Artigo de método

In Vitro Diferenciação de Células T CD8 de Memória Residente usando Sistema de Co-cultura Organoide-Célula T Epitelial

DOI:

10.3791/69120

⸱

3 de fevereiro de 2026

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology, Brown University, 2Pathobiology Graduate Program, Brown University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Para estudar a diferenciação e a função das células T CD8 in vitro, as células T CD8 podem ser isoladas do camundongo para serem co-cultivadas a longo prazo com organoides epiteliais vaginais murinos infectados pré-formados. Aqui, descrevemos esse processo e avaliamos a aquisição dos marcadores residentes de células T da memória após a co-cultura.

Resumo

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Os tecidos mucosos barreira desempenham um papel importante na diferenciação e função das células T residentes. Entre as diversas populações celulares presentes nesses tecidos, as células epiteliais são os principais impulsionadores da diferenciação das células T. No entanto, nosso entendimento dos sinais derivados do epitelio que moldam a biologia das células T em ambientes mucosos permanece limitado, em grande parte devido à falta de ferramentas específicas e à complexidade dos sistemas modelo disponíveis. Aqui, descrevemos um sistema de co-cultura vaginal epitelial murino organoide-células T CD8 que modela as interações dinâmicas entre epitélio infectado e células T CD8 específicas do vírus. Esse protocolo permite a análise fenotípica e funcional das respostas das células T dentro de um microambiente epitelial tridimensional fisiologicamente relevante. Usando esse sistema, demonstramos a diferenciação das células T efetoras CD8 em células T de memória residentes no tecido (TRM). Esse versátil sistema de cultura in vitro oferece oportunidades reducionistas para investigar detalhes moleculares dos sinais epiteliais por trás da diferenciação das células T CD8 que governam a imunidade protetora e a imunopatologia nos órgãos barreira.

Introdução

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As células T de memória residentes CD8 (TRMs) representam uma população única de células T CD8 de memória que permanecem permanentemente nos tecidos periféricos sem circularem rotineiramente pelo sangue e tecidos linfoides. Essas células TRM estão estrategicamente posicionadas em órgãos barreira, incluindo pele, pulmões, intestinos e trato reprodutivo, onde atuam como sentinelas contra patógenos e tumoresnascentes 1,2. Após a detecção do patógeno, as células TRM CD8 liberam rapidamente grânulos citotóxicos para eliminar diretamente as células infectadas, enquanto secretam citocinas inflamatórias que alertam as células do tecido ao redor e recrutam efetores imunes circulantes para conter a disseminaçãodo patógeno 3,4. A eficácia dos TRMs CD8 na imunidade antipatógeno, bem como na imunoterapia contra o câncer, já foidemonstrada 5,6. Assim, posicionar uma grande quantidade de TRM CD8 funcionalmente competente nos tecidos mucosos barreira é um objetivo crucial para vacinas e estratégias imunoterapêuticas.

A formação e manutenção do TRM CD8 em órgãos periféricos depende criticamente da programação específica do tecido local. Esses sinais ambientais locais incluem citocinas únicas derivadas de tecidos e agentes metabólicos, bem como interações intercelulares que reforçam coletivamente a identidade TRM específicado tecido 7,8,9. Essa programação tecidual permite que o TRM se adapte às demandas específicas de cada tecido na execução de suas funções de imunosvigilância. No entanto, nossa compreensão da natureza dessas interações é incompleta, devido à falta de sistemas modelo robustos que capturem fielmente esses processos. Modelos animais pequenos, embora muito informativos, frequentemente sofrem de uma rede de interações altamente interconectada e complexa que impede estudos rápidos e de alta produção.

