Um método inovador de isolamento de endossomas de tecidos cardíacos de camundongos e co-cultura com cardiomiócitos

Resumo

Os endossomos são uma coleção de organelas de classificação intracelular que fazem parte da via de transporte da membrana endocítica. Estabelecemos um novo método para isolar endossomos do tecido cardíaco usando um equipamento de nanofiltração automática e investigamos a captação celular de endossomos co-cultivando-os com cardiomiócitos primários.

Resumo

Os endossomos são organelas ligadas à membrana que desempenham papéis essenciais no tráfego intracelular, transdução de sinal e reciclagem de membrana. Embora suas funções na biologia cardiovascular estejam ganhando reconhecimento, o isolamento eficiente de endossomos do tecido cardíaco continua sendo um desafio técnico significativo. Desenvolvemos um protocolo rápido e de alto rendimento para isolar endossomos do tecido cardíaco de camundongos, combinando fracionamento subcelular com uma plataforma de isolamento de nanofiltração ultrarrápida. Este método inclui centrifugação sequencial, nanofiltração e recuperação de vesículas baseada em membrana nanoporosa. Os endossomos isolados foram caracterizados por western blotting, espalhamento dinâmico de luz (DLS) e análise de citometria de nanofluxo (NanoFCM). Para avaliar a bioatividade, endossomos purificados foram co-cultivados com cardiomiócitos neonatais primários. Os marcadores endossômicos EEA1 e Rab7 foram altamente enriquecidos em vesículas isoladas. A análise DLS revelou um diâmetro médio da vesícula de 187,30 ± 23,42 nm e um potencial zeta de -26,60 ± 5,79 mV (n = 12). A quantificação de NanoFCM rendeu aproximadamente 1,07 ± 0,31 × 10¹² partículas/mL (n = 12) de 100 mg de tecido cardíaco. A captação funcional de endossomos pelos cardiomiócitos foi observada após co-cultura in vitro , indicando preservação da integridade e atividade da vesícula. Esta plataforma de isolamento integrada fornece um método reprodutível e eficiente para a extração de endossomos de alta pureza dos tecidos cardíacos. O protocolo facilita os estudos bioquímicos e funcionais a jusante, oferecendo uma ferramenta valiosa para investigar os papéis dos endossomos na fisiologia e doença cardiovascular.

Introdução

Os endossomos são organelas intracelulares essenciais que regulam a endocitose, a classificação da carga e as vias de sinalização ^1,2. Os receptores de sinalização ativados e outras proteínas reguladas negativamente são inicialmente classificados em vesículas intralumenais (ILVs) dentro dos endossomos iniciais (EEs), que então amadurecem em corpos multivesiculares (MVBs) ou vesículas portadoras endossômicas (ECVs). Essas vesículas subsequentemente se fundem com os endossomos tardios (LEs), que servem como centros de triagem secundários para direcionar a carga para a degradação lisossômica ou caminhos alternativos. Os ILVs também podem ser secretados como exossomos após a fusão do endossomo com a membrana plasmática ^3,4. Paralelamente, a via da autofagia fornece material citosólico aos LEs via autofagossomos, que adquirem capacidade degradativa após a fusão com compartimentos endocíticos tardios⁵. Os endossomos são agora reconhecidos como reguladores críticos da reciclagem do receptor⁶, localização do canal iônico⁷, biogênese do exossomo⁸ e comunicação intercelular⁹ - processos que são especialmente pertinentes em células especializadas, como neurônios e cardiomiócitos.

Evidências emergentes destacaram o papel fundamental das vias endossômicas na função cardiovascular. A proteína 3 do domínio de homologia Eps15 (EHD3) regula a reciclagem endossômica dos principais transportadores de íons cardíacos, incluindo o trocador Na⁺/Ca²⁺ e os canais de Ca²⁺ do tipo L. A deficiência de EHD3 em camundongos leva a bradicardia, anomalias de condução e manipulação alterada de Ca^{2+ 10}. O tráfego funcional endossomo-lisossomo nas células musculares lisas vasculares previne a calcificação medial induzida por fosfato, que é relevante para doença renal crônica e aterosclerose¹¹. No entanto, os papéis funcionais dos endossomos nas doenças cardiovasculares e seu potencial como alvos terapêuticos permanecem incompletamente compreendidos, justificando uma investigação mais aprofundada.

