Artigo de método

Coleção de Múltiplos Órgãos de Modelos de Camundongos para Estudos de Envelhecimento

DOI:

10.3791/69128

⸱

12 de dezembro de 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biophysics, University of California, San Francisco

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esse protocolo fornece um método padronizado para coleta de órgãos em camundongos jovens e idosos, a fim de avaliar mudanças anatômicas e histológicas relacionadas à idade em múltiplos tecidos, apoiando tanto o desenho experimental ético quanto o econômico.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O envelhecimento é um processo biológico sistêmico e multifatorial que afeta progressivamente quase todos os órgãos e tecidos, levando a alterações estruturais, celulares e moleculares. Este protocolo delineia uma abordagem padronizada e reprodutível para avaliar mudanças anatômicas e morfológicas relacionadas à idade em camundongos por meio da coleta abrangente de órgãos para análises histológicas e moleculares subsequentes. Utilizando camundongos jovens (2-3 meses) e envelhecidos (20-24 meses), detalhamos procedimentos passo a passo para dissecação anatômica macroscópica e colheita sistemática dos principais órgãos para secção a jusante, coloração histológica e avaliação microscópica. O protocolo permite a coleta de uma ampla variedade de órgãos e tecidos (incluindo cérebro, olhos, esôfago, timo, coração, aorta, pulmões, linfonodos, fígado, pâncreas, estômago, intestino delgado, cólon, baço, rim, bexiga, pele, músculo esquelético, osso e tecido adiposo) de um único animal. Ao maximizar o rendimento de dados por sujeito, esse fluxo de trabalho apoia o uso ético dos animais por meio da redução, aumenta a reprodutibilidade entre estudos e facilita análises integrativas do envelhecimento dos organismos.

Introdução

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O envelhecimento é um processo sistêmico que afeta quase todos os órgãos, mas a maioria dos estudos experimentais foca em um único tecido, limitando os insights sobre como as mudanças relacionadas à idade coocorrem ou interagem no corpo. O envelhecimento se manifesta tanto em alterações específicas quanto sistêmicas do tecido, incluindo disfunção imunológica, alterações metabólicas, perda de capacidade regenerativa e degeneraçãoestrutural 1,2. Embora investigações específicas de órgãos tenham fornecido insights valiosos, é necessária uma perspectiva mais ampla para entender como o envelhecimento celular em vários sistemas contribui para o declínio do organismo inteiro. A análise multiorgântica em modelos pré-clínicos in vivo, como em camundongos, é essencial para identificar mudanças estruturais, celulares e moleculares coordenadas que contribuem para doenças associadas à idade e perda de resiliênciafisiológica 3,4.

O camundongo de laboratório continua sendo um modelo pré-clínico essencial e bem estabelecido para pesquisas sobre o envelhecimento devido à sua trajeabilidade genética, curta expectativa de vida, vias de envelhecimento conservadas e sua capacidade de recapitular características-chave do envelhecimento humano, incluindo disfunção imunológica, fibrose tecidual, declínio metabólico e aumento da neoplasia 5,6,7. No entanto, protocolos eficientes e padronizados de dissecação multiórgão não são amplamente utilizados. Tais protocolos são necessários para otimizar comparações histológicas, reduzir o uso de animais e integrar conjuntos de dados de ômicas entre tecidos do mesmosujeito 8,9.

Aqui, apresentamos um protocolo reproduzível e eficiente em termos de tempo para perfusão, dissecação e preservação de múltiplos órgãos em camundongos. Este protocolo fornece um guia passo a passo para a dissecação anatômica e coleta de órgãos principais de camundongos jovens (2-3 meses) e idosos (20-24 meses), incluindo cérebro, olhos, timo, coração, pulmões, aorta, linfonodos inguinais, trato gastrointestinal (esôfago, estômago, intestino delgado, cólon), fígado, pâncreas, baço, rins, bexiga, tecido adiposo, músculo esquelético, osso e pele. Instruções detalhadas para preservação de tecidos compatíveis com fluxos histológicos, moleculares e de criosseção estão incluídas. Essa abordagem padronizada permite que pesquisadores avaliem características específicas e sistêmicas do envelhecimento dentro dos mesmos sujeitos experimentais, apoiando pesquisas integradas e de alta qualidade sobreenvelhecimento 4,10,11,12.