Aqui, descrevemos uma alternativa in vitro ao modelo de camundongo que permitirá a investigação dos detalhes moleculares dos sinais derivados de células epiteliais por trás da diferenciação do TRM CD8. Ao co-cultivar organoides epiteliais vaginais pré-formados (VEOs) com células T CD8 ativadas, geramos TRM CD8 in vitro. Uma descrição detalhada do processo de ativação e co-cultura das células T CD8 permitirá uma adoção mais ampla desse processo nos tecidos, levando a uma maior compreensão das interações celulares que moldam a memória das células T CD8 nos tecidos da linha frontal.

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Protocolo

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Todos os procedimentos envolvendo animais foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Universidade Brown (Protocolo número 22-10-0001).

1. Configuração básica e preparação de uma placa de ativação

  1. Um dia antes de iniciar o experimento, prepare uma placa de cultura de tecidos não tratada para semear com células T CD8 naïfs. Prepare uma solução de anticorpos ativadores em dPBS estéril em concentração final de 1 μg/mL para anti-CD3ε (2C11) e 0,167 μg/mL para B7-1 Fc. Para uma placa de 24 poços, dispense 600 μL dessa solução por poço. Incube durante a noite a 4 °C até estar pronto para uso.
  2. Prepare o Buffer de Enriquecimento de Linfócitos em dPBS estéril adicionando 2% de FBS despojado de carvão e 1 mM de EDTA ao dPBS estéril. Armazene a 4 °C até estar pronto para uso.
  3. Prepare o tampão de lise de amônio-cloreto-potássio (ACK RBC) em ddH2Oadicionando 10 mM de bicarbonato de potássio, 155 mM de cloreto de amônio e 0,1 mM de EDTA. Filtre, esterilize e mantenha em temperatura ambiente.
  4. Prepare a quantidade adequada de meio de colheita no RPMI adicionando 5% de FBS despojado de carvão. Armazene a 4 °C até estar pronto para uso. Para cada camundongo a ser colhido, recomenda-se 50 mL de meio de colheita.
    NOTA: Penicilina/estreptomicina e anfotericina B são opcionais, mas uma concentração final de 100 unidades/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina e 0,2 μg/mL de anfotericina B pode ajudar a prevenir a contaminação bacteriana e fúngica da cultura de células T durante o isolamento de tecido, caso isso apresente um problema.
  5. Prepare o meio de células T no RPMI adicionando 10% de FBS despojado de carvão, 2 mM de L-glutamina, 100 unidades/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 1x aminoácidos não essenciais e 1 mM de piruvato de sódio. Para uma placa de 24 poços, use 2 mL de meio de células T por poço e 50 mL de meio de células T para uma placa completa. Armazene a 4 °C até estar pronto para uso.
  6. Prepare ferramentas de dissecação (tesouras micro dissecadoras de 0,4 mm e pinças serrilhadas micro curvas finas de 0,8 mm) por autoclav em uma bolsa de esterilização ou de molho em 70% de etanol.

