O eixo Mettl3 / Nrf2 suprime a progressão da doença de Parkinson por meio da inibição da piroptose induzida por NLRP3 em neurônios de serotonina

A doença de Parkinson (DP) é o segundo distúrbio neurodegenerativo mais prevalente entre os idosos, afetando cerca de 2-3% dos indivíduos com 65 anos ou mais, o que representa um fardo significativo para as famílias e a sociedade¹. Embora os mecanismos precisos por trás da DP permaneçam parcialmente compreendidos, evidências acumuladas indicam uma conexão entre o desenvolvimento da DP e os desafios na transmissão neuronal, juntamente com a neuroinflamação impulsionada por células microgliais, que é uma característica comum observada em cérebros envelhecidos e várias doenças neurodegenerativas, incluindo DP 2,3,4,5 . A microglia serve como células imunes inatas dentro do sistema nervoso central (SNC) e é vital para sustentar a homeostase cerebral⁶. No entanto, a superativação persistente dessas microglias pode desencadear respostas neuroinflamatórias crônicas, contribuindo para a progressão da doença neurodegenerativa.

Tanto os processos inflamatórios centrais quanto os periféricos influenciam significativamente a patologia da DP ^7,8. A ativação das células microgliais desencadeia respostas inflamatórias que afetam a sobrevivência neuronal⁹, com evidências emergentes destacando seu priming pela ubiquitina ligases¹⁰. Entre as várias vias inflamatórias, a ativação do inflamassoma contendo NOD, LRR e proteína 3 contendo domínio de pirina (NLRP3) serve como um contribuinte primário para a regulação inflamatória microglial¹¹. A ativação leva à expressão de NLRP3 e subsequente montagem do complexo inflamassoma composto pela proteína adaptadora do domínio de ativação e recrutamento de caspase (CARD) e pró-caspase-1, culminando na clivagem da proteína e liberação de citocinas¹². A ativação elevada do NLRP3 foi observada em pacientes com DP e em vários modelos animais da doença, resultando em morte neuronal. Notavelmente, a inibição do NLRP3 demonstrou efeitos protetores contra a patologia da DP em modelos de camundongos, ressaltando o papel crucial do inflamassoma NLRP3 no início da DP^13,14.

A sinalização da serotonina (5-HT) é um mecanismo significativo de regulação neural, influenciando vários comportamentos e funções fisiológicas por meio de interações com pelo menos 14 subtipos de receptores pós-sinápticos^15,16, incluindo papéis na patologia do SNC, conforme detalhado em visões gerais abrangentes¹⁷. A extensa influência neuromoduladora do sistema 5-HT é governada por aproximadamente 26.000 neurônios no cérebro de roedores¹⁸. Embora a literatura substancial associe a DP predominantemente à perda de neurônios dopaminérgicos, a relação entre os neurônios 5-HT e a DP é menos examinada.

A modificação da N6-metiladenosina (m6A), a modificação de mRNA mais prevalente em células eucarióticas, é fundamental para regular o splicing, a estabilidade e a exportação de mRNA, influenciando assim várias atividades celulares¹⁹. Os níveis de m6A são modulados por metiltransferases e desmetilases. Modificações elevadas de m6A no cérebro têm sido associadas ao neurodesenvolvimento, com sua desregulação intimamente ligada a condições neurodegenerativas^20,21, incluindo expressão alterada de METTL3 em modelos de Alzheimer²². Por exemplo, o acúmulo de metiltransferase 3 (METTL3) na fração insolúvel de tecidos cerebrais post-mortem de pacientes com Alzheimer foi positivamente correlacionado com os níveis de proteína Tau insolúvel²³. Além disso, uma diminuição significativa nos níveis de m6A no estriado pode levar a um declínio substancial nos níveis de neurotransmissores dopaminérgicos²⁴. Notavelmente, doze polimorfismos de nucleotídeo único relacionados a m6A mostraram associações significativas com a suscetibilidade à DP²⁵. Este protocolo estabelece metodologias abrangentes para investigar como as modificações m6A mediadas por METTL3 regulam a piroptose microglial através do eixo Nrf2 / NLRP3, afetando a sobrevivência dos neurônios serotoninérgicos em modelos de DP. O modelo MPTP agudo in vivo e o modelo LPS in vitro foram selecionados por sua indução robusta de respostas neuroinflamatórias, embora paradigmas crônicos possam complementar estudos futuros, conforme discutido abaixo.

Todos os experimentos com animais foram conduzidos sob a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Popular de Feicheng (número de aprovação IACUC-2024-118) e realizados em estrita conformidade com as diretrizes institucionais e princípios éticos estabelecidos para pesquisas com animais de laboratório. Os protocolos do estudo garantiram cuidados e tratamento humanos de todos os animais, com ênfase particular na minimização do sofrimento e angústia, ao mesmo tempo em que aderiram aos padrões institucionais e às diretrizes ARRIVE para práticas responsáveis de pesquisa com animais.

