Análise otimizada de proteínas de oócitos e embriões de Xenopus por immunoblotting

Resumo

Este artigo descreve um protocolo para análise de proteínas de oócitos e embriões de Xenopus por immunoblotting. As etapas de coleta são descritas, seguidas pelas etapas correspondentes ao processamento da amostra, SDS-PAGE, transferência, coloração de anticorpos e imagem. O protocolo enfatiza o estudo de complexos proteicos reguladores translacionais com anticorpos endógenos e anticorpos contra marcadores de afinidade proteica.

Resumo

A análise de proteínas por eletroforese em gel de dodecil sulfato-poliacrilamida de sódio (SDS-PAGE) seguida de immunoblotting (western blotting) é uma parte vital do kit de ferramentas do biólogo molecular. Essa técnica separa uma mistura complexa de proteínas por peso molecular e, em seguida, analisa a presença de proteínas-alvo usando anticorpos específicos. O immunoblotting tem uma variedade de aplicações. Os exemplos incluem o uso como uma abordagem direcionada para estudar interagentes proteína-proteína ou como um controle para confirmar a expressão ou depleção de alvos proteicos. No entanto, a execução bem-sucedida do immunoblotting requer experimentos complicados e de várias etapas. Os protocolos devem ser otimizados para cada organismo, proteína-alvo e aplicação. Portanto, existem lacunas de conhecimento para o uso de immunoblots em muitos modelos, incluindo o sapo modelo Xenopus laevis.

Devido ao seu grande tamanho, material abundante para experimentos bioquímicos e fácil manuseio, os oócitos e embriões de X. laevis têm sido vitais para o estudo dos princípios do controle translacional. No entanto, esta espécie carece de protocolos específicos para immunoblotting robusto e rotineiro. Aqui, oferecemos um protocolo detalhado para western blotting otimizado para amostras de vários estágios de desenvolvimento de Xenopus . Em seguida, analisamos os reguladores translacionais em todo o desenvolvimento.

Introdução

Compreender os mecanismos celulares requer o monitoramento de espécies específicas de proteínas. As investigações comuns incluem como eles mudam de expressão espacial e temporalmente, com quais proteínas eles interagem e se são modificados em resposta a diferentes condições. O immunoblotting, coloquialmente conhecido como "Western blotting", é uma metodologia fundamental para enfrentar esses desafios. Um experimento de immunoblot separa proteínas de uma amostra complexa - por exemplo, lisado de células inteiras - e as identifica usando anticorpos. Especificamente, as proteínas são desnaturadas e separadas por eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) por tamanho. As proteínas fracionadas de tamanho são transferidas para um suporte sólido, como uma membrana de nitrocelulose, e a proteína de interesse é identificada usando reagentes de anticorpos. O immunoblotting tornou-se uma parte padrão do kit de ferramentas do biólogo molecular. É comumente usado para monitorar a expressão de proteínas em diferentes contextos ou como um ponto final para experimentos como ensaios de imunoprecipitação. Apesar dessas vantagens, a análise dos níveis de proteína no estado estacionário com immunoblotting se mostra desafiadora, pois o ensaio deve ser otimizado para cada etapa e contexto experimental (Figura 1).

Um contexto desafiador é a análise de material da rã africana Xenopus laevis. X. laevis é um organismo importante para estudar as interações RNA-proteína. Este sistema tem inúmeras vantagens, a principal delas é que X. laevis produz centenas de oócitos e, subsequentemente, desenvolve embriões de forma síncrona de cada vez. Cada oócito tem ~ 25 μg de proteína¹ não vitelina, fornecendo material abundante para experimentos bioquímicos. O grande tamanho (~ 1250 μm) ¹ de oócitos e embriões também facilita a microinjeção de mRNA para expressar exogenamente proteínas marcadas ou mutadas em escala². Essas qualidades permitem experimentos poderosos para testar o controle translacional em X. laevis, como o ensaio de função amarrada, no qual o impacto de uma proteína reguladora translacional em um mRNA pode ser analisado independentemente da capacidade dessa proteína de ligação ao RNA 3,4,5,6. No entanto, o immunoblotting em oócitos e embriões de Xenopus apresenta dificuldades, incluindo a interferência de grandes massas de plaquetas vitelinosas nessas células iniciais⁷, o que obscurecerá os resultados se não for removido.

Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para immunoblotting eficaz em X. laevis, com ênfase na detecção de proteínas reguladoras translacionais. Fornecemos instruções sobre como coletar e processar oócitos e embriões para obter imagens do immunoblot final. Também estão incluídas instruções detalhadas para carregamento e imagem ideais de proteínas, bem como para evitar a contaminação da gema da amostra. Além disso, discutimos possíveis modificações de protocolo e estratégias para encontrar anticorpos compatíveis com proteínas de Xenopus . Pretendemos fornecer aos investigadores orientação para realizar imunoblotting sem esforço como parte de seus próprios experimentos neste organismo modelo subutilizado.

Figura 1: Fluxo de trabalho para preparação de amostras de Xenopus e análise subsequente de immunoblot. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

Todo o trabalho com animais (X. laevis) representados neste protocolo está de acordo e foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UW-Madison. Detalhes do equipamento, reagentes usados e concentrações de anticorpos empregados estão listados na Tabela de Materiais. Uma seleção de equipamentos pode ser visualizada na Figura 2, abaixo.