2. Colheita e dissociação de órgãos linfoides secundários adultos de camundongos

  1. Resfrie rapidamente uma centrífuga a 4 °C com adaptadores apropriados para armazenar tubos cônicos de 15 mL.
  2. Prepare gelo para o transporte de tecidos e linfócitos durante os períodos de colheita e incubação.
  3. Prepare um tubo cônico estéril de 15 mL com pelo menos 5 mL de meio de colheita por camundongo para ser dissecado.
  4. Anestesiar e eutanasiar um camundongo transgênico adulto CD8 T (~8 semanas) conforme protocolo institucional em um capôs de fluxo laminar.
  5. Prenda os membros do camundongo sobre uma superfície limpa de espuma de poliestireno usando agulhas de qualquer tamanho e borrife o torso com etanol a 70% para evitar que o pelo obstrua a incisão e grude nas ferramentas.
  6. Usando tesouras microdissecadoras limpas e pinças, faça uma incisão abdominal vertical e separe a pele da fina camada de tecido conjuntivo abaixo. Prenda a pele na superfície da espuma de poliestireno usando agulhas de qualquer tamanho e corte o tecido conjuntivo restante para expor os órgãos dentro do torso.
  7. Localize e excise cuidadosamente o baço, removendo o excesso de gordura usando as pinças curvas, e transfira-o para o tubo cônico de 15 mL contendo o meio de colheita. Deixe o baço no gelo e isole o máximo possível de linfonodos (por exemplo, ilíaco e inguinal) para combinar com o baço no mesmo tubo cônico sobre gelo.
    NOTA: Os linfonodos ilíacos estão localizados em ambos os lados da veia cava caudal na região abdominal inferior sob o trato gastrointestinal, e os linfonodos inguinais estão próximos ao ramificamento da veia epigástrica superficial em ambos os lados da pele abdominal inferior do torso. Isolar mais linfonodos para melhorar o rendimento das células T CD8 após o enriquecimento; no entanto, isolar apenas o baço geralmente é suficiente para fornecer vários milhões de células T CD8.
  8. Transfira o baço e os linfonodos para um recipiente marcado de 60 mm e, usando a extremidade plana de um êmbolo de seringa de 3 mL, dissocie mecanicamente o baço e os linfonodos moendo o tecido até que não restem fragmentos grandes.
  9. Colete a suspensão passando-a por um filtro estéril de 70 μm para um tubo cônico estéril novo de 15 mL. Lave a placa de 60 mm com 5 mL de meio de colheita para garantir a transferência completa das células desagregadas e filtre para o mesmo tubo cônico de 15 mL.
  10. Centrifuge a suspensão a 584 × g por 5 minutos a 4 °C. Descarte o sobrenadante e faça o tubo em rack passando a parte inferior rápida e com força pela grade de um suporte de tubo de centrífuga para afrouxar o pellet.
  11. Lisa eritrócitos ressuspendendo o pellet solto em 2 mL de tampão de lise de vermelhos ACK. Faça vórtice e incube em temperatura ambiente por 2 minutos.
  12. Após 2 minutos, neutralize o tampão de lise adicionando 2 mL de meio de colheita. Aspire a suspensão usando uma pipeta sorológica de 5 mL e filtre através de um filtro estéril de 70 μm de volta para o mesmo tubo cônico de 15 mL.
    NOTA: Essa filtragem é importante para garantir a remoção de todos os aglomerados.
  13. Centrifuge a suspensão a 584 × g por 5 minutos a 4 °C. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 950 μL de Buffer de Enriquecimento Linfócito.

3. Enriquecimento e ativação de células T CD8

  1. Prossiga para enriquecer células T CD8 naïves de linfócitos usando um kit de isolamento comercialmente disponível. Siga o protocolo do fabricante.
  2. Uma vez que as células T CD8 tenham sido enriquecidas, transfira a suspensão enriquecida para um novo tubo cônico estéril de 15 mL e preencha o volume até 10 mL com meio de colheita.
  3. Conte usando um hemocitômetro.
    NOTA: De um camundongo adulto, é possível isolar pelo menos 5 a 10 milhões de células T CD8 naïves com pureza de >95%.
  4. Placar pelo menos 500.000 células em 2 mL de meio de células T por poço de uma placa de 24 poços. Misture as células T cuidadosamente antes do revestimento para garantir uma suspensão homogênea de célula única. Suplemente o meio das células T com uma concentração final de 100 unidades/mL de IL-2, 2,5 ng/mL de IL-12 e beta-mercaptoetanol de 55 μM.
  5. Remova a placa de cultura de tecidos previamente revestida com anticorpos dos 4 °C e aspire cuidadosamente a solução de revestimento sem tocar no fundo dos poços.
  6. Imediatamente placam as células T. Incube a 37 °C com 5% de CO2 por 2 dias.