1. Cultura celular e modelo de ativação microglial

1. Preparação e manutenção de células BV2
   1. Descongele rapidamente os estoques de células microgliais BV2 congeladas em banho-maria a 37 °C por 2 min, garantindo um giro suave para evitar choque térmico.
   2. Centrifugue a suspensão de células descongeladas a 300 × g por 5 min em temperatura ambiente (RT) para remover o crioprotetor.
   3. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 10 mL de meio DMEM completo com alto teor de glicose suplementado com 10% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina e 2 mM de L-glutamina.
   4. Realizar avaliação da viabilidade celular usando o método de exclusão de azul de tripano (misturar 10 μL de suspensão celular com 10 μL de azul de tripano a 0,4%, contar usando hemocitômetro), garantindo >95% de viabilidade antes de prosseguir.
   5. Células em placa em frascos de cultura T75 a uma densidade de 1 × 10⁶ células por frasco e manter em uma incubadora de cultura de células umidificada a 37 ° C com 5% de CO₂.
   6. Células de passagem a cada 48 h ao atingir 80-85% de confluência usando procedimentos padrão de tripsinização.
      NOTA: Mantenha números de passagens consistentes (passagens 3-8) para garantir respostas inflamatórias reprodutíveis. Todos os experimentos de cultura de células foram repetidos independentemente pelo menos três vezes, com três réplicas técnicas por condição para minimizar a variabilidade.
2. Ativação microglial induzida por LPS
   1. Semeie células BV2 em placas de 6 poços a 2 × 10⁵ células por poço em 2 mL de meio completo 24 h antes do tratamento.
   2. Prepare a solução-mãe de LPS a 1 mg / mL em PBS estéril, esterilize por filtro através de um filtro de 0,22 μm e armazene em alíquotas de uso único a -20 ° C.
   3. Valide a atividade do LPS usando o ensaio Limulus Amebocyte Lysate (LAL) para confirmar a concentração de endotoxina antes de cada experimento²⁶.
   4. Diluir o estoque de LPS para uma concentração de trabalho de 1 μg / mL em DMEM sem soro imediatamente antes do uso.
   5. Remova o meio de cultura dos poços e lave as células duas vezes com PBS estéril.
   6. Adicione 2 mL de meio contendo LPS (concentração final de 1 μg/mL) aos poços de tratamento e DMEM sem soro aos poços de controle.
   7. Incube as células por 24 h a 37 ° C com 5% de CO₂ para ativação inflamatória.
   8. Inclua poços de controle positivo tratados com fator de necrose tumoral (TNF)-α de 100 ng/mL e poços de controle negativo com veículo apenas (PBS) para validar a resposta inflamatória.
      NOTA: Prepare uma solução fresca de LPS para cada experimento para manter a bioatividade consistente. Se a resposta inflamatória for fraca (por exemplo, aumento de <2 vezes nas citocinas), verifique a estabilidade do reagente ou estenda a incubação para 48 h.
3. Superexpressão e knockdown de Mettl3
   1. Projete e sintetize pequenas sequências de RNA interferente (siRNA) direcionadas a Mettl3 e sequências de controle embaralhadas usando protocolos padrão de síntese de oligonucleotídeos. Selecione sequências-alvo da região codificadora do mRNA Mettl3 (acesso GenBank: NM_019721) com comprimento de nucleotídeo 19-21, garantindo conteúdo de GC de 40-60%²⁷.
   2. Valide sequências de siRNA usando a análise BLAST para confirmar a especificidade e evitar efeitos fora do alvo (garanta <70% de homologia com genes não-alvo).
   3. Prepare vetores de superexpressão contendo cDNA Mettl3 de comprimento total clonado no vetor pcDNA3.1 usando locais de restrição EcoRI e XhoI.
   4. Células transfectadas a 70-80% de confluência usando um reagente de transfecção lipídica catiônica:
      1. Misture 2 μL de reagente de transfecção lipídica catiônica com 50 pmol siRNA ou 2 μg de DNA de plasmídeo em 100 μL de meio Opti-MEM.
      2. Incube a mistura por 15 min em RT.
      3. Adicione o complexo de transfecção gota a gota às células e incube por 4-6 h antes de mudar para um meio completo fresco.
   5. Incubar células transfectadas por 48 h antes do tratamento com LPS para permitir alterações adequadas na expressão de proteínas.
   6. Confirme a eficiência da transfecção usando a cotransfecção fluorescente repórter (100 ng de pEGFP-C1 por poço), visando >70% de eficiência por microscopia de fluorescência antes de prosseguir.