Figura 2: Extrato de embrião processado e equipamento para immunoblotting. (A) Extrato de oócito centrífugo de X. laevis estágio VI. Lipídios e proteínas lipossolúveis sobem ao topo, enquanto a vitelogenina (gema) e os detritos pigmentados formam um pellet. (B) Equipamento para SDS-PAGE para separar proteínas por peso molecular. (i) Fonte de alimentação, (ii) Tanque de eletroforese vertical, (iii) Tampa do tanque de eletroforese, (iv) Conjunto de eletrodos, (v) Barragem tampão, (vi) Gel de eletroforese pré-fabricado; Observe o pente verde (superior) e o adesivo azul (inferior), cada um dos quais deve ser removido. (C) Equipamento para transferência de membrana. O tanque de eletroforese vertical e a tampa são reutilizados para transferência após um enxágue completo. (i) Rolo para remover bolhas, (ii) Clipe de transferência, (iii) Barra de agitação pequena, (iv) Membrana de nitrocelulose entre duas folhas de papel azuis protetoras, (v) Papel de filtro para cromatografia de celulose, (vi) Almofadas de esponja de transferência, (vii) Assadeira de vidro para montagem de transferência, (viii) Bolsa de gelo, (ix) Núcleo de transferência. (D) Outros equipamentos. (i) Desbloqueador de gel (para aparar os poços de gel pré-transferência), (ii) Alavanca de abertura do de gel, (iii) Fórceps (para manusear a membrana), (iv) Recipiente (para segurar a membrana), (v) Tampa do recipiente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Coleta de oócitos e embriões de Xenopus

1. Preparação de oócitos
   1. Obter oócitos de X. laevis desfoliculados de um fornecedor comercial (Ecocyte Bio Science, Austin, Texas) ou isolar e desfolicular conforme descrito⁸.
   2. Cultura de ovócitos isolados em Solução de Barth Modificada (MBS; 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,4 mM CaCl₂, 0,33 mM Ca(NO₃)₂, 0,8 mM MgSO₄, 5 mM Tris-HCl, 2,4 mM NaHCO₃, pH 7,4) até o uso.
2. Preparação de embriões
   1. Isole os ovos de X. laevis e fertilize-os conforme descrito ^9,10.
   2. Cultura de embriões fertilizados em solução de Ringer modificada de Marc 0,25x¹¹ (MMR) (1x MMR: 0,1 M NaCl, 2,0 mM KCl, 1 mM MgSO₄, 2 mM CaCl₂, 5 mM HEPES).
   3. Prepare uma solução de cisteína a 2% em 0,1x MMR com o pH ajustado para 8,2 usando NaOH.
   4. Remova 0,25x MMR do prato usado para fertilização e cubra os embriões com a solução de cisteína para remover a camada gelatinosa¹². Misture a solução delicadamente para que os embriões fiquem uniformemente expostos.
   5. Monitore os embriões de perto com um estereomicroscópio de ampliação de 2x a 25x. Depois que a camada gelatinosa se dissolver (normalmente 3-5 min), os embriões se compactarão juntos. Evite a exposição prolongada à cisteína.
   6. Remova a solução de cisteína e enxágue os embriões várias vezes com 0,25x MMR.
   7. Cultura em 0,25x MMR até o estágio de crescimento desejado.
3. Colete o número desejado de embriões ou oócitos (recomendado pelo menos cinco por amostra) em um tubo de 1,5 mL.
4. Remova o excesso de mídia com um pipetador, evitando danificar as células.
5. Utilizar amostras imediatamente ou conservar a -80 °C até à utilização. Oócitos e embriões podem ser armazenados por vários anos.

2. Preparação do extrato de Xenopus

1. Descongele as amostras no gelo se congeladas.
2. Adicione 10 μL de tampão de lise celular 10x resfriado diluído a 1x com água deionizada dupla (ver Tabela de Materiais) por embrião / oócito e homogeneize as amostras com um micropilão no gelo.
3. Centrifugar amostras a 5000 g a 4 °C numa centrífuga de bancada durante 10 min para granular detritos, incluindo gema e pigmentos insolúveis.
4. Remova o sobrenadante para um tubo separado de 1,5 mL, tomando cuidado para evitar o pellet (Figura 2A).
5. Adicione um volume igual de 2x tampão de amostra Laemmli suplementado com 5% p / v de 2-mercaptoetanol ao sobrenadante e ferva por 10 min a 95-100 ° C para desnaturar as proteínas da amostra.
6. Use amostras imediatamente ou armazene a -20 °C por meses a anos.

3. PÁGINA SDS

1. Prepare o tampão de corrida SDS: 1x tampão Tris-MOPS-SDS (6,06 g de base Tris, 10,46 de g de ácido 3- (N-morfolino)propanossulfônico [MOPS], 1,0 g de SDS, 0,3 g de ácido etilenodiaminotetracético [EDTA], água deionizada dupla para 1000 mL).
2. Remova um gel pré-moldado bis-tris SDS de 4-12% da embalagem. Remova o adesivo na parte inferior do gel.
3. Insira o gel no conjunto do eletrodo oposto a uma barragem tampão. Coloque o conjunto do eletrodo no tanque de eletroforese vertical (Figura 2B).
4. Encha o conjunto do eletrodo e o fundo do tanque de eletroforese com 1x Tris-MOPS-SDS executando buffer.
5. Remova suavemente o pente de gel do gel e pipete o tampão que passa nos poços para remover bolhas e equilibrar o tampão.
6. Carregue cuidadosamente 5 μL de padrões de proteína pré-corados no primeiro poço e 10 μL de cada amostra nos poços adicionais.
7. (OPCIONAL) Carregue os poços restantes com 10 μL de tampão de amostra 1x Laemmli para que o gel funcione de maneira mais uniforme.
8. Coloque a tampa no tanque de eletroforese e conecte-o a uma fonte de alimentação. Aplique 200 V.
9. Pare a eletroforese quando a frente do corante tampão de amostra sair do gel.