4. Remoção de sinais de ativação e repouso das células T CD8 ativadas

  1. Observe poços ativados sob um microscópio óptico. Após 2 dias de ativação, procure pequenos aglomerados de células T espalhadas pelos poços. Aglomerados maiores indicam mais ativação. Se não houver ou houver poucos aglomerados, incube a placa a 37 °C com 5% de CO2 por mais 1 dia antes de prosseguir com o repouso.
  2. Prepare gelo para armazenar a suspensão de células T durante os períodos de incubação e quando não estiver em uso.
  3. Resuspenda células T usando uma pipeta P1000, pipeteando várias vezes em cada canto do poço. Quando as células T estiverem levantadas, transfira o conteúdo do poço para um tubo cônico estéril de 50 mL e conte.
    NOTA: Lavar cada poço com 1 mL de dPBS é opcional, mas agrupar a lavagem com dPBS com a suspensão de células T pode aumentar o rendimento das células T.
  4. Re-placar as células T na mesma concentração do Passo 3.4, 250.000 células/mL a 2 mL por poço. Prepare a quantidade adequada de meio de células T suplementada com 100 unidades/mL de IL-2 e beta-mercaptoetanol de 55 μM.
  5. Centrifuge a suspensão a 584 × g por 5 minutos a 4 °C, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet no volume apropriado de meio de células T preparado na etapa anterior para o número de poços a serem placados. Misture bem para garantir uma suspensão homogênea de célula única.
  6. Placa 2 mL de suspensão de células T (500.000 células/poço) em uma nova placa de cultura de tecido não tratada, sem revestimento de anticorpos. Incube a 37 °C com 5% de CO2 por 2 dias.

5. Infectar organoides epiteliais vaginais murinos pré-formados com vírus

NOTA: Utilizamos tanto o vírus do Herpes Simplex-2 (HSV-2) quanto o vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV) para realizar infecção viral dos organoides. Ambos são considerados agentes de Nível de Biossegurança 2 (BSL-2). Realize todos os procedimentos envolvendo agentes infecciosos dentro de um gabinete de biossegurança certificado BSL-2. Limpar as áreas de trabalho com 70% de etanol tanto antes quanto após o uso, e descartar todos os materiais conforme as diretrizes institucionais de biossegurança. Para esse protocolo, estabelecemos VEOs a partir de células epiteliais vaginais colhidas do epitélio vaginal de camundongos C57BL/6 fêmeas, conforme descrito antesdo 10.

  1. Placas VEOs em uma densidade de 10.000 células em 20 μL de extrato de membrana basal (BME) por poço de uma placa de 24 poços 7 a 10 dias antes da infecção.
  2. Um dia antes da co-cultura, reserve um poço de VEOs para tripsinização e contagem para obter uma multiplicidade precisa de infecção (MOI). Pré-aqueça 0,25% de Tripsina-EDTA em banho-maria a 37 °C por 5 minutos.
    NOTA: 0,25% de Tripsina-EDTA não será usado durante a infecção; ele é necessário apenas para dissociar os VEOs durante os cálculos do MOI. Revestir os plásticos (ou seja, pontas de pipeta, tubos cônicos) com 2,5% de BSA em dPBS é opcional nessa etapa, mas pode ajudar a reduzir a perda de organoides e células para uma contagem mais precisa.
  3. Aspire o meio de cultura celular do poço designado e lave com dPBS.
  4. Dispense 600 μL de Tripsina-EDTA 0,25% pré-aquecida no poço e ressuspenda completamente com uma pipeta P1000 revestida com BSA para perturbar mecanicamente a EMB. Transfira o conteúdo do poço para um tubo cônico estéril de 15 mL revestido com BSA.
  5. Incube em banho-maria a 37 °C por 5 minutos. Após 5 minutos, adicione 10 mL a 10% de FBS em RPMI para apagar a tripsinização.
  6. Centrifuge a suspensão a 500 x g por 5 minutos a 4 °C. Descarte o sobrenadante e ressuspenda usando uma ponta de pipeta revestida com BSA em 100-300 μL de meio de cultura de células T e organoides ou DMEM/F12 simples.
    NOTA: O volume depende do tamanho do pellet. Se o pellet estiver quase invisível, ressuspenda em volume menor.
  7. Conte usando um hemocitômetro. Calcule a quantidade apropriada de vírus necessária para alcançar 0,1 MOI usando o título viral conhecido e a densidade celular por poço de VEOs, de acordo com a seguinte equação:
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  8. Aspire o meio de cultura celular dos poços VEO para ser infectado e lave com 500 μL de dPBS pré-aquecido (37 °C). Incube os poços com dPBS por 5 minutos a 37 °C.
  9. Após 5 minutos, descarte o dPBS e adicione 500 μL de meio organoide por poço contendo partículas virais suficientes para alcançar um MOI de 0,1. Incube a 37 °C com 5% deCO2 por 1 hora, com um leve movimento manual da placa de cultura a cada 20-30 minutos.
  10. Após a incubação de 1 hora, aspire o meio organoide viral e lave com 500 μL de dPBS pré-aquecido (37 °C). Aspire dPBS e substitua por meio organoide fresco.