2. Desenvolvimento de modelos animais e desenho experimental

1. Preparação e randomização de animais
   1. Obtenha camundongos C57BL/6J do Vital River Laboratory, garantindo proporções iguais entre machos e fêmeas, com 8 semanas de idade, pesando 19-26 g.
   2. Animais domésticos em condições específicas livres de patógenos (FPS) com ciclo claro-escuro de 12:12 h, temperatura controlada (22 ± 2°C) e umidade (50-60%).
   3. Permita um período de aclimatação de 7 dias com acesso ad libitum à ração e água padrão.
   4. Realize avaliações comportamentais basais durante a aclimatação: Realize avaliações comportamentais abrangentes, incluindo teste de colocação do membro anterior (10 tentativas de cada lado), avaliação acelerada do rotarod (4-40 rpm em 5 min) e análise da atividade locomotora em campo aberto (sessões de 10 min em um aparelho de 50 cm × 50 cm × 50 cm)28,29,30.
   5. Atribua aleatoriamente animais a grupos experimentais (n = 6 por grupo) usando randomização computadorizada para minimizar o viés: simulação, Modelo, Modelo + Nrf2-KD, Modelo + oe-Nrf2.
   6. Implemente um projeto experimental cego em que os investigadores que realizam avaliações comportamentais não tenham conhecimento das atribuições do grupo.
2. Modelo de doença de Parkinson induzida por 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP)
   1. Prepare a solução de MPTP a 30 mg / kg em solução salina estéril imediatamente antes da injeção, dissolvendo 15 mg de cloridrato de MPTP em 5 mL de solução salina estéril e ajustando o volume com base no peso do animal.
      CUIDADO: O MPTP é altamente neurotóxico. Manuseie uma capela de exaustão química com equipamento de proteção individual adequado, incluindo luvas duplas e jaleco.
   2. Administre MPTP via injeção intraperitoneal a 30 mg / kg de peso corporal (volume de injeção de 10 mL / kg) por três dias consecutivos no mesmo horário todos os dias (09:00 ± 30 min).
   3. Injectar animais simulados do grupo com volumes equivalentes de solução salina estéril seguindo um esquema de injecção idêntico.
   4. Monitore os animais quanto a sinais de sofrimento, perda de peso (>15% considerado desfecho) ou reações adversas diariamente durante o período de administração do MPTP usando folhas de pontuação padronizadas.
   5. Mantenha os animais por 8 dias após a injeção final para permitir o desenvolvimento da neurodegeneração.
      NOTA: Os animais podem ser alojados normalmente durante este período com monitoramento contínuo.
3. Injeção viral estereotáxica
   1. Preparar vetores virais AAV9 por transfecção tripla de células HEK293T usando polietilenimina (PEI; proporção DNA:PEI de 1:3), colher em 72 h após a transfecção, purificar usando ultracentrifugação de gradiente de iodixanol (177.000 × g por 2 h) e concentrar usando dispositivos de filtro centrífugo para atingir 1 × 10¹² cópias do genoma / mL.
   2. Valide o título viral por meio da reação em cadeia da polimerase quantitativa (PCR) usando primers direcionados às regiões ITR, garantindo que os títulos atinjam 1 × 10¹² cópias do genoma/mL com análise de curva padrão.
   3. Valide o título viral usando PCR quantitativo baseado em SYBR Green com primers específicos para ITR, realizando diluições seriais de padrões conhecidos e calculando cópias do genoma usando análise de curva padrão. Confirme a ausência de contaminação viral competente para replicação usando o ELISA p24.
   4. Anestesiar camundongos com isoflurano (indução a 3%, manutenção a 1,5-2%) administrado a 0,8-1,0 L/min de fluxo de oxigênio através de um cone nasal, monitorando a frequência respiratória (60-100 respirações/min) e o reflexo de pinça do dedo do pé durante todo o procedimento. Prenda o mouse na estrutura estereotáxica e aplique pomada oftálmica para evitar o ressecamento da córnea.
   5. Prenda o mouse na estrutura estereotáxica e aplique pomada oftálmica para evitar o ressecamento da córnea.
   6. Faça uma incisão no couro cabeludo na linha média de 1,5 cm usando uma lâmina de bisturi estéril e identifique o ponto de referência do bregma usando coordenadas estereotáxicas com precisão de 0,1 mm.
   7. Calcule as coordenadas de injeção para o estriado: ântero-posterior -0,5 mm, médio-lateral ±2,0 mm, dorsal-ventral -3,0 mm do bregma.
   8. Realize injeções piloto com traçador fluorescente (por exemplo, proteína fluorescente verde [GFP]) para validar a precisão do direcionamento, confirmando >80% de colocalização com marcadores microgliais (Iba1) via imuno-histoquímica antes das injeções experimentais.
   9. Abaixe a agulha de injeção (33-G) até a profundidade alvo a uma taxa de 1 mm/min e injete 2 μL de suspensão viral a 0,2 μL/min usando uma bomba de microseringa com um controlador automatizado. Abaixe a agulha de injeção até a profundidade alvo e injete 2 μL de suspensão viral a uma taxa de 0,2 μL / min usando uma bomba de microsseringa.
   10. Mantenha a posição da agulha por 5 minutos após a injeção para evitar o refluxo.
   11. Retire lentamente a agulha a uma taxa de 0,5 mm/min, feche a incisão com suturas de seda 4-0 usando um padrão interrompido e permita a recuperação da anestesia em uma almofada de recuperação aquecida.
   12. Administre analgesia pós-operatória (carprofeno 5 mg/kg por via subcutânea uma vez ao dia por 3 dias) e monitore a recuperação por 24 horas com fichas de observação detalhadas.