Vários métodos permitiram o isolamento bioquímico de endossomos funcionalmente intactos. Marsh e colegas primeiro combinaram centrifugação de gradiente de densidade com eletroforese de fluxo livre para recuperar endossomos precoces e tardios, preservando sua acidificação e integridade estrutural¹². Metodologias recentes, como a abordagem do gradiente de sacarose, oferecem uma rota padronizada para separar populações endossômicas precoces e tardias, essencial para estudos proteômicos e lipidômicos a jusante¹³. Kits comerciais baseados em coluna giratória foram desenvolvidos para aplicações de alto rendimento.

O isolamento de exossomos por meio do sistema automático de isolamento ultrarrápido utiliza tecnologia inovadora de nanofiltração ultrassônica, que possui um sistema de nanofiltração de membrana dupla integrado com oscilação periódica de pressão negativa e oscilações harmônicas duplamente acopladas para permitir o isolamento de exossomos de alta pureza de biofluidos¹⁴. Aqui, combinamos o fracionamento subcelular com o isolamento do endossomo usando o sistema automático de isolamento ultrarrápido para obter um novo método para isolamento rápido do endossomo com alto rendimento e alta pureza do tecido cardíaco do camundongo.

Além disso, co-cultivamos os endossomos extraídos com cardiomiócitos primários (MC) in vitro e descobrimos que os endossomos exógenos entraram no MC com sucesso. Usando um repórter de endossomo, no qual a proteína Numb localizada no endossomo foi fundida com a proteína fluorescente vermelha mCherry^15,16, observamos a fluorescência mCherry localizada dentro de CMs com um padrão de puncta.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados seguindo as Diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde sobre o Uso de Animais de Laboratório e com a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Houston.

NOTA: Antes de iniciar o procedimento de isolamento, é essencial garantir que todos os tampões necessários foram preparados e resfriados a 4 °C. Instrumentos esterilizados, placas de cultura de tecidos e tubos apropriados devem ser dispostos em estações de trabalho designadas, com todos os materiais mantidos em gelo ou a 4 °C, a menos que especificado de outra forma. As centrífugas e os rotores devem ser pré-equilibrados a 4 °C durante um mínimo de 2-3 h antes da utilização. O tampão de fracionamento deve ser preparado antes do dia do experimento e armazenado a 4 °C, e mantido no gelo durante o experimento até que seja necessário. Salvo indicação em contrário, todas as etapas de incubação e centrifugação devem ser realizadas a 4 °C.