6. Co-cultivar células CD8 T com organoides vaginais murinos pré-formados e infectados por vírus

  1. Antes da co-cultura (idealmente 4-24 horas antes), transfira a BME de -80 °C para 4 °C para o descongelamento. Antecipe a quantidade apropriada de BME para descongelar com base no desenho experimental de co-cultura: planeje laminar 8 μL de BME por poço de uma placa de 96 poços e 20 μL de BME por poço de uma placa de 24 poços.
    NOTA: A BME é viscosa, e um período de descongelamento mais longo a 4 °C reduz a viscosidade e melhora a manobrabilidade.
  2. Prepare 2,5% de BSA em dPBS e esterilize com filtro. Use essa solução de BSA para revestir todas as superfícies plásticas que entram em contato com os VEOs (ou seja, pontas de pipeta, tubos cônicos).
    NOTA: Esse revestimento evita que os VEOs aderam à superfície plástica e se percam durante o manuseio.
  3. Verifique os VEOs sob um microscópio óptico para ver o tamanho e a saúde geral. Confirme que os VEOs estão de 7 a 10 dias após a cultura e, em média, têm ~100 micrômetros de diâmetro. VEOs saudáveis apresentam poucas ou nenhuma célula individual e apresentam uma morfologia uniforme e redonda.
    NOTA: Replacar VEOs 1:1 em cocultura se cultivado em uma placa de 24 poços e replacar em uma placa de 24 poços (ou seja, um poço de VEOs resemeará um poço de cocultura célula T-organoide). Se for replacado em uma placa de 96 poços a partir de uma placa de 24 poços, re-replate os VEOs 1:2 (ou seja, um poço de VEOs resemeará dois poços de cocultura célula-T-organoide).
  4. Coloque o número necessário de placas estéreis de cultura de tecidos de 96 ou 24 poços para serem usadas na cocultura na incubadora de 37 °C.
    NOTA: Uma placa aquecida acelerará a adesão e solidificação do BME.
  5. Prepare o meio de cultura de células T e organoides em DMEM/F12 adicionando suplemento de B-27 a 2%, 2 mM de L-glutamina, 100 unidades/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 1x aminoácidos não essenciais, 1 mM de piruvato de sódio e 0,2 μg/mL de anfotericina B. Armazene em 4 °C até estar pronto para uso.
  6. Aspire meios de cultura celular de poços VEO e lave cada poço com 500 μL de dPBS estéril frio (2-8 °C).
  7. Aspire dPBS e adicione 200-500 μL de solução de colheita de organoides fria (2-8 °C) (pelo menos 10 vezes o volume da gotícula organoide BME). Pipete para cima e para baixo com uma pipeta P200 revestida com BSA para perturbar mecanicamente o BME.
  8. Incube a placa com uma sacudida suave (~100 rpm) em um agitador orbital a 4 °C por 20 minutos. Se não houver um shaker orbital frio, incube o prato no gelo com agitação manual a cada 5 minutos. Se a BME não tiver despolimerizado após 20 minutos, alongar o tempo de incubação conforme necessário.
  9. Transfira o conteúdo dos poços usando uma ponta de pipeta revestida com BSA para um tubo cônico estéril de 15 mL ou 50 mL revestido com BSA sobre gelo. Centrifuge a suspensão a 500 × g por 5 minutos a 4 °C.