4. Transferência úmida de proteínas para uma membrana

1. Enquanto as amostras são eletroforesadas, prepare 1 L de tampão de transferência (3,0 g de Tris Base, 4,08 g de bicina, 900 mL de água duplamente deionizada, 100 mL de metanol). Pré-arrefecer o tampão de transferência a 4 °C.
   CUIDADO: Manuseie estoques concentrados de metanol em uma capela e evite o contato com a pele. O metanol pode ser substituído por etanol.
2. Antes que a eletroforese esteja completa, comece a montar o "sanduíche" de transferência no clipe de transferência (Figura 2C).
   1. Encha uma assadeira de vidro com tampão de transferência resfriado. Nas etapas subsequentes de montagem em sanduíche, certifique-se de que os materiais estejam submersos nesse buffer.
   2. Coloque o clipe de transferência no prato com a metade preta encostada no fundo do prato, a metade branca aberta e apontada para cima e o clipe de transferência aberto para a esquerda.
   3. Coloque uma ou duas esponjas de fibra planas na metade preta do clipe de transferência.
   4. Corte dois papéis de cromatografia de celulose de 0,35 mm (papéis de filtro) no tamanho certo e coloque um sobre as esponjas.
3. Após a conclusão da eletroforese, remova o gel do tanque de eletroforese.
4. Separe cuidadosamente as placas do gel com a alavanca de abertura do de gel, certificando-se de que o gel permaneça preso a uma das placas (Figura 2D). Apare os poços do topo do gel com o liberador de gel.
5. Coloque o gel, ainda preso a uma metade do de plástico, sobre o papel de filtro. Remova a metade do para que o gel permaneça no papel de filtro.
6. Corte um quadrado de membrana de nitrocelulose de 0,45 μm para caber nas dimensões do gel. Remova a membrana do papel protetor, umedeça-a brevemente no tampão de transferência e coloque-a sobre o gel.
   NOTA: Manuseie a membrana cuidadosamente pelos cantos com luvas ou pinças para evitar a contaminação indesejada por proteínas da membrana.
7. Coloque um segundo papel de filtro em cima da membrana de nitrocelulose. Remova com cuidado, mas com firmeza, quaisquer bolhas usando um rolo em cima do papel de filtro.
8. Empilhe mais uma ou duas esponjas de fibra em cima do papel de filtro.
9. Feche o de transferência e prenda-o bem, completando o 'sanduíche'.
10. Insira o sanduíche de transferência no núcleo de transferência com o clipe de transferência voltado para cima e o lado preto do clipe de transferência voltado para o lado preto do núcleo.
11. Coloque o núcleo de transferência no tanque de eletroforese. Adicione uma bolsa de gelo e uma barra de agitação ao tanque para que a barra de agitação possa girar livremente.
    NOTA: Além ou no lugar de uma bolsa de gelo, a transferência pode ser executada em uma câmara fria a 4 ° C na etapa 4.13.
12. Encha o tanque com tampão de transferência refrigerado. Prenda a tampa firmemente na parte superior.
13. Conecte o aparelho de transferência à fonte de alimentação, certificando-se de alinhar as cores dos eletrodos. Execute a transferência por 1 h, 100 V, a 4 °C, com a barra de agitação girando.

5. Processamento de membrana pós-transferência

1. Prepare 10x solução salina tamponada com Tris (100 mM de base Tris; 1,5 M de NaCl). Ajuste o pH para 8 e filtre a esterilização.
2. Prepare 1x solução salina tamponada com Tris com Tween-20 (TBSTw) diluindo 10x solução TBS 1:10 em 500 mL de água duplamente deionizada e adicionando 500 μL de Tween-20.
3. Prepare tampão de bloqueio (500 mL de TBSTw, 25 g de leite em pó desnatado).
   NOTA: O leite desnatado pode ser substituído por albumina de soro bovino (BSA) a 2-5% no tampão de bloqueio. A BSA deve ser usada se a aplicação experimental envolver a visualização de proteínas biotiniladas, pois o leite contém biotina.
4. Quando a transferência estiver concluída, remova e desmonte cuidadosamente o sanduíche e remova a membrana de nitrocelulose. Marque qual lado da membrana estava em contato com o gel e mantenha esse lado voltado para cima nas etapas subsequentes.
5. Prepare 50 mL de coloração de Ponceau (0,5% de Ponceau S, 1% de ácido acético), uma coloração reversível para visualização de proteínas.
   CUIDADO: A mancha de Ponceau é corrosiva. Evite o contato com a pele.
6. Coloque a membrana em um pequeno recipiente (conforme mostrado na Figura 2D) de forma que fique nivelada com o fundo do recipiente. Cubra a membrana com a coloração Ponceau até a imersão e balance suavemente em um balancim por 5-10 min.
7. Despeje a mancha de Ponceau.
   NOTA: A coloração Ponceau pode ser reutilizada várias vezes.
8. Enxágue a membrana em lavagens repetidas de água duplamente deionizada até que o excesso de Ponceau seja removido e as faixas de proteína nas faixas comecem a se resolver.
9. Confirme a eficiência da transferência pela presença de faixas retas e uniformes com faixas claramente resolvidas.
10. Despeje o líquido restante e mergulhe o blot no tampão de bloqueio para evitar a ligação inespecífica do anticorpo à membrana nas etapas a jusante.
11. Balance suavemente em uma cadeira de balanço por 30-60 min em temperatura ambiente.

