Artigo de método

Modelo de amputação do membro posterior do rato abaixo do joelho e reinervação muscular imediata direcionada

DOI:

10.3791/69119

⸱

22 de maio de 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Plastic Surgery, Medical College of Wisconsin

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo demonstra como realizar uma amputação abaixo do joelho em ratos e realizar imediatamente a inervação muscular direcionada (iTMR) para investigar estratégias de tratamento e prevenção da dor relacionada à amputação e para melhor compreender os mecanismos da dor associados à amputação.

Resumo

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A dor relacionada à amputação reduz a qualidade de vida do paciente, contribui para o uso de opioides e pode diminuir a reabilitação funcional e o uso de próteses. Modelos pré-clínicos que produzem de forma confiável dor após a amputação enquanto preservam a mobilidade são essenciais para estudar os mecanismos biológicos subjacentes a esses desfechos. Aqui, apresentamos um protocolo cirúrgico detalhado e reproduzível para roedores, usando ratos Sprague-Dawley para modelar amputações abaixo do joelho dos membros posteriores. O procedimento envolve o isolamento e o transecto dos ramos do nervo ciático, incluindo os nervos tibial, peroneal comum e sural, produzindo patologia nervosa e comportamentos dolorosos pós-amputação sustentados. Os ratos se recuperam bem desse procedimento e podem andar imediatamente após a cirurgia, sem dificuldade para comer ou beber. Os animais podem ser avaliados posteriormente com medidas reflexivas e espontâneas de dor. Os comportamentos de dor resultantes desse procedimento são robustos ao longo do tempo, e comportamentos reflexos padrão podem ser obtidos a partir do coto. Importante, a mobilidade preservada possibilita testes comportamentais longitudinais sem comprometimento motor. Embora esse protocolo seja centrado na amputação, ele pode ser facilmente adaptado para incorporar a reineração muscular direcionada (TMR) como intervenção pós-amputação, coaptando nervos transectos a ramos motores próximos dos nervos até o bíceps femoral e semimembranoso, permitindo a investigação de intervenções de reinervação e seus efeitos na dor pós-amputação. Já usamos esse modelo com sucesso anteriormente para avaliar diferenças específicas de sexo nos comportamentos de dor após amputação e para estudar os efeitos da TMR. Esse protocolo oferece uma plataforma robusta e flexível para investigar a dor relacionada à amputação, a formação de neuromas e os resultados funcionais, com aplicabilidade a estudos translacionais voltados para melhorar a dor pós-amputação.

Introdução

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A dor crônica é uma das complicações mais debilitantes após amputação de membro em grande escala, afetando até 70% dospacientes 1,2,3. Estratégias convencionais de manejo da dor, como intervenções farmacológicas, fisioterapia, bloqueios nervosos e terapias psicológicas, frequentemente proporcionam alívio limitado outransitório 4. Assim, permanece uma necessidade clínica significativa de estratégias eficazes de manejo da dor a longo prazo.

A reinervação muscular direcionada (TMR), inicialmente desenvolvida para melhorar o controle das próteses mioelétricas, emergiu como uma abordagem promissora para aliviar a dor após amputação de membro5. A técnica cirúrgica envolve redirecionar nervos motores-sensoriais mistos seccionados para ramos motores próximos. Clinicamente, a TMR apresentou reduções substanciais na dor fantasma do membro, dor residual do membro e sintomas relacionados aoneuroma 6,7,8. Interfaces regenerativas de nervos periféricos (RPNI) são outra intervenção cirúrgica utilizada para lesão nervosa e dor relacionada à amputação. Extremidades nervosas amputadas são costuradas e depois enxertadas em um enxerto muscular livre (desnervado, avascular) 9. Os axônios amputados neurotizam as junções neuromusculares desnervadas para criar contração muscular no enxerto, que pode ser usada para criar um sinal de controle da mioprótese. Em contraste com a TMR, o RPNI tem sido amplamente estudado em um modelo de roedor. Semelhante à TMR, o RPNI tem demonstrado prevenir a formação de neuromas e reduzir a dor associada à lesão por transeçãonervosa 10,11. Clinicamente, foi demonstrado que o RPNI reduz tanto a dor fantasma quanto a residual nos membros emamputados 12.