  10. Descarte o sobrenadante e lave os VEOs com 5-10 mL de dPBS frio (2-8 °C) (pelo menos 10 vezes o volume das gotículas combinadas do organoide do BME). Centrifuge a suspensão a 500 × g por 5 minutos a 4 °C.
  11. Descarte o dPBS e resuspenda o pellet em 1 mL de meio de cultivo de células T e organoides usando uma ponta de pipeta P1000 revestida com BSA. Deixe a suspensão VEO no gelo até que as células T estejam prontas para serem co-cultivadas.
  12. Comece a coletar as células T para co-cultura. Verifique as células T em repouso sob um microscópio óptico para ver tamanho e saúde geral. Sem sinais ativadores, as células T vão desacelerar sua proliferação, mas ainda deveriam ter formado alguns aglomerados. Confirme que não há detritos ou fragmentos celulares, e que as células T apresentam morfologia aumentada. Resuspenda as células T usando uma pipeta P1000 pipetando várias vezes em cada canto do poço e conte o número total de células T CD8 vivas.
    NOTA: Por poço de uma placa de 96 poços, semeie 100.000 células T para cada cocultura em 8 μL de BME. Por poço de uma placa de 24 poços, semente 200.000 células T para cada cocultura em 20 μL de BME.
  13. Centrifuge a suspensão a 584 × g por 5 minutos a 4 °C. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 10 mL de meio de cultura de células T e organoides. Combine células T com VEOs transferindo um número apropriado de células T para que os poços serão placados no tubo cônico contendo os VEOs.
  14. Centrifuge a 584 × g por 5 minutos a 4 °C. Descarte o sobrenadante e resuspenda os VEOs e células T na quantidade apropriada de BME. Misture cuidadosamente usando uma ponta de pipeta revestida com BSA e coloque a placa sobre uma placa de cultura de tecido pré-aquecida, 20 μL por poço de uma placa de 24 poços ou 8 μL por poço de uma placa de 96 poços.
    NOTA: Mantenha o BME no gelo ou em um bloco de resfriamento a 4 °C durante o placagem. Colocar as pontas da pipeta na geladeira de 4 °C por 30 minutos antes do empratado pode ajudar a evitar a solidificação prematura do BME.
  15. Coloque a placa de cabeça para baixo na incubadora de 37 °C e espere 30 minutos para a adesão completa e solidificação do BME.
  16. Durante esse período de incubação, prepare o meio completo de cultivo de células T com organoide adicionando 100 ng/mL de EGF murino, 55 μM beta-mercaptoetanol e 10 unidades/mL de IL-2 murino ao meio de cultura pré-preparado de células T para organoide.
  17. Após o período de incubação, adicione cuidadosamente 500 μL de meio de cultura completo de células T e organoides por poço de uma placa de 24 poços ou 250 μL de meio de cultura completo de células T e organoides por poço de uma placa de 96 poços. Distribua mídia contra as laterais do poço para evitar perturbar a gota de BME. Mude a mídia a cada 2 dias até a colheita para análise.