6. Incubação de anticorpos

1. Dilua o anticorpo primário em 10 ml de tampão de bloqueio fresco até à concentração desejada.
   NOTA: A concentração ideal terá que ser determinada empiricamente para cada novo anticorpo. Um ponto de partida típico é 1:1000, ou então siga as recomendações do fabricante.
2. Remova o tampão de bloqueio e substitua-o pela mistura de anticorpos. Incubar, balançar suavemente, durante a noite (~16 h) a 4 °C.
3. Despeje a solução de anticorpo primário e enxágue a membrana com TBSTw, imergindo-a na solução e despejando-a rapidamente.
   NOTA: A maioria das misturas de anticorpos pode ser salva e reutilizada duas a três vezes. Isso deve ser determinado empiricamente para cada anticorpo.
4. Lave a membrana mergulhando-a em TBSTw e balançando suavemente à temperatura ambiente por 5 min. Realize três lavagens totais de 5 minutos.
5. Diluir o anticorpo secundário em 30 ml de TBSTw até à concentração desejada.
   NOTA: A concentração terá que ser determinada empiricamente para cada anticorpo. Normalmente usamos 1:30.000.
6. Despeje a solução de lavagem TBSTw e substitua-a pela mistura de anticorpos secundários. Incubar, balançando suavemente, por 45 min em temperatura ambiente.
7. Enxágue rapidamente a membrana uma vez com TBSTw, seguida de três lavagens de 5 minutos com TBSTw.

7. Imagem da membrana em um revelador de filme

1. Em uma câmara escura, ligue o revelador de filme e deixe-o aquecer.
2. Corte dois quadrados de filme plástico grandes o suficiente para envolver a membrana. Usando uma pinça, coloque a membrana de nitrocelulose 'voltada para cima' no primeiro quadrado de filme plástico.
3. Em um tubo de 1,5 mL, misture quantidades iguais dos reagentes Luminol e Enhancer de quimioluminescência aprimorada (ECL). O uso de 1 mL da solução misturada deve cobrir a maioria das membranas.
4. Pipete o reagente ECL na membrana e manipule a membrana suavemente usando o filme plástico para garantir a cobertura total. Incubar por 1 min.
5. Remova o excesso de reagente ECL segurando a membrana com uma pinça e sacudindo suavemente o líquido ou absorvendo o líquido tocando um canto da membrana em uma toalha de papel.
6. Coloque a membrana voltada para cima no segundo quadrado de filme plástico e dobre o filme plástico sobre a membrana até que esteja frouxamente fechado. Prenda a membrana enrolada com segurança em um de autorradiografia.
7. Na câmara escura, coloque um filme dentro do, cobrindo a membrana com fita adesiva. Feche bem o e exponha o filme à membrana por 1 min.
8. Remova cuidadosamente o filme, tomando cuidado para não arrastar o filme exposto ao longo da membrana. Alimente-o no revelador do filme.
9. Ao avaliar o filme revelado, ajuste o tempo de exposição com os filmes subsequentes até que a visualização desejada da proteína seja alcançada. Se a visualização da proteína fornecer um sinal fraco, repita a etapa de incubação do reagente ECL com um reagente ECL mais sensível e recrie a imagem.
10. Alinhe o filme revelado com os marcadores que brilham no escuro e use esta referência para marcar a posição dos padrões de proteína pré-corados na membrana no filme.
11. Quando a imagem estiver concluída, remova cuidadosamente a membrana do filme plástico e mergulhe-a em TBSTw para lavar o reagente ECL restante.

8. (Opcional) Incubações de anticorpos adicionais

NOTA: A remoção de um immunoblot refere-se à remoção dos anticorpos primários e secundários iniciais com uma solução desnaturante (tampão de decapagem) para que o blot possa ser reexaminado com um anticorpo diferente. A resondagem permite que o mesmo immunoblot seja analisado quanto à expressão de diferentes alvos proteicos e compare proteínas desconhecidas com proteínas bem caracterizadas que funcionam como padrões. Sonda com o anticorpo que produz o sinal comparativamente mais fraco primeiro. Isso evita artefatos causados por anticorpos incompletamente removidos em exposições subsequentes e minimiza o impacto da perda de proteína da remoção repetida de um borrão.

1. Retire os anticorpos ligados imergindo a membrana em tampão de decapagem e balançando suavemente por 5-10 min.
2. Remova a membrana do tampão de decapagem e enxágue brevemente em TBSTw para remover qualquer solução de decapagem residual.
3. Mergulhe a membrana no tampão de bloqueio e balance suavemente por 30 min.
4. Faça uma nova solução de anticorpo primário em tampão de bloqueio com a concentração desejada.
5. Adicionar a nova diluição de anticorpos primários à membrana e incubar balançando suavemente durante a noite a 4 °C.
6. Prossiga da etapa 6.3 em diante. A membrana pode ser removida e reapalpada até três vezes adicionais.

Resultados

Para demonstrar a eficiência de nosso protocolo de immunoblotting, analisamos proteínas de controle translacional endógenas e marcadas com afinidade em três tipos de amostras de X. laevis: oócitos estágio VI, embriões estágio 7 (blástula) e embriões estágio 10,5 (gástrula). Esses estágios foram escolhidos porque abrangem a transição da blástula média (estágio 8.5), que marca o início da transcrição zigótica robusta^13,14. Como o desenvolvimento antes da transição da blástula média ocorre na ausência de transcrição, os embriões pré-zigóticos (ou seja, controlados pela mãe) dependem fortemente de mecanismos de controle translacional para expressar proteínas de destino celular na resolução temporal e espacial correta¹⁵. Portanto, a transição da blástula média é um contexto vital para estudar as interações RNA-proteína.

