplo representativo neste manuscrito. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação antes do ensaio
- Colha o tecido por luxação cervical16 e congele imediatamente em N2 líquido para preservar os estoques de glicogênio e armazene em N2 líquido ou freezer ultrabaixo até o início do ensaio.
- Preparar as soluções-mãe antes do início do ensaio de glicogénio sintase (quadro 1).
- Determine o número de amostras de camundongos replicados e controles desejados para o ensaio. Cada amostra de camundongo requer quatro réplicas totais, duas para cada reação (presença ou ausência de G6P) (ver Figura 1 e Tabela 2).
- Corte o papel de cromatografia em tiras de 4 cm. O glicogênio se liga a este papel e permanece ligado durante o processo de lavagem. Usando a largura (6 mm) de uma trituradora de papel, destrua o papel de cromatografia em segmentos individuais finos.
- Usando um lápis, rotule as tiras de papel designadas com identificação do mouse, espaços em branco e totais. Evite usar tinta.
- Coloque papéis de cromatografia no modelo de bloco de madeira. Cada modelo comporta até 12 papéis, correspondendo a uma linha de uma placa de 96 poços.
- Obtenha grampos de papel para cromatografia (partes superiores da prancheta).
- Prepare um grampo para cada linha de reação prendendo as bordas dos papéis de cromatografia, deixando a maior parte da área de superfície dos papéis exposta. Certifique-se de que as bordas rotuladas estejam visíveis.
- Rotule os tubos de microfuga de 1,7 mL com identificação da amostra. Dois tubos por amostra; um para homogeneizado e outro para sobrenadante.
- Antes do início do ensaio, prepare as misturas de reação + e - G6P, consulte a Tabela 3 para obter mais informações. Preparar alíquotas de 2.400 μL de cada mistura de reacção.
2. Reação radioquímica da atividade da glicogênio sintase
CUIDADO: Esta etapa contém o uso de [14C]-UDP-glicose, que é um material radioativo. Manuseie, armazene e descarte de maneira aprovada pela Comissão Reguladora Nuclear (NRC).
- Adicionar 30 μL de [14C]-UDP-glucose (0,1 μCi/μL) a alíquotas de 2.400 μL de ambas as misturas de reação (+/- G6P) para uma concentração final de 0,0012 μCi/μL. Esta receita é adequada para 18 amostras.
NOTA: O volume de [14C]-UDP-glicose pode ser alterado para conservar o uso e garantir a sensibilidade adequada. Por exemplo, use 50 μL para tecido cerebral de camundongo e 25 μL para coração de camundongo. - Misturas de reação de vórtice e alíquota de 50 μL para cada poço de uma placa de 96 poços que conterá amostras, brancos e totais (Tabela 2). Depois, cubra com filme plástico e coloque a 4 C.
- Defina os inibidores de protease para descongelar à temperatura ambiente. Esses inibidores são discriminados na Tabela 4 com informações adicionais.
- Massa 30-50 mg de tecido congelado. ~ 30 mg é ideal para amostras de músculo esquelético e coração; ~ 50 mg para o cérebro. Mantenha o tecido e os tubos de microcentrífugas em N2 líquido e pese rapidamente o tecido para garantir que o tecido permaneça congelado. Use um pilão resfriado para moer ainda mais o tecido.
- Preparar tampão de homogeneização com inibidores de protease no gelo.
- Uma amostra de cada vez, mova o tubo com tecido do N2 líquido para o gelo com uma tampa fria por 1 min. Adicione uma tampa fria (tampa do tubo com três pequenos orifícios resfriados em líquido N2) ao sample tubo ainda em líquido N2. Isso evita a perda de tecido à medida que o líquido residual N2 no tubo evapora. Uma vez fora do N2 líquido, as amostras devem permanecer no gelo.
- Uma vez no gelo, adicione volume (10-30 μL / mg de tecido) de tampão de homogeneização à amostra e homogeneize a amostra com Tissue-Tearor. Após a conclusão dessas duas etapas, passe para o próximo exemplo.
NOTA: O volume de tampão adicionado às amostras pode ser otimizado dependendo da fonte do tecido. Por exemplo: 30 μL / mg para músculo esquelético, 15 μL / mg para coração e 10 μL / mg para cérebro. - Centrifugue amostras por 5 min a 4 ° C a 3.600 g e transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga limpo. Tenha cuidado para não tocar no pellet. Vórtice e adicione ~ 150 μL aos poços correspondentes em uma placa de 96 poços com fundo em V no gelo. Guarde o restante para sobrenadante para o ensaio de Bradford (consulte a etapa 2.15)
NOTA: Se desejado, alíquotas de amostra adicionais podem ser salvas para ensaios posteriores, como immunoblotting.
CUIDADO: As etapas 2.9 a 2.14 exigem o manuseio de 14C. Descarte todos os materiais contaminados de maneira aprovada pelo NRC. - Remova a placa de mistura de reação de 4 °C e aqueça a 30 °C no termociclador com o filme removido. Durante este tempo, obter 1 L de etanol a 66% a -20 °C e adicionar a um copo de lavagem com uma vareta de agitação na placa de agitação.
- Inicie a reação adicionando 25 μL de sobrenadante de amostra aos poços de reação e 25 μL de tampão de homogeneização aos poços em branco e total. Use uma pipeta multicanal para adicionar 1 linha na placa de reação de cada vez, aguardando pelo menos 1 minuto entre as linhas. Registre a hora em que a reação foi iniciada para cada linha. Consulte a Tabela 2 para obter mais informações. Use uma pipeta multicanal e certifique-se de que volumes iguais de líquido sejam adicionados.
- Aguarde 10-15 minutos para que a reação seja executada; no entanto, o tempo de execução deve ser idêntico entre as linhas.