7. Coleta de células T CD8 co-cultivadas para análise de citometria de fluxo

  1. Quando as coculturas atingem pelo menos o dia 7 em cultura, colheita para análise. Se as células T não expressarem marcadores semelhantes ao TRM em cocultura até o dia 7, otimize a data da colheita entre o dia 7 e 14, dependendo da aquisição fenotípica e da viabilidade das células VEO e T.
  2. Prepare o tampão de separação celular ativada fluorescente (FACS) para coloração e análise de citometria de fluxo, adicionando 0,2% de albúmina sérica bovina em peso e 0,1% em peso e azida de sódio em peso e 0,1% em peso e ácido de sódio ao dPBS.
    NOTA: Azida de sódio é um produto químico agudamente tóxico. Siga as recomendações institucionais no manuseio e descarte de todos os resíduos, em conformidade com as regulamentações institucionais de biossegurança.
  3. Prepare um coquetel de anticorpos fluorescentes em um tampão FACS para coloração superficial, dependendo dos marcadores desejados para análise. Para cada poço, contabilize pelo menos 50 μL de coquetel de anticorpos.
  4. Prepare um corante de viabilidade fluorescente em dPBS. Para cada poço, contabilize pelo menos 50 μL de corante de viabilidade.
  5. Remova cuidadosamente o meio de cada poço e ressuspenda completamente em um buffer FACS frio (2-8 °C), pipetando para cima e para baixo de 10 a 20 vezes para perturbar mecanicamente a BME. Transfira o conteúdo de cada poço para uma placa de fundo arredondado de 96 poços rotulada.
  6. Centrifuge a 859 × g por 2 minutos a 4 °C. Abaixe a rampa de desaceleração para todas as etapas da centrifugação para evitar perda de amostra devido à remixagem de pellets.
  7. Remova o sobrenadante invertendo a placa e expelindo o líquido com um único movimento firme para baixo. Resuspenda em 50 μL de coquetel de anticorpos. Pipete para cima e para baixo pelo menos 5 vezes usando uma pipeta multicanal para garantir uma resuspensão completa do pellet celular.
  8. Incube por 30 minutos a 4 °C ou temperatura ambiente, conforme necessário, protegido da luz. Ao final do período de incubação, adicione 150 μL de dPBS a cada poço usando uma pipeta multicanal e centrífuga a 859 × g por 2 minutos a 4 °C.
  9. Decante o sobrenadante virando a placa de cabeça para baixo e jogando-a para baixo uma vez em um movimento contínuo. Resuspenda em 50 μL de corante de viabilidade. Pipete para cima e para baixo pelo menos 5 vezes usando uma pipeta multicanal para garantir uma resuspensão completa do pellet celular.
  10. Incube por 15 minutos em temperatura ambiente, protegido da luz. Ao final do período de incubação, adicione 150 μL de tampão FACS a cada poço usando uma pipeta multicanal e centrífuga a 859 × g por 2 minutos a 4 °C.
  11. Decante o sobrenadante como antes e resuspenda 150 μL de tampão FACS se as amostras forem processadas imediatamente em um citômetro de fluxo ou fixe 150 μL de paraformaldeído 0,5% e deixe a 4 °C. Pipete para cima e para baixo pelo menos 5 vezes usando uma pipeta multicanal para garantir uma resuspensão completa do pellet celular. Filtre amostras fixas para evitar entupimento do instrumento e funcione em um citômetro de fluxo em 12-36 horas para evitar perda de fluorescência.
    NOTA: O paraformaldeído é considerado um produto químico perigoso. Siga as regulamentações institucionais de biossegurança no manuseio e descarte.

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Resultados

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Visualização microscópica da cocultura organoide infectada por células T CD8
VEOs de camundongos pré-formados foram infectados com LCMV e co-cultivados com células T CD8 específicas para LCMV. Também realizamos essas co-culturas com o modelo de infecção por HSV-2 para estabelecer a versatilidade do protocolo, mas estamos mostrando dados microscópicos para o modelo LCMV e incluímos dados de diferenciação de células T no modelo HSV-2 abaixo. O LCMV expressa proteína flu...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os TRMs CD8 dependem de sinais ambientais locais para diferenciação e manutenção. Esses sinais incutem programação específica para tecidos que permite aos TRMs CD8 se adaptarem ao ambiente e realizarem suas funções de imunosvigilância conforme necessário. Infelizmente, os MRT não sobreviveram in vitro após extração do tecido, o que limitou sua análisedetalhada 12,13. Neste protocolo, fornecemos um método pelo qual as cél...