1. Preparação do lisado cardíaco

1. Desinfetar a área cirúrgica com etanol a 70%, seguido da colocação de uma almofada absorvente estéril na superfície de trabalho, sobre a qual são dispostos os instrumentos cirúrgicos esterilizados.
2. Eutanasiar camundongos (machos C57BL/6, 8-12 semanas, 20-25 g, e mCherry: machos NumbKI, 8-12 semanas, 20-25 g) por inalação de CO₂ (10-30% CO₂ por 3-5 min) ou por um método alternativo aprovado pelo comitê institucional relevante de cuidados e uso de animais.
   CUIDADO: Por favor, opere em um espaço aberto e certifique-se de que o cilindro de CO₂ feche a tempo de evitar vazamentos. Os camundongos devem ser monitorados durante a eutanásia para confirmar a perda de consciência e o procedimento adequado. Uma vez inconsciente, use um método secundário, como luxação cervical, toracotomia ou exsanguinação, para garantir a morte.
3. Posicione o mouse em decúbito dorsal e limpe a região torácica com etanol a 70%.
   1. Abra a cavidade torácica rapidamente para colher o coração e transfira o coração para a solução salina balanceada de Hank (HBSS) gelada em um prato de 60 mm colocado sobre gelo.
   2. Remova o sangue residual suavemente das câmaras cardíacas usando uma pinça e lave muito bem o coração até que não haja mais sangue nas câmaras. Mantenha o coração no gelo durante todo o processamento.
      NOTA: Guarde 50-100 mg de tecido cardíaco para análise de western blot (WB) como controle positivo. O coração pode ser congelado em nitrogênio líquido e armazenado a -80 °C por até 6 meses.
4. Adicione 8 mL de tampão de fracionamento (Tabela 1) a um tubo de 50 mL no gelo. Transfira 100-120 mg de tecido cardíaco de camundongo fresco ou congelado para um tubo contendo o tampão de fracionamento.
   NOTA: Qualquer parte do tecido cardíaco do camundongo pode ser usada para extrair endossomos. É necessário um mínimo de 100 mg de tecido cardíaco para produzir endossomos suficientes para análises subsequentes. Para garantir a consistência entre os grupos experimentais, o tecido deve ser pesado com precisão antes da adição ao tampão de fracionamento.
   CUIDADO: Use EPI apropriado ao operar o tampão de fracionamento para evitar qualquer contato direto com o corpo.
5. Pique o tecido em cerca de 1 mm³ pedaços usando uma tesoura de microcirurgia em tampão de fracionamento no gelo o tempo todo.
6. Homogeneizar com um homogeneizador elétrico em velocidade média, em um ciclo de parada de 40 s de trabalho e 30 s. Homogeneizar por 5-7 ciclos (Figura 1A).
   NOTA: Um processo de homogeneização completo é essencial e ajudará a aumentar a concentração final de endossomos.
7. Sonicar o lisado cardíaco homogeneizado por 10 min em banho-maria gelada com banho ultrassônico (Figura 1A).

2. Fracionamento subcelular

1. Coloque um filtro de células de 40 μm sobre um tubo de centrifugação de 50 mL e filtre o lisado cardíaco homogeneizado através do filtro (Figura 1A).
2. Para o pellet nuclear: centrifugar o lisado cardíaco a 1.000 × g durante 5 min a 4 °C. Transfira o sobrenadante e coloque-o em um tubo recém-rotulado.
   NOTA: Colete o pellet, que é a fração nuclear, e ressuspenda o pellet nuclear em 200 μL WB Lysis Buffer se a fração nuclear for necessária para WB. Pipete suavemente o pellet nuclear com tampão de ensaio de imunoprecipitação de rádio (RIPA) para cima e para baixo 20 vezes e sonice por 10 min. Centrifugue o lisado nuclear a 14.000 × g por 10 min. Recolher o sobrenadante e conservá-lo a -80 °C para posterior utilização. A etapa 2.2 é opcional; ele pode ser ignorado se apenas vesículas forem necessárias.
3. Para a fracção mitocondrial: centrifugar novamente o sobrenadante a 10.000 × g durante 10 min a 4 °C. O pellet contém a fração mitocondrial. Transferir o sobrenadante e colocá-lo num novo tubo ultracentrifugado.
   NOTA: Se uma fração mitocondrial for desejada para WB, salve o pellet como etapa 2.2 conforme descrito na NOTA anterior.
4. Equilibre cuidadosamente os tubos. Pese cada tubo e adicione tampão de fracionamento a frio adicional ao tubo mais leve para garantir o mesmo peso. Pré-resfrie o rotor da ultracentrífuga e os adaptadores por 2-3 h a 4 °C. Ultracentrifugar o sobrenadante a 160.000 × g durante 30 min a 4 °C.
   NOTA: Durante a etapa de ultracentrifugação, é fundamental garantir que todos os tubos da ultracentrífuga estejam devidamente balanceados e preenchidos com tampão a aproximadamente 0.5-1 cm abaixo da borda. O enchimento inadequado pode resultar em deformação ou colapso do tubo devido às altas forças centrífugas aplicadas.
5. Remova o sobrenadante em um tubo novo. O sobrenadante contém endossomos. Configure uma seringa de 10 mL conectada a um filtro de seringa de 0,45 μm em cima de um tubo de centrifugação de 50 mL e filtre o sobrenadante no tubo. Adicione 5 mL de tampão PBS esterilizado para diluir a solução e evitar entupir o filtro.
   NOTA: A etapa de filtragem garante que todos os endossomos no sobrenadante estejam <450 nm ao iniciar as etapas de isolamento.
6. Ressuspenda o pellet com 5 mL de tampão PBS esterilizado da etapa 2.4 e pipete para cima e para baixo pelo menos 20 vezes para misturar bem o pellet. O pellet contém outras vesículas intracelulares. Configure uma seringa de 10 mL conectada a um filtro de seringa de 0,45 μm em cima de um tubo de centrifugação de 50 mL e filtre a solução do pellet no tubo. Adicione mais 5 mL de tampão PBS esterilizado para diluir a solução e evitar entupir o filtro.
   NOTA: A etapa de filtragem garante que todas as vesículas do pellet estejam <450 nm ao iniciar as etapas de isolamento.