Protocolo

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Os camundongos C57BL/6J eram mantidos na Universidade da Califórnia, San Francisco. Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso Animal (IACUC) e supervisionados pelo Centro de Recursos para Animais de Laboratório. Os camundongos foram alojados em um ciclo claro e escuro de 12 horas, com menos de cinco camundongos adultos por gaiola. A eutanásia foi realizada de acordo com as Diretrizes da American Veterinary Medical Association (AVMA) para a Eutanásia deAnimais 13. Para esse protocolo, camundongos jovens foram sacrificados aos 3 meses e ratos envelhecidos aos 22 meses de idade. Antes de prosseguir com a dissecação e coleta de órgãos, imprima e complete a lista de verificação da preparação (Tabela 1) e a lista de verificação da coleta de tecidos (Tabela 2). Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Luxação cervical

NOTA: A luxação cervical deve ser realizada por um profissional treinado para minimizar traumas excessivos nas estruturas cervicais.

  1. Prenda o rato segurando firmemente a base da cauda com uma mão.
  2. Coloque o polegar e o indicador da mão oposta na base do crânio.
  3. Aplique pressão firme e rápida para deslocar as vértebras cervicais. Palpar o pescoço para confirmar a separação entre o crânio e as vértebras adjacentes.
  4. Confirme a eutanásia bem-sucedida (seguindo protocolos institucionalmente aprovados) garantindo parada respiratória e a ausência de respostas a estímulos nocivos antes de prosseguir.
  5. Registre o peso corporal do camundongo antes da perfusão e coleta de tecido.

2. Toracotomia e perfusão

NOTA: Perfusão é opcional. Realize todos os procedimentos envolvendo paraformaldeído (PFA) em uma coifa química certificada, usando o equipamento de proteção individual (EPI) adequado, incluindo jaleco, luvas de nitrilo e óculos de segurança. Descarte as soluções PFA de acordo com as diretrizes institucionais de segurança química. Recolha todos os resíduos PFA e materiais contaminados (por exemplo, luvas, lenços, recipientes) em um contêiner de resíduos perigosos claramente rotulados e descarte-os através do escritório de Saúde e Segurança Ambiental da instituição, seguindo protocolos em conformidade com as regulamentações locais, estaduais e federais.

ATENÇÃO: Se estiver usando paraformaldeído (PFA) para fixação, execute todos os passos sob uma exaustão para evitar exposição a vapores de formaldeído.

  1. Coloque uma tampa de isopor coberta com um material absorvente para coletar o fluido da perfusão em uma bandeja de coleta. Coloque o camundongo sobre essa superfície de dissecação em posição supina e fixe os membros com pinos para estabilizar o corpo: membros anteriores posicionados lateralmente para abrir a cavidade torácica e membros posteriores estendidos caudalmente para criar uma tensão suave na parede abdominal.
    NOTA: Esse posicionamento melhora a visibilidade, minimiza obstruções e maximiza o espaço de trabalho para a coleta de órgãos.
  2. Aplique 70% de etanol na região do peito.
  3. Use tesouras afiadas para fazer uma incisão transversal no nível do diafragma, seguida de dois cortes em forma de V que se estendem para expor a caixa torácica (Figura 1A).
  4. Usando pinças de extremidade romba, levante suavemente a pele e corte cuidadosamente quaisquer fixações restantes para expor totalmente a área torácica.
  5. Faça duas incisões em forma de V de aproximadamente 2 cm de comprimento ao longo de ambos os lados da caixa torácica para abrir a cavidade torácica.
  6. Puxe o esterno para cima e prenda-o sobre o ombro do rato junto com a cabeça.
  7. Usando pinças de ponta romba, exponha cuidadosamente o coração. Remova quaisquer bolhas de ar presas na linha de perfusão, depois insira uma agulha ou cânula borboleta na ponta do ventrículo esquerdo até uma profundidade de aproximadamente 3-4 mm. Faça uma incisão de aproximadamente 5 mm de comprimento no átrio direito para permitir a saída do perfusado (Figura 1B).
  8. Inicie a perfusão com uma solução fisiológica sem cálcio e magnésio (por exemplo, PBS, soro fisiológico ou HBSS) para limpar o sistema circulatório.
    NOTA: A perfusão pode ser realizada usando uma seringa de 20 mL, bomba ou sistema alimentado por gravidade. Em média, são necessários 15-20 mL de solução de perfusão por camundongo para alcançar a eliminação completa do sangue da vasculatura. Uma boa perfusão é indicada por rápida limpeza (branqueamento) do fígado e pulmões, além de a área da boca e da língua parecerem pálidas. A perfusão completa resultará em um fluxo claro e livre de sangue pelo coração.
  9. Se desejado, inicie a perfusão de PFA trocando a linha de perfusão da solução fisiológica sem cálcio e magnésio (usada para pré-lavagem e remoção de sangue) por uma seringa de 50 mL contendo 4% de paraformaldeído (PFA), mantendo a agulha no lugar. Tome cuidado para não introduzir bolhas de ar na linha. Continue perfundindo com 4% de PFA até que o grau desejado de fixação seja avaliado pelo rigidez progressivo do corpo. Aproximadamente 30 mL de fixador são suficientes para um único rato.

