O eixo Mettl3 / Nrf2 suprime a progressão da doença de Parkinson por meio da inibição da piroptose induzida por NLRP3 em neurônios de serotonina

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para investigar como o Mettl3 regula o Nrf2 via modificação de m6A, suprimindo assim a piroptose microglial e protegendo os neurônios da serotonina em modelos de doença de Parkinson, com aplicações na pesquisa de neuroinflamação epitranscriptômica.

Resumo

Os mecanismos precisos subjacentes à patogênese da doença de Parkinson (DP) permanecem incompletamente compreendidos, particularmente em relação ao papel da inflamação microglial e da sobrevivência dos neurônios da serotonina. Este protocolo delineia uma estrutura abrangente para elucidar como a metiltransferase 3 (Mettl3) modula o fator nuclear eritróide 2 relacionado ao fator 2 (Nrf2) por meio da modificação de N6-metiladenosina (m6A), atenuando assim a piroptose microglial e preservando os neurônios da serotonina em modelos de DP in vitro e in vivo . O objetivo principal é fornecer aos pesquisadores metodologias reprodutíveis para dissecar a regulação epitranscriptômica das vias neuroinflamatórias, começando com a ativação microglial induzida por lipopolissacarídeo (LPS) em células BV2 para simular cascatas inflamatórias, seguida por PCR quantitativo de imunoprecipitação de RNA metilado (MeRIP-qPCR) para análise de m6A. In vivo, detalhamos o estabelecimento de um modelo de camundongo com DP induzido por MPTP, complementado pela entrega estereotáxica de vetores do sorotipo 9 do vírus adeno-associado (AAV9) para modulação Nrf2 direcionada no estriado. As avaliações comportamentais abrangem a colocação do membro anterior, a aceleração do rotarod e os testes de campo aberto para quantificar os deficits motores, enquanto os ensaios moleculares incluem Western blotting para marcadores de piroptose (por exemplo, NLRP3, caspase-1 clivada), ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) para citocinas e coloração de diidroetídio (DHE) para detecção de espécies reativas de oxigênio (ROS) em neurônios de serotonina. Técnicas avançadas de microscopia, como imuno-histoquímica para Iba1 e TPH2, permitem a visualização da dinâmica microglial e da integridade serotoninérgica. Os resultados comprovam que a deficiência de Mettl3 exacerba a regulação negativa de Nrf2, a hiperativação do inflamassoma NLRP3, a morte celular piroptótica e a consequente degeneração do neurônio serotoninérgico. Este método não apenas fornece um andaime experimental robusto para sondar a neuroproteção mediada por m6A, mas também destaca possíveis caminhos terapêuticos para mitigar a progressão da DP por meio da modulação direcionada do eixo Mettl3 / Nrf2 em contextos neurodegenerativos.

Introdução

A doença de Parkinson (DP) é o segundo distúrbio neurodegenerativo mais prevalente entre os idosos, afetando cerca de 2-3% dos indivíduos com 65 anos ou mais, o que representa um fardo significativo para as famílias e a sociedade¹. Embora os mecanismos precisos por trás da DP permaneçam parcialmente compreendidos, evidências acumuladas indicam uma conexão entre o desenvolvimento da DP e os desafios na transmissão neuronal, juntamente com a neuroinflamação impulsionada por células microgliais, que é uma característica comum observada em cérebros envelhecidos e várias doenças neurodegenerativas, incluindo DP

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram conduzidos sob a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Popular de Feicheng (número de aprovação IACUC-2024-118) e realizados em estrita conformidade com as diretrizes institucionais e princípios éticos estabelecidos para pesquisas com animais de laboratório. Os protocolos do estudo garantiram cuidados e tratamento humanos de todos os animais, com ênfase particular na minimização do sofrimento e angústia, ao mesmo tempo em que aderiram aos padrões institucionais e às diretrizes ARRIVE para práticas responsáveis de pesquisa com animais.

Resultados

O protocolo demonstra com sucesso que a expressão de Mettl3 diminui em células microgliais tratadas com LPS (Figura 1), conforme evidenciado por reduções no nível de mRNA e proteína em comparação com os grupos de controle (Figura 1B, C). A análise ELISA confirma a ativação inflamatória mediada por LPS bem-sucedida por meio de níveis elevados de IL-6 e TNF-α em sobrenadantes de cultura (Figura 1A).