3. Processo de isolamento de endossomos e outras vesículas intracelulares

1. Diluir o sobrenadante filtrado do passo 2.5 e a solução de pellets filtrada do passo 2.6 com tampão PBS esterilizado até um volume final de 30 ml em tubos de 50 ml, respetivamente. Armazenar as amostras a 4 °C (figura 1A).
   NOTA: As amostras podem ser armazenadas a 4 °C durante 24 h. Se não houver tempo suficiente para realizar as etapas seguintes no mesmo dia, elas podem ser armazenadas em uma geladeira a 4 °C e aguardar o dia seguinte para continuar o experimento.
2. Ligue o instrumento e inicie o programa de limpeza diária, que geralmente leva 20 min.
3. Escolha o dispositivo de isolamento Medium EXODUS (M EID) para isolamento. Instale um adaptador de tubo de 50 mL e coloque o tubo de 50 mL com a amostra na posição da amostra. Toque em EID na tela e carregue M EID.
   NOTA: O EID médio é para uma amostra de 20-50 mL, recomendando 30 mL.
4. Configurar o programa:
   1. Insira o nome da amostra e o volume da amostra.
   2. Selecione o tipo de amostra: Plasma.
   3. Selecione o programa: Plasma. Forte-MA. A03.
   4. Selecione um tubo de centrífuga: 50 mL.
   5. Ative o Modo de Alta Pureza.
   6. Selecione a opção de programa 3000.
   7. Toque em OK para começar.
      NOTA: Todo o processo de isolamento leva de 1 a 2 horas para ser concluído. Uma concentração maior de amostras levará mais tempo.
5. Recuperar endossomos e outras vesículas intracelulares:
   1. Recupere o EID e leve-o ao capô para as próximas etapas.
   2. Transfira 200 μL de tampão PBS esterilizado para o EID com uma pipeta de 200 μL. Enxágue os dois lados da membrana nanoporosa 20 vezes, respectivamente.
   3. Colete os endossomos ou outras vesículas intracelulares, ressuspenda em 200 μL em um tubo de 1,5 mL. Armazene-o a 4 °C se usado em 24-48 h, ou a -80 °C para armazenamento de longo prazo.
      NOTA: O eluído contém os endossomos ou outras vesículas intracelulares e é usado para análise posterior e co-cultura com cardiomiócitos. A amostra de endossomos é estável quando armazenada a -80 °C por 5 meses, com base nos dados obtidos.
6. Eluir endossomos e outras vesículas intracelulares para WB:
   1. Recupere o EID. Transfira 80 μL de tampão de lise WB para o EID. Enxágue os dois lados da membrana nanoporosa 20 vezes, respectivamente.
   2. Incube o EID no gelo por 30 min para garantir a solubilização completa, pipete o tampão dentro do EID a cada 10 min. Colete os endossomos ou outras vesículas intracelulares lisadas em tubos de 1,5 mL. Centrifugue por 10 min a 14.000 × g a 4°C. Colete e armazene o sobrenadante a -80 °C para armazenamento de longo prazo. Descarte o pellet se algum pellet permanecer no tubo.