3. Coleta de órgãos e tecidos

NOTA: A sequência de coleta de órgãos é fundamental ao comparar camundongos jovens e idosos. Órgãos em animais idosos tendem a ser frágeis e suscetíveis a autólise ou danos mecânicos, tornando essencial o manuseio rápido e consistente dos tecidos. Padronizar a ordem de coleta minimiza a variabilidade pós-morte, reduz o manuseio de artefatos e garante uma qualidade uniforme de fixação entre osanimais 14,15. A consistência é vital para detectar mudanças morfológicas sutis relacionadas à idade, pois amostragem atrasada ou inconsistente pode introduzir viés. Se a perfusão de PFA não for realizada, os órgãos devem ser coletados rapidamente. O pâncreas, o estômago, os pulmões e o cérebro são particularmente propensos a autólise rápida e degradação histológica se não forem processados imediatamente. Como camundongos idosos frequentemente desenvolvem lesões neoplásicas, examine cuidadosamente o baço, fígado, linfonodos, pulmões e timo em busca de assimetria, aumento, nódulos ou descoloração. Registre esses achados como parte da carga total da doença (veja a Tabela 2).

  1. Comece com o animal em posição supina após perfusão ou luxação cervical para coletar os principais órgãos das cavidades torácica e abdominal (Figura 1C).
  2. Aplique suavemente etanol 70% usando gaze ou um borrifador após a fixação, o que minimiza a contaminação do pelo e mantém a hidratação dos tecidos em regiões sensíveis. Esse método tem se mostrado eficaz em nossas mãos para reduzir detritos de pelo e melhorar a visibilidade durante a dissecação, evitando as desvantagens da imersão total.
  3. Usando tesoura e pinças de extremidade romba, abra cuidadosamente a cavidade abdominal fazendo uma incisão na linha média do diafragma até a pelve, seguida por duas incisões laterais, conforme indicado pelas linhas vermelhas na Figura 1A. Levante a pele e a parede abdominal para expor totalmente os órgãos internos.
  4. Estômago, intestino delgado e cólon: Descolar o estômago na junção esofágica, deixando a extremidade pilórica contínua com o intestino delgado. Liberte suavemente o trato gastrointestinal cortando os ligamentos de suporte e depois remova o trato, incluindo o intestino delgado e o cólon. Corte distal no reto.
    1. Para eliminar o conteúdo luminal, corte o intestino delgado proximalmente na flexura duodenojejunal e distal na junção ileocecal. Para o cólon, corte proximalmente no ceco. Lave o intestino delgado e o cólon com aproximadamente 20 mL de solução fisiológica usando uma seringa equipada com agulha de alimentação, enquanto fixa suavemente o tecido com pinças de ponta fina para evitar danos.
  5. Esôfago: Isole o esôfago do colo cervical até a junção gástrica.
  6. Baço e pâncreas: Isole o baço e o pâncreas dos tecidos ao redor usando dissecação fina, minimizando danos mecânicos. Desconecte cuidadosamente o pâncreas do baço. Imediatamente disseque e apara o pâncreas em pequenos pedaços (≤5 mm) e imerga-os em fixador dentro de 5 minutos após a eutanásia para minimizar a autólise e preservar a morfologia tisular ideal. Inspecione o baço, observando tamanho, cor, formato e a presença de quaisquer anomalias visíveis.
  7. Fígado: Usando pinças finas, segure o tecido conjuntivo central entre os lobos do fígado e puxe suavemente para cima para criar tensão. Com tesouras de dissecação, corte cuidadosamente todas as ligações entre o fígado e os órgãos adjacentes. Inspecione o fígado quanto à cor, consistência e presença de nódulos ou outras anomalias.
  8. Gordura visceral: Colete amostras de depósitos viscerais de adiposo.