Discussão

Existem várias etapas críticas que requerem atenção cuidadosa para garantir resultados reprodutíveis. O tempo de ativação do LPS é crucial - as respostas inflamatórias atingem o pico 24 h após o tratamento, e recomendamos fortemente a preparação de uma solução fresca de LPS para cada experimento, pois as soluções armazenadas podem perder bioatividade^19,20. Para a análise MeRIP-qPCR, a qualidade do anticorpo é fundamental. Descobr.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Vetores virais AAV9	Instalação de Núcleo Vetorial	Costume	Contendo construções Nrf2
Rotatório acelerador	Ugo Basile	47600	Para testes comportamentais
Anticorpo anti-GAPDH	Tecnologia de Sinalização Celular	5174	Anticorpo primário, 1:5000
Anticorpo anti-GSDMD	Abcam	ab219800	Anticorpo primário, 1:1000
Anticorpo anti-Iba1	Wako	019-19741	Anticorpo primário, 1:500
Anticorpo anti-NLRP3	AdipoGen	AG-20B-0014	Anticorpo primário, 1:1000
Anticorpo anti-Nrf2	Abcam	AB62352	Anticorpo primário, 1:1000
Anticorpo anti-SLC6A4	Novus Biologicals	NBP1-85726	Anticorpo primário, 1:500
Anticorpo anti-TPH2	Millipore	MAB847	Anticorpo primário, 1:500
Kit de Ensaio de Proteína BCA	Furar	23225	Para quantificação de proteínas
Células microgliais BV2	Biologia de Shengen	SG-BV2	Linha celular microglial de camundongos
Camundongos C57BL/6J	Laboratório Vital River	213	Bebê de 8 semanas, 19-26 g
Kit de Fracionamento de Células	Tecnologia de Sinalização Celular	9038	Separação nuclear-citoplasmática
DMEM completo com alta glicemia	Gibco	11965092	Meio de cultura celular
Cromógeno DAB	Laboratórios Vector	SK-4100	Para imunohistoquímica
Broca dentária	Ferramentas Científicas Finas	18000-17	Para perfuração de furos com rebarba
DHE (Diidroetídio)	Sondas Moleculares	D11347	Detecção ROS
Kit ELISA (IL-1β)	R& Sistemas D	MLB00C	Mouse IL-1 e beta; detecção
Kit ELISA (IL-18)	R& Sistemas D	7625	Detecção de IL-18 em camundongos
Kit ELISA (IL-6)	R& Sistemas D	M6000B	Detecção de IL-6 em camundongos
Kit ELISA (TNF-α)	R& Sistemas D	MTA00B	Mouse TNF-α detecção
Soro Fetal Bovino	Gibco	16000044	Suplemento de cultura celular
Anticorpo secundário conjugado com HRP	Jackson ImmunoResearch	111-035-003	Anti-coelho, 1:10000
Isoflurano	Ciências da Vida RWD	R510-22	Agente anestésico
Kit de Ensaio LAL	Lonza	50-647U	Validação de atividade LPS
Reagente de transfecção de lipofectamina	Invitrogen	11668019	Para transfecção celular
LPS (Lipopolissacarídeo)	Sigma-Aldrich	L2630	De E. coli, 1 mg/mL de estoque
Anticorpo m6A	Sistemas Sinápticos	202003	Para MeRIP, 1:200
Bomba de microseringa	Aparato de Harvard	70-3007	Para injeção estereotáxica
MPTP	Sigma-Aldrich	M0896	Neurotoxina, 30 mg/kg
Aparelho de campo aberto	ANY-labirinto	Costume	50 cm e agudo; 50 cm e agudo; 50 cm
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	P6148	4% no PBS
Vetor pcDNA3.1	Invitrogen	V79020	Vetor de expressão
Penicilina-Estreptomicina	Gibco	15140122	Solução antibiótica
Premix Ex Taq II Kit	Takara	RR820A	Para qPCR
PrimeScript RT Kit	Takara	RR037A	Transcrição reversa
Membrana PVDF	Millipore	IPVH00010	Para a mancha ocidental
Buffer RIPA	Tecnologia de Sinalização Celular	9806	Extração de proteínas
siRNA (Mettl3)	RiboBio	Costume	Validação da sequência de alvo
Quadro estereotáxico	Ciências da Vida RWD	68001	Para cirurgia cerebral
Reagente Trizol	Invitrogen	15596026	Extração de RNA
Azul de tripan	Sigma-Aldrich	T8154	Coloração de viabilidade celular