3. Técnicas de biologia molecular e validação

1. Extração de RNA e controle de qualidade
   1. Colher amostras de células ou tecido cerebral estriado imediatamente após os parâmetros experimentais, sacrificando animais humanamente por inalação de CO₂ seguida de luxação cervical; dissecar o tecido no gelo, pique finamente e dissocie enzimaticamente com tripsina a 0,25% por 10 min a 37 ° C se estiver colhendo células.
   2. Extraia o RNA total usando o reagente TRIzol (1 mL por 1, 10,⁶ células ou 100 mg de tecido) com homogeneização mecânica (20-25 golpes em um homogeneizador dounce) e separação de fase de clorofórmio (0,2 mL de clorofórmio por 1 mL de TRIzol).
   3. Avalie a qualidade do RNA usando espectrofotometria (razão A260 / A280 1,8-2,0) e eletroforese em gel (agarose a 1%) para confirmar as bandas ribossômicas 28S e 18S.
   4. Quantificar a concentração de RNA usando um espectrofotômetro.
   5. Armazenar amostras de RNA a -80 °C em água livre de nuclease a -80 °C com adição de inibidor de RNase (40 unidades/μL) até à análise.
2. Fracionamento nuclear-citoplasmático
   1. Colha as células (2 × 10⁶ no mínimo) e lave duas vezes com PBS gelado (5 mL por lavagem, 5 min de centrifugação a 300 × g).
   2. Utilize um kit de fracionamento de células comerciais com o seguinte protocolo.
      1. Ressuspenda o pellet celular em 200 μL de tampão de extração citoplasmática com inibidores de protease.
      2. Incube no gelo por 10 min com vórtice a cada 3 min.
      3. Centrifugar a 16.000 × g durante 5 min a 4 °C e recolher o sobrenadante (fracção citoplasmática).
      4. Lavar o pellet duas vezes com tampão de extracção citoplasmática.
      5. Ressuspenda o pellet em 100 μL de tampão de extração nuclear.
      6. Incube no gelo por 40 min com vórtice a cada 10 min.
      7. Centrifugar a 16.000 × g durante 10 min a 4 °C e recolher o sobrenadante (fracção nuclear)
   3. Valide a eficiência do fracionamento analisando a distribuição do marcador nuclear (U6) e do marcador citoplasmático (GAPDH) usando Western blot.
   4. Extrair o RNA das frações nuclear e citoplasmática separadamente.
   5. Analise os níveis de mRNA de Nrf2 em cada fração usando RT-qPCR com genes de referência específicos de fração.
3. PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR)
   1. Sintetize o cDNA a partir de 1 μg de RNA total usando um kit de reagentes de transcrição reversa com primers aleatórios.
   2. Realize qPCR usando o kit Premix Ex Taq II com primers específicos para genes em um sistema de PCR em tempo real.
   3. Valide a especificidade do primer usando a análise da curva de fusão e confirme um único amplicon por eletroforese em gel.
   4. Utilizar as seguintes condições de ciclagem térmica: desnaturação inicial a 95 °C durante 10 min, seguida de 40 ciclos a 95 °C durante 15 s, 60 °C durante 30 s e 72 °C durante 30 s.
   5. Calcule os níveis relativos de expressão de mRNA usando o método ^2-ΔΔCt com β-actina como referência interna.
   6. Inclua controles sem modelo e valide a estabilidade do gene de referência em condições experimentais usando a análise geNorm (valor de estabilidade M < 0,5).
      NOTA: Pontuações de reprodutibilidade: coeficiente de variação (CV) intra-ensaio <10% em três ensaios independentes.
4. MeRIP-qPCR para análise de modificação de m6A
   1. Extrair o ARN total (mínimo 20 μg) e fragmentar a 100-200 nucleótidos utilizando o reagente de fragmentação do ARN (10 mM ZnCl₂, 10 mM Tris-HCl, pH 7,0) a 70 °C durante 5 min.
   2. Realize a imunoprecipitação usando anticorpo específico para m6A (2 μg por 20 μg de RNA) durante a noite a 4 ° C com rotação (10 rpm) em tampão de imunoprecipitação (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 750 mM NaCl, 0,5% NP-40).
   3. Valide a especificidade do anticorpo usando controles de RNA modificados e não modificados por m6A conhecidos.
   4. Lave os complexos imunoprecipitados cinco vezes com tampão de lavagem.
   5. RNA ligado a eluíte e transcrição reversa usando primers aleatórios.
   6. Transcreve reversamente o RNA eluído usando primers aleatórios e realiza análise de qPCR usando primers específicos para Nrf2 cobrindo locais potenciais de m6A.
   7. Realize a análise de qPCR usando primers específicos para Nrf2 e calcule o enriquecimento em relação ao RNA de entrada.
      NOTA: Se a detecção for inconsistente, otimize o tempo de fragmentação (4-6 min) para melhorar a reprodutibilidade; referência quantitativa: relação sinal-ruído >15:1 em comparação com controles IgG.