    NOTA: Animais jovens geralmente têm gordura visceral mínima, enquanto animais idosos frequentemente apresentam maior acúmulo de gordura, especialmente ao redor dos intestinos, rins e regiões gonadipais.
  9. Rins e bexiga: Retire ambos os rins, junto com os ureteres e a bexiga anexados. Desprenda cuidadosamente os rins do tecido adiposo ao redor e das estruturas conjuntivas usando tesouras finas ou pinças de extremidade romba. Siga os ureteres distalmente até a bexiga, cortando quaisquer fixações restantes para isolar todo o trato urinário. Inspecione os rins e a bexiga quanto a tamanho, cor e anomalias antes do processamento adicional.
  10. Linfonodos: retrair a pele do peritônio para expor a região inguinal. Identifique os linfonodos dentro da almofada adiposa mamária ao longo dos vasos linfáticos. Isole e remova os gânglios com pinças de ponta fina, minimizando a perturbação da gordura e do tecido conjuntivo ao redor.
  11. Coração: Remova cuidadosamente o coração cortando os principais vasos.
  12. Timo: Retire cuidadosamente o timo para preservar sua estrutura. Esteja ciente de que o timo sofre involução com a idade e, em camundongos idosos, pode haver apenas tecido tímico mínimo ou nenhum.
  13. Pulmões: Usando tesouras afiadas e pinças de ponta fina, remova cuidadosamente os pulmões junto com a traqueia presa em uma única peça.
  14. Aorta: Insira pinças fechadas entre a aorta e a coluna e desaloje suavemente a aorta, separando-a ao longo da face dorsal. Tenha cuidado para não rasgar o recipiente. Utilizando pinças de ponta fina, remova cuidadosamente o tecido adiposo e conjuntivo ao redor da aorta sob um microscópio de dissecação.
  15. Músculo esquelético: Ressecar a pele sobre os membros posteriores para expor o fêmur e a musculatura ao redor. Usando tesouras finas, isole cuidadosamente os músculos ligados ao fêmur, destacando-os do tecido conjuntivo ao redor e cortando as inserções dos tendões para preservar a integridade das fibras.
  16. Osso (Tíbia): Usando tesouras de dissecação, ressece a pele e o músculo acima para expor a tíbia. Usando tesoura de dissecação e pinças rombas, desprenda cuidadosamente a tíbia nas articulações do joelho e tornozelo. Remova qualquer tecido mole restante sem danificar o osso.
  17. Olhos: Usando uma tesoura de dissecação grande, decapite o rato. Remova cuidadosamente os olhos usando pinças de ponta fina.
  18. Cérebro: Ressecar o couro cabeludo para expor o crânio anterior. Usando tesouras afiadas ou um bisturi, siga os pontos cranianos e levante os segmentos ósseos para expor o cérebro (Figura 1D). Corte os bulbos olfativos e as fixações ventrais. Extraia suavemente o cérebro da cavidade do crânio. Processe o tecido imediatamente para manter a morfologia.
  19. Pele: Se for necessário remover pelos para aplicações posteriores, remova os pelos usando um aparador elétrico. Comprima uma parte da pele das costas com pinças rombas, extire com tesoura e recolha o tecido para processamento posterior.
  20. Após remover todos os órgãos de interesse, coloque toda a carcaça do camundongo em um recipiente de 450 mL pré-preenchido com PFA a 4% para arquivar para achados inesperados ou para responder perguntas dos revisores que possam exigir retorno ao tecido fixo úmido.

4. Preservação e processamento de tecidos

NOTA: Para preservar a integridade do tecido, minimize o tempo entre a dissecação e a preservação. Atrasos podem comprometer a morfologia dos tecidos e a qualidade molecular; mais detalhes sobre o momento crítico da coleta e preservação de tecidos são mostrados na Tabela 2.

ATENÇÃO: Se estiver usando paraformaldeído (PFA) para fixação, realize todas as etapas dentro de uma exaustão para evitar exposição a vapores de formaldeído.