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Divulgações

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Os autores não têm interesses concorrentes a declarar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esse trabalho foi apoiado pela bolsa R01AI177704-01A1, R21AI183017-01, bolsa inicial da Brown University (para L.K.B.) e F31AI186444 (para Y.L.). Gostaríamos de agradecer ao Dr. Dorian B. McGavern (NINDS, NIH) por fornecer o vírus da coriomeningite linfocítica que expressa YFP. Agradecemos a ajuda do Dr. Sanghyun Lee e de seu laboratório pela ajuda com a imagem de Citação-5 e o núcleo de citometria de fluxo da Brown University para facilitar os ensaios baseados em fluxo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução Aquosa de Paraformaldeído 16%Ciências da Microscopia Eletrônica15710-S
Placas de Cultura de Tissuce de Múltiplos Poços Não Tratadas de Poliestireno de 24 PoçosVWR International10861-558
2-MercaptoetanolGibco21985023
Seringas Estéreis de 3 mLFisher Scientific14-955-457
5 mL,   Snap Cap,   Tubos de ensaio de poliestireno estéreis de fundo arredondadoFalcon352058
Placas de Petri de 60 mmFisher ScientificFB0875713A 
70 & mu; Filtros de Células EstéreisFisher Scientific22-363-548
Microplacas de fundo arredondado de poliestireno não tratado de 96 poçosGreiner Bio-One650101
Placas de cultura de tecidos de poliestireno não tratadas de 96 poçosVWR International10861-562
Albumina bovina/fração VTermo-Química CientíficaJ6465518
Cloreto de AmônioFisher ScientificA661-500
Anfotericina B Sigma-AldrichA9528-100MG
Suplemento B-27Gibco17504044
Leitor Multimodo de Imagem de Células ioTek Cytation 5
DMEM/F12 1:1 MédioCytivaSH30271. FS
Solução de Sal Tamponado com Fosfato da Dulbecco 1xCorning21031CV
Etilenediamina Ácido Tetraacético (Solução de 0,5 M/pH 8,0)Fisher ScientificBP2482-500
Tesoura Micro Dissecadora Extra FinaRoboz Surgical Instrument Co.RS-5882
Soro Bovino Fetal - Tratado com Carvão/DextranoR& Sistemas DS11650
Software Flowjo v10Becton, Dickinson e CompanhiaFlowJo (RRID:SCR_008520)
Pinça GraefeRoboz Surgical Instrument Co.RS-5135
Solução HEPESCytivaSH30237.01
L-Glutamina (200 mM)GibcoA2916801
Magnet 5mLBiolenda480019
Mouse CD8 Naï Kit de Isolamento de Células T veBiolenda480044
Proteína Recombinante EGF do camundongoGibco315091MG
Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100x)Gibco11140050
Solução de penicilina-estreptomicinaCytivaSV30010
Bicarbonato de potássioMP Biomédicos0215255780
CD3 e epsilon purificados anti-camundongo; AnticorpoBiolenda100360
Mouse Recombinante B7.1 (CD80)-Fc Chimera (sem portadoras)Biolenda555406
Mouse-IL-12 Recombinante (p70) (sem suporte)Biolenda577004
Mouse-IL-2 recombinante (sem suporte)Biolenda575406
Extrato de membrana basal com fator de crescimento reduzidoR& Sistemas DBME001-10
RPMI 1640 MediaCytivaSH30027.LS
Azida de SódioFisher ScientificS227I-25
Piruvato de Sódio (100 mM)Gibco11360070
Tripsina 0,25% protease com tripsina suínaCytivaSH30042.02
Corante de Viabilidade (Vermelho 780)Cytek Biosciences13-0865-T100

Referências

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