4. Análise e validação de proteínas

1. Extração e quantificação de proteínas
   1. Lise células (1 × 10⁶ células) ou homogeneizar amostras de tecido (100 mg de tecido estriado) em 200 μL de tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) contendo inibidores de protease (1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF), 1 μg/mL de leupeptina, 1 μg/mL de pepstatina A) e inibidores da fosfatase (1 mM de ortovanadato de sódio, 5 mM de fluoreto de sódio).
   2. Incubar lisados em gelo por 30 min com vórtice periódico (a cada 10 min por 10 s).
   3. Centrifugue a 12.000 × g por 15 min a 4 ° C para remover os detritos celulares e coletar o sobrenadante.
   4. Quantificar a concentração de proteínas usando o ensaio de ácido bicinconínico (BCA) com padrões de albumina sérica bovina (0, 25, 125, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000 μg / mL) em medições triplicadas.
   5. Valide a integridade da proteína analisando os níveis de proteína de manutenção (GAPDH, MW esperado: 36 kDa) em todas as amostras usando Western blot.
2. Análise de Western blot
   1. Prepare amostras de proteína com carga igual (30-50 μg) em tampão de carga de eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio e poliacrilamida (SDS-PAGE) (concentrações finais: 62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 10% glicerol, 5% β-mercaptoetanol, 0,003% azul de bromofenol) e desnature a 95 ° C por 5 min.
   2. Separe as proteínas por SDS-PAGE usando géis de poliacrilamida a 10%, funcionando a 80 V por 30 min, seguido de 120 V por 90 min em tampão Tris-glicina-SDS.
   3. Transfira proteínas para membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF) usando um sistema de transferência semi-seco (400 mA por 90 min) em tampão de transferência (25 mM Tris, 192 mM glicina, 20% de metanol).
   4. Confirme a eficiência da transferência usando coloração reversível de proteína (Ponceau S: 0,1% em ácido acético a 5% por 5 min) antes de prosseguir para a incubação de anticorpos.
   5. Bloqueie as membranas com 5% de leite desnatado em TBST (TBS + 0,1% Tween-20) por 1 h em RT com agitação suave.
   6. Incubar com anticorpos primários diluídos a 1:1000 em tampão de bloqueio durante a noite a 4 °C com agitação suave.
   7. Lave as membranas três vezes com TBST (10 min cada) e incube com anticorpos secundários conjugados com HRP (diluição 1:5000) por 1 h em RT.
   8. Detecte bandas de proteínas usando quimioluminescência aprimorada e quantifique usando densitometria.
   9. Normalize a expressão da proteína-alvo para controle de carga (GAPDH) e valide a especificidade do anticorpo usando controles apropriados (bloqueio de peptídeos para anticorpos primários, controles somente secundários).

5. Avaliação comportamental e análise funcional

1. Teste de colocação do membro anterior
   1. Permitir que o rato se adapte ao ambiente de ensaio (sala silenciosa, 22 °C, iluminação fraca) durante 30 minutos antes da avaliação.
   2. Segure o mouse suavemente pela pele dorsal, suspendendo todos os quatro membros aproximadamente 0.5 cm acima da borda da mesa, garantindo que o mouse não possa ver a superfície da mesa.
   3. Escove as vibrissas de cada lado contra a borda da mesa para acionar o reflexo de colocação e registrar a colocação bem-sucedida do membro anterior em 2 s.
   4. Realize 10 tentativas de cada lado com intervalos de 30 s entre as tentativas, alternando os lados esquerdo e direito.
   5. Realize testes em condições de iluminação consistentes (50-100 lux) e hora do dia (13:00-17:00) para minimizar as influências circadianas.
   6. Calcule a taxa de sucesso como uma porcentagem de colocações bem-sucedidas: (colocações bem-sucedidas/total de tentativas) × 100.
2. Acelerando o teste de rotarod
   1. Defina o aparelho rotarod para uma velocidade inicial de 4 rpm com aceleração linear para 40 rpm durante 5 min de duração.
   2. Treine camundongos no rotarod por 3 dias consecutivos (3 tentativas por dia, intervalos de 15 minutos) antes de testar para minimizar os efeitos do aprendizado.
   3. Padronize as condições de teste, incluindo RT (22 ± 2 °C), iluminação (100 lux) e níveis de ruído de fundo (<50 dB).
   4. Coloque o mouse na haste giratória voltada para a frente e inicie o protocolo de aceleração imediatamente.
   5. Registre a latência de queda (tempo desde o início até o mouse cair ou completar o teste de 5 minutos) para cada teste, testando 5 vezes por animal com intervalos de descanso de 15 minutos.
   6. Calcule a latência média das três tentativas mais longas para minimizar a variabilidade devido a fatores motivacionais.
3. Ensaio em campo aberto
   1. Use um aparelho de campo aberto (50 cm × 50 cm × caixa de acrílico transparente de 50 cm) com um sistema de rastreamento de vídeo posicionado 1 m acima da arena.
   2. Limpe o aparelho com etanol 70% entre os animais (spray e limpe, 5 minutos de secagem ao ar) para eliminar sinais de odor.
   3. Coloque o mouse no centro do aparelho e grave a atividade por 10 min sob iluminação consistente (200 lux) com captura de vídeo a 30 fps.
   4. Analise vários parâmetros usando software de rastreamento automatizado:
      Distância total percorrida (cm)
      Hora do fuso central (definida como 10 cm das paredes, relatada em s)
      Velocidade de movimento (cm/s)
      Tempo gasto na periferia vs zonas centrais
4. Defina a zona central como 10 cm das paredes e quantifique o tempo gasto e a distância percorrida no centro versus as zonas periféricas.