  1. Processe os tecidos imediatamente após a dissecação, selecionando o protocolo apropriado (passo 4.1, 4.2 ou 4.3) de acordo com a aplicação a jusante pretendida.
    1. Fixação de paraformaldeído (PFA): Coloque tecidos destinados à análise histológica em PFA de 4% a 4 °C por 12-24 horas. Após a fixação, lave os tecidos cuidadosamente com soro salino tamponado com fosfato (PBS) para remover o fixador residual, depois transfira-os para etanol a 70% para armazenamento até a incorporação e secção da parafina.
  2. Embedding de composto com temperatura ótima de corte (OCT): Incorpore tecidos frescos no composto OCT. Coloque os tecidos em moldes de embutida cheios de composto OCT, eliminando bolhas de ar, incube por 5 minutos em temperatura ambiente e depois congele na fase de vapor do nitrogênio líquido. Sele com papel alumínio e armazene os blocos OCT a −80 °C até a seção.
  3. Congelamento instantâneo na fase vapor de nitrogênio líquido: Tecidos de congelamento instantâneo destinados à análise de RNA, proteínas ou metabólitos na fase vapor do nitrogênio líquido para minimizar a formação de cristais de gelo. Coloque tecidos em criotubos marcados e suspenda-os acima do nitrogênio líquido para congelamento rápido. Uma vez totalmente congeladas, transfira as amostras para armazenamento a −80 °C.

Resultados

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Durante a necrópsia, camundongos idosos frequentemente apresentam lesões neoplásicas e requerem exame cuidadoso para documentar achados patológicos 13,14,16,17,18. A Figura 2A mostra um camundongo macho C57BL/6 de 22 meses em posição supina após perfusão. O branqueamento completo dos pulmões confirma perfusão eficaz, enquanto o fígado apresenta apenas branqueamento parcial. Uma inspeção mais detalhada do fígado revelou múltiplos nódulos malignos (Figura 2B), acompanhados por vesículas seminais aumentadas (Figura 2A) e esplenomegalia (Figura 2C). Esses achados são comuns em camundongos idosos e devem ser documentados como parte da carga total dadoença 18.

A Figura 3 mostra órgãos macroscópicamente normais coletados após dissecação e perfusão, permitindo avaliar a integridade anatômica e a eficiência da perfusão. O trato gastrointestinal foi lavado com solução fisiológica para remover o conteúdo digerido, resultando em uma aparência limpa e translúcida do estômago, cólon e intestino delgado (Figura 3A). Estruturas adicionais, incluindo esôfago, pâncreas, baço, depósitos viscerais de adiposo, rins com bexiga, linfonodos, coração e timo, foram claramente identificáveis e puderam ser isoladas intactas para análises posteriores (Figuras 3B,C,E-I).

A qualidade da perfusão foi avaliada examinando o branqueamento em tecidos altamente vascularizados. Como mostrado nas Figuras 3D e3J, o fígado e os pulmões apresentaram diferenças distintas entre condições não perfusas, bem perfusas e parcialmente perfusas. O branqueamento completo confirmou perfusão bem-sucedida, enquanto o escaldamento incompleto indicou variabilidade técnica ou anormalidades subjacentes. Outros tecidos, incluindo aorta, músculo esquelético, tíbia, cérebro, olho e pele, foram isolados com morfologia preservada, adequada para aplicações histológicas, moleculares ou de imagem posteriores (Figura 3K-P). Esse procedimento padronizado de dissecação proporciona recuperação consistente de tecidos e órgãos intactos e bem preservados, além de permitir uma avaliação anatômica macroscópica que apoie uma variedade de análises a jusante. A dissecação e coleta de órgãos exigiam aproximadamente 40-60 minutos por animal, dependendo da experiência do operador e da presença de achados patológicos.

A Figura 4 mostra mudanças exemplares associadas ao envelhecimento em órgãos coletados após a incorporação de parafina, secção e coloração de hematoxilina e eosina (H&E). Em seções de pele de camundongos idosos, foram observados afinamento epitelial e perda de folículos capilares em comparação com controles jovens (Figura 4A). As seções renais revelaram aumento das cápsulas de Bowman juntamente com alterações fibróticas e necróticas, bem como regiões compatíveis com linfomas (Figura 4B). Em cesarianas pancreáticas, observou-se um aumento nos corposapoptóticos 19 e regiões linfomatosas em animais envelhecidos, indicativo de comprometimento da integridade tecidular com a idade (Figura 4C). As seções do baço representavam depósitos de amiloide e regiões de linfoma em animais idosos, refletindo características adicionais da patologia relacionada à idade (Figura 4D).