Para analisar a expressão proteica via immunoblotting, oócitos e embriões de X. laevis foram injetados com 500 pg de mRNA que codifica a metade C-terminal de X. laevis Bicaudal-C (Bicc1) fundido a 3x tags de afinidade de hemaglutinina (HA). Optamos por analisar Bicc1 devido à sua relevância para a biologia de Xenopus e interações proteína-RNA. Bicc1 é uma proteína de ligação ao mRNA e repressor translacional que orienta as decisões de destino celular no embrião inicial 16,17,18. Mais tarde no desenvolvimento, afeta o padrão esquerda-direita ^19,20,21 e a função dos órgãos, incluindo os rins22,23,24,25. Bicc1 contém uma região que direciona a repressão translacional⁵ e os domínios de homologia hnRNP K (KH) que medeiam a ligação a mRNAs específicos ^5,26,27,28.

Os extratos foram preparados a partir de cinco oócitos ou embriões injetados com HA-Bicc1, juntamente com amostras não injetadas correspondentes como controles negativos. Um décimo de cada extrato foi eletroforesado em um gel bis-tris com gradiente de 4-12% e transferido úmido para uma membrana de nitrocelulose. A coloração de Ponceau da membrana para detectar proteína total confirmou a transferência bem-sucedida (Figura 3A). Como parte de nossos estudos, geramos um anticorpo em coelhos que reconhece a metade C-terminal da proteína Bicc1 humana. Este anticorpo foi usado para detectar a proteína Xl-Bicc1 endógena e exógena (Figura 3B). Trabalhos anteriores mostraram que a proteína Bicc1 está ausente dos oócitos de X. laevis , mas é expressa em embriões pré-MBT, antes que o genoma zigótico esteja ativo¹⁶. Isso sugere que, embora o mRNA de Bicc1 se acumule durante a oogênese, ele é reprimido translacionalmente. Em concordância com este trabalho anterior, Bicc1 endógena não foi detectada em oócitos. Em contraste, o anticorpo reconheceu Bicc1 endógeno (~MW 107 kDa) em embriões de estágio 7 e 10,5. Tomados em conjunto, esses resultados validam que o anticorpo reconhece a proteína Bicc1 endógena (Figura 3B, painel superior, ponta de seta vermelha). O anticorpo Bicc1 reconheceu uma proteína menor de aproximadamente 70 kDa em extratos preparados a partir de amostras injetadas de mRNA (Figura 3B, painel superior, ponta de seta preta, compare as pistas 2, 4 e 6 com as pistas 1, 3 e 5). Como controle da especificidade do anticorpo Bicc1, a membrana foi removida e resondada com um anticorpo contra a marca de afinidade HA. O anticorpo HA identificou a proteína de 70 kDa nas amostras injetadas, mas não reconheceu o Bicc1 endógeno (Figura 3B, segundo painel, ponta de seta preta). A detecção do termo C HA-Bicc1 varia em intensidade entre os estágios devido a diferenças na expressão proteica do mRNA injetado nos diferentes tipos de células.

Em seguida, expandimos os resultados testando a expressão de proteínas reguladoras translacionais endógenas que interagem com Bicc1. Primeiro, analisamos a expressão da Subunidade 1 do Complexo de Transcrição Ccr4-Not (Cnot1), uma grande proteína de andaime e parte do complexo Ccr4-Not deadenylase (CNOT). O complexo CNOT de múltiplas subunidades é uma das principais deadenilases eucarióticas e é conhecido principalmente por aparar a cauda poli (A) no final dos mRNAs mensageiros como um prelúdio para sua degradação. No entanto, esse complexo tem diversos papéis no controle translacional que se estendem além da deadenilação²⁹. Estávamos interessados em testar a expressão de Cnot1 devido à importância do complexo CNOT para a regulação do mRNA e observações anteriores de que Cnot1 interage com Bicc1^20,30. Para analisar a expressão de Cnot1, usamos um anticorpo que reconhece a proteína Cnot1 endógena. Ele identificou duas proteínas a 250 kDa e 270 kDa em cada amostra, o tamanho previsto de Cnot1 (Figura 3B, terceiro painel). Assim, este protocolo nos permite identificar prontamente um componente crítico de um complexo regulatório. Além disso, esses dados apóiam a capacidade do protocolo de identificar com sucesso proteínas de alto peso molecular.

Para testar ainda mais a generalização desses resultados, analisamos amostras quanto à presença de uma proeminente helicase DEAD-box envolvida na repressão translacional, DEAD-box helicase 6 (Ddx6, anteriormente conhecida como xp54 em Xenopus e me31b em Drosophila). Ddx6 é um componente importante dos grânulos de ribonucleoproteína, está envolvido no armazenamento de mRNA e interage com Bicc1 e Cnot1 ^6,31,32. Um anticorpo reconhecendo o Ddx6 endógeno identificou uma proteína de cerca de 54 kDa em cada amostra (Figura 3B, quarto painel). A expressão foi reduzida em embriões zigóticos (Figura 3B, compare as pistas 5 e 6 a 1-4), conforme relatado anteriormente³³.