Apesar da adoção clínica, os mecanismos biológicos subjacentes aos efeitos analgésicos da TMR e RPNI continuam pouco compreendidos. Modelos pré-clínicos são cruciais para elucidar esses mecanismos. Trabalhos anteriores utilizaram modelos de transeção nervosa com modificações para superficializar o nervo e testar diretamente a dorneuromática 10,11. Esses modelos podem quantificar a dor neuromatosa com estimulação direta e dor neuropática ao avaliar os comportamentos do reflexo espinhal na distribuição nervosa intacta que permanece no pé. A lesão do nervo poupado, por exemplo, mantém o nervo sural, e os nervos tibial e peroneal comum são seccionados. O teste de comportamento doridoso é realizado no pélateral 13. O modelo de amputação do membro posterior representa a lesão mais grave possível no membro. Assim, há uma perda neuronal generalizada e as significativas demandas inflamatórias e de cicatrização associadas a uma lesão desse tipo. Quando há uma lesão nervosa, os neurônios saudáveis do DRG ajudam a manter os neurônios lesionados. Com a amputação, a população de neurônios saudáveis disponíveis é muito reduzida, e para cada nervo lesionado, há maior perda neuronal do que se apenas um único nervo tivesse sidolesionado 14, 15, 16. Relatos anteriores de cirurgia de sobrevivência por amputação de membros posteriores em roedores sãoraros 17,18. No entanto, existem vantagens em relação à amputação do membro superior, como a abundância de dados históricos que examinam dor e regeneração relacionadas ao nervo ciático, além de múltiplos testes comportamentaisambulatórios 19,20.

Para suprir essa lacuna, desenvolvemos recentemente um modelo de amputação do membro posterior de rato incorporando TMR imediato (Figura 1). A técnica para criação de RPNI já foi publicada anteriormente e pode ser adaptada ao modelo21 de amputação do membro posterior. Esse modelo espelha de perto os procedimentos clínicos, permitindo avaliar vários comportamentos de dor, formação de neuromas e preservação de neurônios (Figura 2)22. Nosso trabalho demonstrou benefícios analgésicos significativos para a TMR em relação à amputação padrão, prevenção de neuromas e demonstrou respostas sexualmente dimórficas na sensibilidade aofrio 22,23.

O protocolo apresentado aqui fornece uma demonstração visual detalhada e padronizada da técnica cirúrgica, garantindo reprodutibilidade e consistência nas abordagens experimentais. Ao ilustrar claramente etapas-chave, incluindo isolamento nervoso, transeção precisa e coaptação nervosa sem tensão, este protocolo oferece aos pesquisadores uma estrutura robusta para investigar os mecanismos subjacentes à analgesia mediada por TMR e à prevenção de neuromas.

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Protocolo

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Todos os procedimentos com animais devem ser aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) e estar em conformidade com o Guia dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

1. Preparação pré-operatória

NOTA: Foram usados ratos Sprague-Dawley machos e fêmeas (Charles River Laboratories), com idades entre 8 e 10 semanas e pesando entre 250 e 300 g.

  1. Ligue o almofada térmica e prepare um campo cirúrgico estéril. Coloque uma almofada estéril perpendicular ao corpo do rato para uma exposição ideal.
  2. Organize todos os instrumentos e materiais cirúrgicos: solução salina estéril (cloreto de sódio 0,9%), solução antisséptica povidona-iodo, meloxicam, cauterização, microsutura 10-0, suturas trançadas absorvíveis 4-0, régua e adesivo para a pele.
    NOTA: Todos os instrumentos cirúrgicos devem ser esterilizados por autoclaving ou esterilização com esferas quentes.
  3. Induza anestesia colocando o rato em uma câmara de indução com 4% de isoflurano, oxigênio a 10 L/min e ar a 60%. Após 4 minutos ou uma vez sem resposta, troque para um cone nasal e ajuste o isoflurano para 1,5%–2,0%, dependendo do tamanho do rato.
  4. Raspe o local cirúrgico desde a parte inferior das costas até todo o membro posterior. Realize uma preparação tripla com solução antisséptica alternada de povidona-iodo e swabs de álcool, terminando com álcool.
  5. Administre 1 mg/kg de meloxicam por via subcutânea usando uma seringa de tuberculina (tipicamente 0,2 mL para um rato de 200 g).