Esses resultados destacam características histopatológicas representativas do envelhecimento em múltiplos tecidos, demonstrando a utilidade desse protocolo para detectar marcas estruturais do declínio relacionado à idade.

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Figura 1: Visão esquemática dos procedimentos de dissecção de camundongos e exposição de órgãos. (A) Locais de incisão para abrir as cavidades torácica e abdominal (linhas vermelhas), incluindo uma incisão transversal no nível do diafragma, seguida por cortes em forma de V ao longo dos dois lados da caixa torácica para abrir a cavidade torácica, e uma incisão na linha média do diafragma até a pelve com cortes bilaterais para expor totalmente a cavidade abdominal. (B) Configuração de perfusão mostrando a inserção de uma agulha borboleta no ventrículo esquerdo e incisão no átrio direito para permitir drenagem sanguínea eficaz. (C) Disposição anatômica dos principais órgãos torácicos e abdominais após exposição a cavidades. (D) Passos de dissecação da cabeça, incluindo remoção do couro cabeludo e abertura do crânio ao longo dos pontos cranianos para expor o cérebro. Linhas vermelhas indicam locais de incisão. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 2: Identificação de lesões neoplásicas em camundongos idosos. (A) Representativo de C57BL/6 macho de 22 meses em posição supina após perfusão com 4% de PFA. O branqueamento completo dos pulmões (ponta de seta rosa) confirma perfusão eficaz, enquanto o fígado (ponta de seta verde) apresenta apenas branqueamento parcial. Pontas de flecha azuis indicam vesículas seminais aumentadas. (B) Vista detalhada do fígado revelando múltiplos nódulos malignos (pontas de flecha pretas). (C) Baço aumentado de um camundongo C57BL/6 envelhecido (lado direito) em comparação com um baço normal de um animal jovem (lado esquerdo). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 3: Visão geral dos principais órgãos e integridade dos tecidos do camundongo após dissecação e perfusão. (A) Estômago, intestino delgado e cólon antes e após a lavagem com solução fisiológica para remover o conteúdo digerido. (B) Esôfago. (C) Pâncreas com baço anexado. (D) Fígado sem perfusão, com branqueamento completo após perfusão efetiva, e com escaldamento parcial indicativo de perfusão incompleta ou patologia subjacente. (E) Tecido adiposo visceral. (F) Rins com bexiga acoplada. (G) Linfonodos inguinais. (H) Coração. (I) Timo. (J) Pulmões sem perfusão, com escaldamento completo após perfusão efetiva, e com branqueamento parcial. (K) Aorta. (L) Músculo esquelético isolado do membro posterior. (M) Tíbia com estrutura óssea preservada. (N) Cérebro. (O) Olho. (P) Pele. Barras de escala: 5 mm em A, C, D, E, F, J, L, N, P; 1 mm em todos os outros painéis. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 4: Análise histológica de órgãos principais usando coloração por hematoxilina e eosina (H&E). (A) Cortes de pele de camundongos de 3 meses (jovens) e 22 meses (idosos). As seções de animais idosos mostram afinamento epitelial e perda de folículos capilares. (B) Trechos renais destacando as cápsulas de Bowman. As seções de animais idosos mostram aumento de cápsulas, alterações fibróticas e necróticas, e linfomas (pontas de flecha laranja). (C) Cortes pancreáticos de animais jovens e idosos, com animais idosos apresentando corpos apoptóticos aumentados (pontas de flecha azuis) e regiões linfomáticas (pontas de seta laranja). (D) Segmentos do baço de camundongos de 3 meses (jovens) e 22 meses (idosos). Trechos de animais idosos mostram depósitos amiloides (pontas de flecha verde-limão) e regiões de linfoma. Barra de escala (A-C) 100 μm. Barra de escala (D) 500 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Lista de verificação para preparação. Uma lista passo a passo de preparações essenciais para dissecação e preservação de tecidos de camundongos, incluindo rotulagem de tubos e mofo, preparação de tampões e fixadores, preparação para crio-embedding, esterilização de ferramentas de dissecação, arranjo de estações de trabalho e planejamento de documentação. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 2: Lista de verificação para coleta de tecidos. Use a tabela para registrar os lenços coletados. Adicione o tempo de coleta e anotações sobre condição ou anormalidades. Priorize os tecidos críticos para o seu estudo; colete os órgãos mais relevantes dentro do intervalo de tempo recomendado para evitar autólise/degradação tecidual.*Note quaisquer anomalias (incluindo descoloração dos órgãos, nódulos, crescimento maligno, tamanho anormal dos órgãos). **Considere documentar o método de preservação (incluindo fixação com PFA, embedding OCT ou snap freezing). Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esse protocolo fornece uma estratégia reprodutível para a coleta sistemática de múltiplos sistemas de órgãos em camundongos jovens e idosos, permitindo análises anatômicas, histológicas e moleculares. Diversas considerações técnicas podem afetar a qualidade do resultado e abordar limitações do método descrito. Primeiro, a variabilidade na qualidade da perfusão é um fator importante a ser considerado. Perfusão incompleta pode deixar sangue residual que compromete histologia, imunohistoquímica e análises moleculares. A perfusão após luxação cervical pode causar trauma nos tecidos cervicais e levar à contaminação sanguínea dos pulmões. Portanto, a luxação cervical deve ser realizada apenas por profissionais treinados. Para resultados ótimos, a perfusão deve ser realizada sob anestesia terminal, conforme descrito em outrospontos 20,21, de acordo com as diretrizes IACUC eAVMA 13. Segundo, a fixação é um determinante crítico da integridade tecidual. Embora o paraformaldeído a 4% (PFA) seja amplamente utilizado, ele pode penetrar inadequadamente em órgãos grandes ou densos, resultando em deficiente histologia e preservação de antígenos. Essa limitação pode ser mitigada usando formalina tamponada neutra (NBF) a 10% ou cortando tecidos em seções de ≤5 mm para melhorar apenetração em 22. Terceiro, alguns tecidos, especialmente pâncreas, estômago e cérebro, passam por autólise rápida, exigindo fixação ou congelamento em 5-10 minutos após a eutanásia e o uso de ferramentas de dissecação pré-resfriadas23. Em camundongos idosos, a neoplasia pode distorcer ainda mais a anatomia e complicar a dissecação. Artefatos adicionais podem surgir devido ao volume de fixação inadequado ou congelamento, levando a encolhimento e efeitos de borda; esses podem ser minimizados mantendo uma proporção fixador-tecido de pelo menos 10:1, evitando superlotação e pré-resfriando moldes de OCT antes da incorporação. Por fim, o uso de PFA e formolão levanta preocupações de segurança e descarte; Fixadores à base de glioxais oferecem alternativas menos tóxicas. Manuseio padronizado, fixação otimizada e timing cuidadoso são, portanto, essenciais para maximizar a reprodutibilidade, a qualidade do tecido e a confiabilidade das análises a jusante24.