Finalmente, para garantir que as diferenças observadas entre as amostras fossem devidas a diferenças na expressão, retiramos e resondamos o immunoblot com um anticorpo que reconhece a enzima gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (Gapdh). Gapdh serve como um "controle de carregamento" expresso de forma onipresente. Níveis equivalentes de expressão de Gapdh confirmam a coloração de Ponceau: uma quantidade igual de proteína total está sendo analisada em amostras (Figura 3B, quinto painel).

Juntos, esses resultados confirmam a eficácia desse método de immunoblot. Fomos capazes de identificar Bicc1 exógeno e endógeno em vários estágios de desenvolvimento de X. laevis relevantes para o estudo das interações RNA-proteína: oócitos e embriões pré-MBT, que contêm apenas mRNAs depositados maternalmente, e embriões pós-MBT, que também incluem mRNAs transcritos zigoticamente. Fomos capazes de generalizar esses resultados analisando a expressão de múltiplas proteínas de controle translacional em uma variedade de pesos moleculares (Bicc1, Cnot1 e Ddx6) e um controle de carga (Gapdh). Também mostramos que este protocolo pode ser usado para embriões de X. tropicalis com modificação para aumentar a quantidade de material usado para explicar seu tamanho menor (Figura Suplementar 1).

Figura 3: Identificação dos níveis de proteínas reguladoras translacionais por meio de immunoblotting em X. laevis. (A) Coloração Ponceau do immunoblot para identificar proteína total de oócitos de X. laevis estágio VI, embriões estágio 7 e embriões estágio 10,5. Cada pista representa 10% da proteína preparada a partir de um extrato (0,5 oócito ou embrião). (B) Análise imunoblot de proteínas reguladoras translacionais selecionadas de X. laevis em oócitos estágio VI, embriões estágio 7 e embriões estágio 10,5. As pistas 2, 4 e 6 correspondem a amostras microinjetadas com mRNA HA-Bicc1 antes da análise, enquanto as pistas 1, 3 e 5 servem como controles negativos (não injetados). O anticorpo α-Bicc1 foi usado para testar a expressão de Bicc1 endógeno em todos os estágios (painel superior). O blot foi posteriormente removido e re-sondado com um anticorpo para a marca de afinidade HA como um controle para a especificidade do anticorpo α-Bicc1 (segundo painel). Os borrões foram removidos e reexaminados para proteínas reguladoras adicionais usando α-Cnot1 (terceiro painel) e α-Ddx6 (quarto painel). α-Gapdh (painel inferior) serviu como controle para carga igual de proteína. As pontas das setas vermelhas marcam a localização do Bicc1 endógeno, enquanto as pontas das setas pretas marcam a localização do termo C HA-Bicc1 expresso exogenamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Análise de immunoblot da proteína Bicc1 em Xenopus laevis versus Xenopus tropicalis. O anticorpo α-Bicc1 foi usado para testar a expressão de Bicc1 endógeno e exógeno em diferentes quantidades de extrato embrionário de X. laevis e X. tropicalis . Pista 1: 0,5 embrião de X. laevis não injetado. Pista 2: 0,5 embrião de X. laevis injetado em HA-Bicc1. Pista 3: 3 embriões de X. tropicalis não injetados. Pista 4: 1 embrião de X. tropicalis não injetado. Pista 5: 0,5 embrião de X. tropicalis não injetado. Dois anticorpos que reconhecem Bicc1 endógeno foram usados: um levantado contra Bicc1 humano (painel superior) e outro levantado contra X. laevis Bicc1 (painel do meio). α-Gapdh (painel inferior) foi usado para controlar a carga igual de proteína. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Embora simples em conceito, o immunoblotting é difícil na prática devido a várias etapas que duram vários dias. Como tal, alcançar resultados consistentes e de alta qualidade é muitas vezes um desafio. No entanto, o immunoblotting é um componente vital e onipresente da biologia moderna. Por exemplo, o immunoblotting é fundamental para confirmar a tradução e expressão bem-sucedidas do mRNA microinjetado em oócitos e embriões de X. laevis , destacando sua importância para a pesquisa de X. laevis . Além disso, os experimentos de imunoprecipitação utilizam immunoblotting para analisar as interações proteína-proteína in vivo . A detecção eficiente de proteínas específicas dependerá em grande parte de sua abundância e da qualidade dos reagentes de detecção de anticorpos. Neste estudo, as concentrações estimadas da proteína endógena que analisamos variam quase 500 vezes no ovo de Xenopus (Bicc1: 37,22 nM, Cnot1: 115,08 nM, Ddx6: 980,55 nM, Gapdh: 17.907,26 nM)³⁴, mas todos foram detectados prontamente. Abaixo dessa faixa, modificações podem ser feitas no fluxo de trabalho em essencialmente todas as etapas de um immunoblot - desde a coleta de amostras até a imagem - para melhorar a precisão e a eficiência da detecção, se necessário.

Que tipo de gel e membrana SDS-PAGE usar são considerações importantes para qualquer experimento de immunoblotting. Em nossa experiência, os géis pré-moldados são mais fáceis e reprodutíveis do que os géis produzidos internamente. Os géis pré-moldados têm a vantagem adicional de estarem disponíveis em formatos de gradiente, onde os géis aumentam gradualmente a concentração de poliacrilamida de cima para baixo. Os géis gradientes permitem que os pesquisadores resolvam e analisem uma ampla gama de proteínas com pesos moleculares muito diferentes. Isso evita a troca típica entre escolher um gel de baixa porcentagem de acrilamida (<7%), que resolve proteínas de alto peso molecular, versus um gel de alta porcentagem (>12%), que é melhor na resolução de proteínas de baixo peso molecular. Também é importante considerar se deve usar uma membrana de nitrocelulose ou fluoreto de polivinilideno (PVDF) para transferência de proteínas. O mecanismo e as vantagens de cada tipo de membrana foram amplamente discutidos^35,36. Em suma, o PVDF tem uma maior capacidade de ligação a proteínas (e, portanto, maior sensibilidade) do que a membrana de nitrocelulose e é mais durável para uso repetido. No entanto, o PVDF requer manuseio adicional na forma de ativação por incubação de metanol e é mais caro. Embora achemos que ambas as membranas são adequadas para a maioria das aplicações, usamos rotineiramente nitrocelulose devido a considerações de custo.