- Aspirar 55 μL de cada alvéolo com uma pipeta multicanal e dispensar sobre os respectivos papéis de cromatografia previamente preparados. Misture a reação pipetando para cima e para baixo antes da aspiração. Spot líquido no centro dos papéis de cromatografia.
- Remova os papéis com totais do grampo usando uma pinça depois de detectar o líquido do poço. Estes podem ser dispostos em papel alumínio com segurança para secar. Coloque todos os outros papéis de cromatografia no banho de etanol a 66%. O glicogênio é insolúvel em etanol a 66%, enquanto a glicose [14C]-UDP é solúvel e lava os papéis de cromatografia.
- Repita as etapas 2.11 e 2.12 para cada linha na placa de reação. Certifique-se de que o tempo de reação de cada linha seja o mesmo, registrando os tempos de início e término da reação.
- Depois que todas as linhas forem adicionadas ao etanol a 66%, lave por 15 min.
NOTA: Durante esta etapa e as etapas de lavagem subsequentes, alíquotas de amostra podem ser preparadas para ensaios complementares, como o ensaio de Bradford, responsável por determinar o volume total de proteína para normalização, necessário no cálculo da atividade enzimática. - Descarte o etanol a 66% sem perder os papéis de cromatografia. Lave com 1 L de etanol novo a 66% por 30 min. Este etanol a 66% pode estar à temperatura ambiente.
- Repita a etapa anterior para um total de três lavagens de 30 min com etanol a 66%.
NOTA: Se desejado, o etanol a 66% da etapa final de lavagem pode ser salvo e armazenado a -20 °C para ensaios subsequentes. - Após a remoção do etanol a 66%, mergulhe todos os papéis de cromatografia no béquer de lavagem em acetona. A acetona facilita o processo de secagem.
- Remova os papéis de cromatografia da acetona e coloque-os sobre papel alumínio. Guarde ou descarte a acetona.
- Seque os papéis de cromatografia sob uma lâmpada de calor por 15 min.
NOTA: Os papéis secos podem ser armazenados indefinidamente. Os papéis podem ser armazenados com segurança até que estejam prontos para prosseguir com a detecção de cintilação.
3. Atividade de medição com detecção de cintilação
- Usando uma pinça, mova os papéis de cromatografia para frascos de cintilação mantidos em racks de cintilação. Registre como os papéis de amostra são orientados.
- Adicione 5 ml de líquido de cintilação a cada frasco para injetáveis utilizando a bomba da tampa. Tampas de rosca para cada frasco.
- Carregue as amostras no detector de cintilação e carregue o rack de parada atrás das amostras. Certifique-se de que o programa para monitoramento 14C esteja selecionado. Inicie a detecção selecionando Contagem automática.
- Resultados de impressão
- Descarte os tubos de cintilação e o conteúdo de maneira aprovada pelo NRC.
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Resultados
Seguindo o protocolo, uma impressão criada a partir do detector de cintilação conterá a quantidade medida de radiação ionizante emitida por cada papel de cromatografia contendo frasco, diretamente correlacionada ao nível de atividade da glicogênio sintase. O detector de cintilação calculará as contagens por minuto (CPM) de radiação detectada para cada amostra, branco e total durante um determinado período de tempo. Primeiro converta CPM em DPM (desintegrações por minuto), que se baseia n...
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Discussão
A medição da atividade da enzima glicogênio sintase é uma ferramenta valiosa para monitorar o metabolismo do glicogênio em vários estados metabólicos e de doença. A medição na ausência e presença de glicose-6-fosfato (G6P) oferece informações sobre o status regulatório da enzima e um índice indireto do estado de fosforilação. O ensaio de incorporação de glicose [U-14C]-UDP é uma técnica eficiente e bem documentada para medir a atividade enzimática da glicogênio sintase, oferec...
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
O financiamento foi fornecido em parte pela Ball State University, Indiana University School of Medicine-Muncie e Aro Biotherapeutics.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| [14C] Uridina 5-difosfo-glicose | Produtos Químicos Radiomarcados Americanos | ARC 0154 | |
| 31 artigo de cromatografia ETCHR | Whatman | 3031 915 | |
| Hidrato de cloridrato de benzamidina | Sigma | B6506 | |
| Beta-mercaptoetanol | Sigma | M3148 | |
| Banho seco | Torey Pines Scientific | SC25 | |
| Etanol (200 proof) | PharmcoAaper | 111000200 | |
| Ácido tetraacético de etilenoglicol (EGTA) | Sigma | E4378 | |
| Ácido etilenediaminotetraacético (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| Glucose-6-fosfato sal sódico | Sigma | G7879 | |
| Glicogênio do fígado de coelho (Tipo III) | Sigma | G8876 | |
| Microplaca, fundo plano, 96 poços | Greiner | 655101 | |
| Microplaca, PCR, 96 poços | DOT Scientific | 951-PCR | |
| Contador de Cintilação Multiuso | Beckman Coulter | LS 6500 | |
| Diidratado de flúor de potássio | Sigma | 221872 | |
| Coquetel inibidor de protease | GoldBio | GB-108-2 | |
| Coquetel de cintilação | Reasearch Products International | 111195 | |
| Frascos de cintilação | Reasearch Products International | 125509 | |
| Fluoreto de sódio | Sigma | S7920 | |
| Tearor de tecidos | Produtos Biospec | Modelo 398 | |
| Tosilisina Clorometil Cetona (TLCK) | Sigma | T7254 | |
| Base de Trizma (99,9%) | Sigma | T1503 | |
| Cloridrato de Trizma | Sigma | T3253 | |
| Uridina 5-difospoglicose | Sigma | U-4625 |
Referências
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Reimpressões e permissões