Ao extrair tecidos de mais de 15 órgãos dentro do mesmo animal, esse fluxo de trabalho maximiza o rendimento biológico por sujeito e está alinhado com mandatos éticos para reduzir o uso animal. O procedimento sistemático pode ser facilmente ampliado para estudos de média taxa que examinam o declínio fisiológico relacionado à idade e patologias específicas deórgãos 25.

O processamento rápido dos tecidos propensos à autólise é essencial para preservar a integridade histológica. O uso de soluções fisiológicas sem cálcio e magnésio, seguidas de 4% de PFA, preserva de forma confiável a arquitetura dos órgãos e minimiza a autólise em tecidos sensíveis como o pâncreas e o sistema digestivo. Ao contrário dos protocolos focados em órgãos únicos ou modelos de doenças, essa abordagem permite a coleta rápida e consistente de múltiplos órgãos, reduzindo a variabilidade e melhorando o fluxo de funcionamento. Toda a dissecação, desde a perfusão até a excisão final do tecido, pode ser concluída em até 60 minutos por animal, tornando-a adequada para estudos em grande escala ou sensíveis ao tempo 3,11,26. A adesão a uma sequência precisa de perfusão-fixação minimiza artefatos e possibilita resultados reprodutíveis.

A consistência na coleta, corte e incorporação de tecidos é essencial para uma avaliação histopatológica precisa, especialmente em estudos longitudinais ou multicêntricos. A variabilidade na forma como os tecidos são tratados pode introduzir artefatos, obscurecer achados patológicos ou levar a uma má interpretação da carga da doença. Os Guias Revisados para Amostragem e Corte de Órgãos em Ratos e Camundongos, como os guias de corte RENI, fornecem protocolos detalhados e padronizados para minimizar taisinconsistências 22. A adoção desses métodos harmonizados melhora a comparabilidade de dados entre estudos e instituições, fortalece a reprodutibilidade e aprimora a integridade dos resultados baseados em patologia na pesquisa sobreenvelhecimento 4,9.