A imagem do immunoblot é um componente crucial do protocolo. Durante esta etapa, os pesquisadores devem exercer julgamento para capturar uma imagem de um immunoblot que transmita todas as informações necessárias, mas mantenha o ruído de fundo no mínimo. Existem dois métodos principais de imagem para anticorpos conjugados com HRP padrão: filme de raios-X ou sistemas de imagem digital. Em nossa experiência, capturar imagens com filme de raio-X tem muitos benefícios. Os filmes de raios-X são geralmente muito mais sensíveis do que os sistemas de imagem digital, facilitando a detecção de proteínas de baixa abundância. Os filmes de raios-X também produzem um registro físico do experimento que pode ser anotado e digitalizado em alta resolução. No entanto, um sistema de imagem digital terá um alcance linear muito superior - a relação entre a intensidade do sinal e a intensidade da imagem - do que um revelador de filme. Devido à sua sensibilidade, um filme de raios-X pode ficar superexposto rapidamente, perdendo informações quantitativas. Portanto, um pesquisador que busca a quantificação precisa de seus resultados deve usar um sistema de imagem digital ou tomar cuidado especial para não superexpor imunomanchas em desenvolvimento com filme de raios-X.

Se os resultados do immunoblotting forem insatisfatórios após seguir o protocolo conforme descrevemos, como bandas fracas ou "borradas" na imagem, vários ajustes podem ser feitos para melhorar o resultado. Por exemplo, a quantidade de mistura de proteína Xenopus analisada pode ser ajustada. A proteína total de apenas um quinto de um embrião pode produzir resultados fortes, embora seja possível carregar até dois embriões ou oócitos por faixa de gel. Carregar muita proteína pode resultar em artefatos ou sinais de fundo altos e espúrios durante a imagem. Além disso, a eletroforese em uma tensão mais baixa (100 V) por um tempo de execução mais longo geralmente leva a bandas de proteína mais nítidas. Da mesma forma, realizar a transferência de proteínas durante a noite a 4 ° C em baixa tensão (30 V) em vez de uma hora a 100 V pode melhorar a detecção de proteínas, especialmente para espécies de alto peso molecular. Por fim, algumas incubações de anticorpos primários detectam seus alvos de forma mais robusta usando incubações de 1 hora à temperatura ambiente, em oposição a 4 ° C durante a noite. Esta modificação do protocolo deve ser testada para cada anticorpo primário.

A identificação de anticorpos para detectar proteínas endógenas apresenta um grande desafio para o immunoblotting em Xenopus, pois relativamente poucos anticorpos específicos para Xenopus estão disponíveis comercialmente. Os pesquisadores podem se beneficiar de fontes não comerciais de anticorpos Xenopus, como Xenbase³⁷ (https://www.xenbase.org/xenbase/), o Banco de Hibridoma de Estudos de Desenvolvimento (https://dshb.biology.uiowa.edu/) e o Centro Europeu de Recursos Xenopus (https://xenopusresource.org/). Alternativamente, os anticorpos gerados para reconhecer proteínas humanas ou de camundongos podem ser úteis para detectar proteínas homólogas de Xenopus, dependendo da conservação das regiões usadas para a produção de anticorpos. Por exemplo, um anticorpo Bicc1 apresentado neste protocolo foi levantado contra a proteína Bicc1 humana. Para tais reagentes, a capacidade de reação cruzada com proteínas Xenopus deve ser determinada empiricamente. Embora os epítopos exatos que as empresas usam para criar anticorpos sejam geralmente proprietários, muitos fornecerão uma gama de aminoácidos para o epítopo mediante solicitação. Essa região pode então ser alinhada com a região correspondente da proteína homóloga de Xenopus. Embora o sucesso não seja garantido, normalmente tivemos sucesso quando o epítopo usado para a produção de anticorpos nas espécies-alvo exibe pelo menos 75% ou mais de semelhança com o trecho de sequência comparável em Xenopus. Os anticorpos gerados contra proteínas não-Xenopus devem ser validados antes do uso extensivo, pois a verificação inadequada de anticorpos é um dos principais contribuintes para pesquisas irreprodutíveis^38,39. Isso pode ser feito expressando uma proteína Xenopus marcada de interesse em embriões por meio de microinjeção de mRNA⁴⁰. A análise das mesmas amostras com um anticorpo para a marca de afinidade é então usada para confirmar que o anticorpo para a proteína endógena e o anticorpo para a proteína marcada reconhecem a mesma entidade (como na Figura 3B).