2. Amputação abaixo do joelho (Figura 1)

  1. Use uma régua para marcar a linha da articulação do joelho e faça duas marcas adicionais de 2 cm e 3 cm distal ao joelho.
  2. Faça uma incisão cutânea circunferencial de 3 cm distal ao joelho usando um bisturi.
  3. Use dissecação contundente e aguda para separar a pele circunferencialmente da musculatura subjacente até que ela retraia livremente.
  4. Repita esse processo de minagem com os músculos subjacentes, dissecando cuidadosamente até o osso enquanto preserva os planos do tecido. Marque a tíbia/fíbula 1 cm proximal à incisão circunferencial usando uma cautéria ou marcador estéril.
  5. Use pequenas tesouras ósseas para seccionar a tíbia e o peronéul no local marcado. Use cauterização para alcançar a hemostasia. Examine a extremidade do osso para ver se há bordas afiadas e corte ou corte conforme necessário.
  6. Usando uma sutura trançada absorvível 4-0, feche os compartimentos musculares anterior e posterior juntos sobre o osso para criar uma almofada muscular. Comece suturando a borda frontal sobre a tíbia, o ponto de pressão primário. Normalmente, são usados de 4 a 6 pontos interrompidos.
  7. Feche a pele lateralmente com suturas trançadas absorvíveis 4-0 interrompidas, evitando colocar diretamente sobre o coto que sustenta o peso. Aplique adesivo para a pele ao longo da linha da incisão.

3. Cirurgia de intervenção em TMR (Figura 1)

  1. Faça uma incisão longitudinal de 1,5 a 2 cm de divisão glútea aproximadamente 5 mm após o fêmur.
  2. Use dissecação contundente para separar os músculos glúteo e isquiotibiais, expondo o nervo ciático logo próximo à sua trifurcação nos nervos tibiais, peroneus comuns (PC) e surais.
  3. Identifique ramos motores proximais: um ramo grande passa por baixo da caudofemoralis (CFM), dando origem ao ramo da CFM, semimembranoso (SM) e bíceps femoral (BF).
  4. Eleve o CFM com um cotonete e divida-o. Neurolise cuidadosamente os ramos SM e BF com dissecação contunda sob microscópio cirúrgico usando pinças finas de Dumont microcirúrgicas.
    1. Use pinças para pegar o epineurio e, com tesouras molas curvas finas, abra o epineurio e divida-o longitudinalmente, separando os diferentes ramos uns dos outros.
    2. Preserve o ramo CFM e divida os outros próximos ao tronco ciático. Motores curvos ramificam inferiormente para facilitar a coaptação.
  5. Neurolisa a trifurcação ciática abrindo o epineurio e dividindo-o com tesouras molas finas e curvas. Afaste suavemente os ramos nervosos com pinças finas. Segure cada um dos três ramos (CP, tíbia, sural) 5–10 mm distal à trifurcação usando pinças.
  6. Coloque tensão e transectoque cada nervo o mais distal possível. Segurando a extremidade distal cortada, faça um corte limpo até a extremidade proximal extirpando pelo menos 5–10 mm.
  7. Realize as coaptações com sutura de nylon 10-0: a CP para SM usando uma sutura, tíbia para o ramo BF grande usando uma ou duas suturas, e sural para o ramo BF pequeno usando uma sutura. Use pelo menos 3 nós por sutura, assegure uma posição sem tensão, evite apertar o suficiente para vincar o nervo e disponha coaptações sem angulações acentuadas.