Coletar uma multiplicidade de órgãos é particularmente importante na pesquisa sobre o envelhecimento, onde entender como os sistemas organicos interagem é essencial para descobrir os processos que impulsionam o declínio fisiológico do corpo inteiro com a idade. Embora essa abordagem também possa ser benéfica para uma variedade de outras questões de pesquisa, o foco deste protocolo é apoiar estudos de envelhecimento onde mudanças relacionadas à idade podem afetar múltiplos sistemas de órgãos simultaneamente. No entanto, também pode ser aplicado a estudos focados em fibrose, regeneração e senescência, especialmente aqueles que integram transcriptômica ou descoberta de biomarcadores multi-tecidos 9,27,28.

Avaliações histológicas revelaram alterações características associadas à idade em múltiplos tecidos (Figura 4). Na pele, animais idosos apresentaram afinamento epitelial e perda de folículos capilares. No rim, seções de camundongos idosos demonstraram o aumento da cápsula de Bowman, além de alterações fibróticas, necróticas e linfomatosas. O tecido pancreático de animais idosos apresentou acúmulo de corpos apoptóticos e linfomas, enquanto as seções do baço apresentaram depósitos amiloides e regiões adicionais de linfoma. Essas observações são consistentes com fenótipos estabelecidos do envelhecimento murino e demonstram a utilidade deste protocolo para detectar marcadores histopatológicos representativos do envelhecimento1, 18, 19, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 34.

Em resumo, esse protocolo oferece uma estrutura confiável e escalável para coletar e preservar tecidos em modelos pré-clínicos de envelhecimento. Pode ser adotado tanto em estudos exploratórios quanto baseados em hipóteses para descobrir mecanismos específicos e sistêmicos de envelhecimento, degeneração e resiliência do envelhecimento dos tecidos.

Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Esse trabalho foi apoiado por uma bolsa inicial da Fundação Larry L. Hillblom, pela bolsa AFAR e Glenn Foundation for Medical Research para professores juniores, pelo prêmio Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation Junior Investigator e pelo prêmio New Frontier Research do Programa para Pesquisa Biomédica Inovadora (PBBR) para Hanna Martens. A Figura 1 foi criada com o BioRender.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Absorvente
Idade C57BL/6J camundongos  O Laboratório Jackson & nbsp;#000664
Bandejas de coleta  
Aparador sem fioBravMini+ CLP-41590Para depilação
Spray de Etanol 70%Fisher Scientific50-163-3592
Pinça Extra 5 INOXDumontF6521-1EAPinça de ponta extra fina para linfonodos
PinçasMilliporeSigmaXX6200006PPinças de extremidade romba
Pinça 5 INOXDumontF6521-1EAPinças de ponta fina
Solução Salída Balanceada de Hank (HBSS) 1x 500 mLGibco14025092
Tesoura Micro-Dissecadora (Reta, Afiada/Afiada, 25mm)Roboz SurgicalRS-5668Micro tesoura padrão, aço inoxidável, lâmina de 25 mm (M-37)
Tesouras Microdissecantes (Retas, Afiadas/Afiadas, Lâminas Finas)Roboz SurgicalRS-5918Tesoura fina de dissecação, comprimento de 4,5" (H-327)
NBFSigma HT501128Para fixação
Solução salina normalCytiva76081-514
Temperatura Ótima de Corte (OCT)Fisher Scientific23730571
Paraformaldeído (PFA) 4%Ciências da Microscopia Eletrônica15710Para fixação
Placas de Petri 100 mL x 15 mLMilliporeSigmaP5856-500EA
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Gibco10010023
PinsEisco LabsDISPINS1Para fixar o rato durante a dissecação
Seringa plástica 20 mL, trava luerFisherBrand302830Para perfusão
Caixa Seal'N Freeze (Recipiente Criogênico)Ted Pella, Inc.20956
Criografia Seal'N FreezeTed Pella, Inc.20956-1Para posicionamento de amostras no recipiente criogênico
Agulha Borboleta Sol-Vet com AdaptadorSol-Millenium Medical110301070003para perfusão
Tampa de isopor
Cyromold Tec-Tecidular (Biópsia)Sakura25608-922
Ratos jovens C57BL/6JO Laboratório Jackson & nbsp;#000664

Referências

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