A análise de proteínas de ligação ao RNA, especialmente aquelas com funções regulatórias, como Bicc1, pode ser desafiadora devido à escassez de reagentes e à baixa expressão de moléculas reguladoras potentes. Esse problema se torna mais aparente no immunoblotting, onde cada reagente deve ser otimizado separadamente, e encontrar anticorpos de especificidade e sensibilidade suficientes pode ser difícil. Nossa intenção com este protocolo é abordar as limitações específicas do immunoblotting em Xenopus e elaborar as etapas aplicáveis a outros sistemas, de modo que os pesquisadores possam superar as dificuldades de analisar proteínas de ligação ao RNA.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Envoltura Premium Heavy Duty de 100 pés quadrados	Saran	2570000130
Buffer de Lise Celular 10x	Tecnologia de Sinalização Celular	#9803
2-Mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148
Prata de Assamento/Serviço Oblongo de 2 quartos	Pyrex	71160010116
2x Buffer de Amostra Laemmli	Bio-Rad	#1610737
Anticorpo de Alta Afinidade Anti-HA	Roche	11867423001	Preparado conforme orientado e usado na diluição 1:10.000.
Anti-IgG do Coelho, Anticorpo Ligado à HRP	Tecnologia de Sinalização Celular	7074S	Usado com diluição 1:30.000.
Fita de autoradiografia, 5 x 7 polegadas	Produtos de Pesquisa Internacional	420057	Não é necessário se estiver usando um sistema de imagem digital.
Bel-Art Pilões Descartáveis	Millipore Sigma	BAF199230001
Anticorpo do Coelho Bicaudal-C (Humano)	Envigo Bioproducts (atualmente Inotiv)	N/A	Encomendado sob medida. Usado com diluição 1:20.000.
Anticorpo do Coelho Bicaudal-C (Xenopus)	Envigo Bioproducts (atualmente Inotiv)	N/A	Encomendado sob medida. Usado com diluição 1:20.000. Ref. Park et al., 2016
Albumina Sérica Bovina	Sigma-Aldrich	A3294	Um substituto do leite desnatado no tampão bloqueador.
Centrífuga 5425	Eppendorf	13-864-456
Filme CL-XPosure	ThermoFisher Scientific	34091	Não é necessário se estiver usando um sistema de imagem digital.
Anticorpo monoclonal de coelho CNOT1 (D5M1K)	Tecnologia de Sinalização Celular	#44613	Usado com diluição 1:2.000.
DDX6/RCK (D26C11) Anticorpo Monoclonal de Coelho	Tecnologia de Sinalização Celular	#8988	Usado com diluição 1:5.000.
E-Z Store and Pour Revelador	MXR Imaging	103633	Não é necessário se estiver usando um sistema de imagem digital.
Loja e Fixador de Derrames E-Z	MXR Imaging	114511	Não é necessário se estiver usando um sistema de imagem digital.
Anticorpo Monoclonal GAPDH	ProteinTech	60004-1-IG	Usado com diluição 1:40.000.
Liberador de gel	Bio-Rad	#1653320
Anticorpo Secundário Anti-Camundongo IgG (H+L) de Cabra, HRP	Invitrogen	A16066	Preparado conforme orientado e usado com diluição de 1:40.000.
Bolsa de gelo, 8 oz, 5 x 3 x 1"	Uline	S-18256
L-Cisteína	Sigma-Aldrich	C7352
Processador de Filme Médico	Konica Minolta	SRX-101A	Não é necessário se estiver usando um sistema de imagem digital.
Mini-PROTEAN  Alavanca de abertura da fita	Bio-Rad	#4560000
Mini-PROTEAN  Célula de Eletroforese Tetra Vertical	Bio-Rad	#1658004
Tanque de eletroforese MSE PRO 700ml Western Blot	MSE Supplies	BB2369
Membrana de Nitrocelulose, 0,45 & micro; m	Bio-Rad	#1620115
Leite desnatado	Sanalac	1570000180
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rat IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	112-035-003	Preparado conforme orientado e usado na diluição 1:100.000.
Polissorbato (Pré-adolescente) 20	Biorreagentes Fisher	BP337-500
Ponceau S	VWR Ciências da Vida	K793-500ML	Uma aproximação pode ser feita com 0,5% Ponceau S, 1% ácido acético
Fonte de Alimentação Básica PowerPac	Bio-Rad	1645050
Balanço 2D de Velocidade Variável PR1MA	Ciência Média	R2D-30
Escada de Padrões Duplos de Cores Protein Precision Plus	Bio-Rad	#1610374	Qualquer escada de proteína de sua escolha pode ser usada.
Papel de Filtro para Cromatografia de Celulose Pura, 0,35 mm	Fisher Scientific	05-714-4
Restaurar o Buffer de Raspagem de Western Blot	ThermoFisher Scientific	#21059
Cloreto de sódio	Fisher Chemical	S640-10
Caixa de armazenamento 300 mL	Rosti Mepal	RST46608	Para bloqueio de membrana de nitrocelulose, incubação de anticorpos e lavagens
Substrato de Sensibilidade Máxima Femto do SuperSignal West	ThermoFisher Scientific	#34094	Um substrato quimioluminescente (ECL) aprimorado contendo dois componentes: luminol e realçador. Esse reagente ECL possui baixa sensibilidade ao femtograma.
Substrato Quimioluminescente SuperSignal West Pico PLUS	ThermoFisher Scientific	#34580	Um substrato quimioluminescente (ECL) aprimorado contendo dois componentes: luminol e realçador. Esse reagente ECL possui sensibilidade entre picograma e femtograma.
SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 4&ntraço; 12%, 10 poços de geléis de poliacrilamida	GenScript	M00652
Pó de Transferência de Tampon	GenScript	M00652
Tris Base Ultrapure	USBiological	77-86-1
Tris-MOPS-SDS Correndo Pó Amortecedor	GenScript	M00138