6. Microscopia e imagem latente avançadas

1. Coloração DHE para detecção de ROS
   1. Preparar a solução fresca de dihidroetídio (DHE) a 10 μM em PBS imediatamente antes da utilização (proteger da luz).
   2. Realize a coloração de co-imunofluorescência combinando DHE com anticorpo triptofano hidroxilase 2 (TPH2) (diluição 1:500) para identificar especificamente os neurônios da serotonina.
      NOTA: Esta abordagem de marcação dupla permite a discriminação da produção de ROS dentro de corpos celulares neuronais positivos para TPH2 a partir do estresse oxidativo nas células gliais circundantes, com base no princípio de que o DHE, após a oxidação pelo superóxido, forma produtos fluorescentes impermeáveis à membrana que permanecem localizados dentro da célula de origem.
   3. Incubar cortes de tecido (20 μm de espessura) com solução de DHE por 30 min a 37 °C em condições escuras em uma câmara umidificada.
   4. Inclua controles negativos (sem DHE) e controles positivos (tratamento com 100 μM H₂O₂ por 30 min) para validar a especificidade de detecção de ROS.
   5. Lave as seções três vezes com PBS e monte com meio de montagem anti-desbotamento.
   6. Imagem usando microscopia de fluorescência (DHE: excitação de 518 nm/emissão de 605 nm, TPH2: excitação de 488 nm/emissão de 525 nm) com configurações de exposição consistentes (200 ms) entre as amostras; Os sistemas de imagem foram calibrados semanalmente usando esferas de fluorescência padrão (relação sinal-ruído > 20:1).
   7. Quantifique a intensidade de fluorescência em células positivas para TPH2 apenas usando o software ImageJ com protocolos de análise padronizados (limiar: 50-255, tamanho de partícula: 10-∞ pixels²). Estabeleça limites de ROI com base na imunorreatividade TPH2 para garantir a medição do estresse oxidativo especificamente nos neurônios serotoninérgicos, excluindo o sinal da microglia adjacente, astrócitos ou outros tipos de células. Para cada animal, analise um mínimo de 50 neurônios positivos para TPH2 em várias seções de tecido.
2. Imuno-histoquímica
   1. Fixe as seções de tecido em paraformaldeído a 4% em PBS por 24 h a 4 ° C com agitação suave.
   2. Desidratar através de uma série graduada de etanol (70%, 80%, 90%, 95%, 100% × 2, 1 h cada) e embutir em parafina usando um processador automatizado.
   3. Corte seções de 5 μm usando um micrótomo e monte em lâminas de vidro carregadas, garantindo 3-4 seções por lâmina.
   4. Desparafinizar seções usando xileno (2 × 10 min) e reidratar através de etanol graduado para água.
   5. Realize a recuperação do antígeno usando tampão citrato (citrato de sódio 10 mM, pH 6,0) em um micro-ondas (750 W por 10 min com intervalos de resfriamento de 2 min).
   6. Valide a especificidade do anticorpo usando controles negativos apropriados (sem anticorpo primário) e tecidos de controle positivo (seções cerebrais conhecidas por expressar proteínas-alvo).
   7. Bloqueie a atividade da peroxidase endógena com peróxido de hidrogênio a 3% em metanol por 10 min em RT.
   8. Aplicar anticorpos primários durante a noite a 4 °C numa câmara humidificada.
   9. Detecte usando anticorpos secundários conjugados com HRP (diluição de 1:500, 1 h em RT) e cromogênio DAB (incube até que a cor marrom se desenvolva, normalmente 2-5 min).
   10. Contra-coloração com hematoxilina (30 s), desidratar, limpar e montar com meio de montagem permanente.
   11. Quantifique células positivas usando métodos estereológicos com amostragem aleatória sistemática (a cada 5ª seção, 3 quadros de contagem por seção, ampliação de 40×).