4. Grupo apenas de amputação

  1. Liga os nervos CP, tibial e sural usando um ponto de seda 5-0. Manuseie a seda com pontos Dumont para amarrar as pinças. Certifique-se de que a ligadura dobra o nervo e esteja fixada com 4 nós quadrados.
  2. Puxe suavemente cada nervo proximalmente usando o nó e transecto 1–2 mm distal à ligadura. Remova 10 mm do segmento do nervo distal.
  3. Prossiga com a amputação conforme detalhado na seção 2.

5. Cuidados pós-operatórios

  1. Coloque o rato de volta em uma gaiola aquecida até que ele esteja andando. Administre uma segunda dose de meloxicam (0,2 mL) por via subcutânea 24 horas depois.
  2. Monitore diariamente por 7 dias quanto à integridade da ferida, sinais de infecção, dor ou sofrimento, e intervenha conforme necessário conforme as diretrizes da IACUC.

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Resultados

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Esse modelo de amputação do membro posterior induziu de forma confiável comportamentos neuropáticos relacionados à dor, preservando a capacidade de caminhada e exploração em ratos. Como mostrado na Figura 2, a transecção do nervo periférico durante a amputação sem um alvo distal resulta em crescimento axonal desorganizado e formação de neuroma no local da ligadura, visualizados pela imunocoloração por B-tubulina e peptídeo relacionado ao gene da calcitonina ...

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Discussão

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Este protocolo detalha etapas cirúrgicas essenciais para garantir a reprodutibilidade do modelo de amputação do membro posterior e demonstra a preservação da ambulação e do engajamento comportamental nos testes pós-amputação. Princípios cirúrgicos chave, incluindo identificação anatômica cuidadosa, manipulação mínima dos nervos e manuseio sem tensão dos nervos seccionados, são enfatizados para garantir consistência e reprodutibilidade entre os cirurgiões. Essas considerações técnicas são...

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Divulgações

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Os autores não declaram conflitos de interesse.

Agradecimentos

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Essa pesquisa foi apoiada pelo Centro de Pesquisa em Neurociência do Medical College of Wisconsin, pela Fundação Rita Allen e pela Fundação de Cirurgia Plástica. Os autores agradecem à Unidade de Medicina Comparada pelo cuidado e apoio aos animais.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
10-0 nylon microsuture (Arosurgical)AROSurgicalT04A10N07-13Sutura fina de coaptação de nervos. Sutura micro 10-0. 
4-0 polyglycolic acid sutureEthiconAQ1268Sutura de fechamento para músculo e pele. Sutura absorvível 4-0. 
5-0 silk surgical sutureGenericGenericSutura de ligação de nervo
Adult Sprague-Dawley ratsCharles River LaboratoriesGenericAnimal experimental
Alcohol prep padsDukal CorporationGenericAntisséptico para a pele
Betadine 10%Avrio Health LPGenericAntisséptico
Bone scissorsFST16030Instrumento para corte de osso
Cautery deviceFST18010-00Dispositivo de hemostasia
Cotton tip applicator (ProAdvantage)ProAdvantageRef 76100Manipulação de tecido
Curved microdissector scissorsFST15019-10Tesoura fina para neurolise
Forceps (fine Dumont)FST11254-20Instrumento para manuseio de nervos
Forceps (suture tying Dumont)FST11063-07Instrumento para manuseio de sutura
Gauze USP type VII (Cardinal Health)Cardinal HealthRef 2146Mantém campo estéril
Heating pad warmer (TC1000 temperature controller)GenericTC1000Dispositivo de controle de temperatura
Induction chamber (Braintree Scientific)Braintree Scientific Inc.GenericPara indução da anestesia
Isoflurane (Isospire)PhoenixGenericAgente anestésico
Meloxicam (Ostilox)VetONE5 mg/mLAgente analgésico
RulerGenericGenericFerramenta de medição para marcos anatômicos
Sterile salineBaxter0.9 Sodium Lot Y425131Solução de irrigação
Surgical blade 15 FST10015-00Ferramenta para incisão da pele
Tuberculin syringeGenericGenericAdministração de medicação
Vaporizer (Surgivet model 100)SurgivetModel 100 S/N W2211123Para manutenção da anestesia
Vetbond tissue adhesiveWorld Precision InstrumentsGenericAdesivo para pele

Referências

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