7. Análise estatística e validação dos dados

1. Desenho e análise estatística
   1. Realize a análise de poder para determinar tamanhos de amostra adequados para detectar diferenças biologicamente significativas (tamanho do efeito ≥ 0,8, ≥ de poder 0,80, α = 0,05) usando o software G*Power 3.1.9.7.
   2. Validar a normalidade dos dados usando o teste de Shapiro-Wilk e avaliar a homogeneidade da variância usando o teste de Levene antes da análise paramétrica.
   3. Analisar dados usando um software estatístico com testes estatísticos apropriados baseados em desenho experimental e distribuição de dados.
   4. Aplique a análise de variância (ANOVA) unidirecional para comparações de fator único e ANOVA bidirecional para experimentos fatoriais (por exemplo, interações de tratamento × tempo).
   5. Utilizar o teste post hoc de Tukey para comparações múltiplas quando a ANOVA apresentar significância (p < 0,05), aplicando a correção de Bonferroni quando apropriado.
   6. Defina o limite de significância estatística em p < 0,05 para todas as análises com notação adicional para p < 0,01 e p < 0,001.
   7. Relate tamanhos de efeito (d de Cohen ou η²) e intervalos de confiança de 95% juntamente com valores-p para fornecer uma interpretação estatística abrangente.
   8. Apresentar dados como média ± SEM de um mínimo de três experimentos independentes, com pontos de dados individuais mostrados quando n ≤ 10.
      NOTA: Todos os experimentos de cultura de células devem ser repetidos independentemente pelo menos três vezes, com cada experimento incluindo controles apropriados e múltiplas réplicas técnicas, e a variabilidade observada (por exemplo, CV <15% para dados comportamentais) foi minimizada por meio de cegamento e tempo padronizado.

O protocolo demonstra com sucesso que a expressão de Mettl3 diminui em células microgliais tratadas com LPS (Figura 1), conforme evidenciado por reduções no nível de mRNA e proteína em comparação com os grupos de controle (Figura 1B, C). A análise ELISA confirma a ativação inflamatória mediada por LPS bem-sucedida por meio de níveis elevados de IL-6 e TNF-α em sobrenadantes de cultura (Figura 1A).

A análise MeRIP-qPCR revela que a superexpressão de Mettl3 aumenta a metilação do mRNA m6A do Nrf2, o que paradoxalmente aumenta a estabilidade e a expressão da proteína em vez de promover a degradação, consistente com evidências emergentes de que as modificações do m6A podem aumentar a eficiência da tradução em contextos celulares específicos (Figura 2A, B). Experimentos de fracionamento nuclear-citoplasmático demonstram que, embora a distribuição do mRNA do Nrf2 permaneça inalterada entre os compartimentos celulares, os níveis de proteína são significativamente modulados pelo status de expressão de Mettl3 ( Figura 2C , D ).

Experimentos in vivo usando modelos de DP induzidos por MPTP mostram que os déficits comportamentais se correlacionam com mudanças moleculares no eixo Mettl3 / Nrf2. Todas as amostras de tecido foram obtidas da região estriatal (coordenadas: +0,5 a -0,5 mm do bregma, ±1,5 a ±2,5 mm lateral, -2,5 a -3,5 mm ventral). Os camundongos do grupo Modelo exibem precisão reduzida de posicionamento do membro anterior, diminuição do desempenho do rotarod e diminuição da atividade em campo aberto em comparação com os controles simulados (Figura 3A). O knockdown de Nrf2 exacerba esses déficits, enquanto a superexpressão de Nrf2 fornece proteção parcial. A análise imuno-histoquímica revela diminuição das populações microgliais (células positivas para Iba1) nas regiões estriatais dos modelos de DP, com a modulação do Nrf2 afetando a sobrevivência microglial de acordo (Figura 3B).

Os níveis de citocinas pró-inflamatórias (IL-1β, IL-18, TNF-α) aumentam significativamente nos modelos de doenças, conforme esperado, com o grupo Modelo apresentando níveis elevados em comparação com os controles simulados e a superexpressão de Nrf2 fornecendo efeitos anti-inflamatórios (Figura 3C). A análise molecular demonstra marcadores elevados de piroptose, incluindo GSDMD-N, caspase-1 clivada e NLRP3 em animais tratados com MPTP, com resultados corrigidos de Western blot mostrando marcadores de peso molecular adequados (Figura 3D). A microscopia eletrônica de varredura confirma o aumento da formação de corpos piroptóticos em animais doentes, com a modulação Nrf2 afetando a extensão da morte celular piroptótica (Figura 3E).

A coloração DHE combinada com imunofluorescência TPH2 revela níveis elevados de ROS especificamente em neurônios de serotonina de modelos de DP (Figura 4A). A co-localização de produtos de oxidação de DHE dentro de corpos celulares positivos para TPH2 indica geração de superóxido endógeno nesses neurônios, consistente com disfunção mitocondrial induzida por citocinas inflamatórias e defesas antioxidantes prejudicadas. A distribuição espacial do sinal DHE corresponde à morfologia neuronal em vez da oxidação difusa do tecido, suportando o estresse oxidativo específico do tipo de célula. A imuno-histoquímica mostra diminuição da expressão dos marcadores de neurônios serotoninérgicos TPH2 e SLC6A4 nos grupos Modelo e Modelo + Nrf2-KD, com efeitos protetores observados no grupo Modelo + oe-Nrf2 (Figura 4B). Esses achados indicam que a piroptose microglial leva ao estresse oxidativo e subsequente dano aos neurônios da serotonina.

A via mecanicista geral está resumida na Figura 5, que ilustra como a modificação m6A mediada por Mettl3 de Nrf2 suprime a piroptose microglial e protege os neurônios da serotonina.

Experimentos bem-sucedidos geralmente mostram relações claras de dose-resposta entre os níveis de expressão de Mettl3 / Nrf2 e os marcadores inflamatórios a jusante. Resultados abaixo do ideal podem ocorrer devido à transdução viral incompleta, ativação inadequada do LPS ou problemas técnicos durante o processamento do tecido. Os experimentos de controle demonstram consistentemente a especificidade adequada do anticorpo e a ausência de ligação inespecífica nas análises imuno-histoquímicas. A eficiência da infecção viral no estriado foi validada por meio da co-localização com os marcadores Iba1 e NeuN, confirmando o direcionamento microglial predominante.

Figura 1: Subexpressão de Mettl3 em células microgliais induzidas por LPS. (A) Medição ELISA dos níveis de IL-6 e TNF-α em células microgliais tratadas com LPS. (B) Medição de RT-qPCR dos níveis de mRNA de Mettl3 em células microgliais tratadas com LPS. (C) Medição de Western blot dos níveis de proteína Mettl3 em células microgliais tratadas com LPS mostrando Mettl3 a 64 kDa e GAPDH a 36 kDa. **Os dados representam a média ± EPM, n = 6 por grupo. *p < 0,05, p < 0,01 vs. grupo controle. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Mettl3 afeta a tradução de Nrf2 por meio da modificação de m6A em células microgliais induzidas por LPS. (A) Medição de RT-qPCR dos níveis de mRNA Nrf2 nos grupos oe-NC e oe-Mettl3. (B) Medição MeRIP-qPCR dos níveis de metilação de Nrf2 nos grupos oe-NC e oe-Mettl3. (C) Medição de RT-qPCR dos níveis de mRNA de Nrf2 no núcleo e citoplasma de grupos experimentais. (D) Medição de Western blot dos níveis de proteína Nrf2 em grupos experimentais mostrando Nrf2 a 110 kDa e GAPDH a 36 kDa. **Os dados representam a média ± EPM, n = 6 por grupo. *p < 0,05, p < 0,01 vs. grupo controle. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Demonstração in vivo do eixo Mettl3 / Nrf2 desencadeando piroptose microglial através do inflamassoma NLRP3. (A) Avaliações comportamentais, incluindo colocação de membros anteriores, rotarod e testes de campo aberto. (B) Detecção imuno-histoquímica da expressão da proteína Iba no tecido cerebral (barra de escala = 50 μm). (C) Detecção por ELISA de citocinas inflamatórias no tecido cerebral mostrando elevação esperada em grupos modelo com redução após a superexpressão de Nrf2. (D) Detecção de Western blot de marcadores de piroptose com anotações de peso molecular: NLRP3 a 110 kDa, clivada-Caspase-1 a 22 kDa, GSDMD-N a 31 kDa e GAPDH a 36 kDa. (E) Detecção por microscopia eletrônica de varredura de corpos piroptóticos (indicados por setas brancas mostrando vesículas características de 1-5 μm ligadas à membrana). Quantificação baseada em 5 campos por seção, n = 6 animais/grupo. **Os dados representam a média ± EPM, n = 6 por grupo. *p < 0,05, p < 0,01 vs. grupo Sham. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: A piroptose microglial causa danos mitocondriais e promove a apoptose do neurônio 5-HT. (A) Coloração DHE combinada com imunofluorescência TPH2 para detecção de ROS especificamente em neurônios 5-HT (barra de escala = 50 μm). A abordagem de co-localização permite a discriminação do estresse oxidativo dentro dos corpos celulares neuronais positivos para TPH2 das células gliais circundantes. (B) Detecção imuno-histoquímica da expressão das proteínas TPH2 e SLC6A4 em neurônios 5-HT (barra de escala = 50 μm). **Os dados representam a média ± EPM, n = 6 por grupo. *p < 0,05, p < 0,01 vs. grupo Sham. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Representação esquemática da supressão mediada por Mettl3 da progressão da doença de Parkinson por meio da modificação m6A de Nrf2 e inibição da morte neuronal de 5-HT. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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