4. Quantificação de proteínas endossômicas e caracterização de vesículas

1. Análise de Western blot
   1. Economize 5 μL de cada amostra para quantificar a concentração de proteína usando um ensaio de ácido bicinconínico (BCA).
   2. Dilua as amostras em tampão de amostra de 4× Laemmli e misture bem por vórtice. Aqueça as amostras a 95 °C por 10 min para desnaturar as proteínas.
   3. Centrifugar as amostras desnaturadas a 14.000 × g durante 10 min a 4 °C e recolher o sobrenadante resultante para análise.
   4. Monte géis de poliacrilamida no aparelho de eletroforese e encha a câmara com tampão de corrida de dodecil sulfato de sódio (SDS).
   5. Carregue um marcador de peso molecular e as amostras de proteína preparadas no gel, selecionando uma porcentagem apropriada de acrilamida com base no peso molecular das proteínas-alvo.
      NOTA: Normalmente, 20 μg de proteína são carregados por poço para lisados de tecido cardíaco e lisados de endossomos.
   6. Execute o gel a 6 V por aproximadamente 120 min ou até que a frente do corante atinja o fundo do gel.
   7. Transfira proteínas do gel para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) usando um sistema de transferência de western blotting.
      NOTA: O método de transferência úmida também funciona bem.
   8. Enxágue a membrana de PVDF brevemente com solução salina tamponada com Tris contendo 0,05% de Tween-20 (TBST).
   9. Bloqueie a membrana com TBST suplementado com albumina de soro bovino (BSA) a 1% por 1 h à temperatura ambiente.
   10. Incubar a membrana durante a noite a 4 °C com anticorpo primário (Tabela de Materiais) específico para o marcador endossômico selecionado, usando um balanço suave.
   11. No dia seguinte, lave a membrana três vezes com TBST, cada lavagem com duração de 10 min em temperatura ambiente em uma cadeira de balancim.
       NOTA: A lavagem adequada é essencial para reduzir o fundo inespecífico; Certifique-se de que a membrana permaneça totalmente hidratada durante todo o processo.
   12. Incubar a membrana com o anticorpo secundário adequado (Tabela de Materiais) durante 1 h à temperatura ambiente.
   13. Lave a membrana três vezes com TBST, cada lavagem com duração de 10 min em um balancim em temperatura ambiente.
   14. Aplique substrato quimioluminescente na membrana para a detecção de proteínas ligadas a anticorpos.
   15. Usando um sistema de imagem de gel para expor a membrana e tirar imagens das proteínas.
2. Análise de espalhamento dinâmico de luz (DLS)
   1. O tamanho da partícula e o potencial zeta dos endossomos são medidos usando a técnica de espalhamento dinâmico de luz (DLS)¹⁷. usando um Litesizer 500 (Anton Paar) equipado com o software Kalliope versão 2.10.4. As medições DLS são realizadas em triplicata usando um laser de 658 nm com um ângulo de detecção de 90° a 25 °C.
   2. Faça uma diluição de "nanoesferas padrão de tamanho" em água ultrapura, adicione 1 mL de volume na cubeta descartável e coloque-a na câmara.
      NOTA: Use nanoesferas padrão (pequenas ou grandes) de acordo com o tamanho esperado da amostra desconhecida.
   3. Abra o software DLS e clique na nova guia de medição . Selecione o tamanho da partícula no modo de medição. Nomeie o arquivo no campo Sem título e coloque os parâmetros de entrada (solvente, temperatura, etc.) e clique em iniciar. Depois de determinar o tamanho das partículas padrão, retire a cubeta da câmara.
   4. Faça uma diluição do "material de referência do potencial zeta" em água ultrapura, coloque-o na cubeta ômega do potencial zeta e coloque-o na câmara da cubeta. Clique na nova guia de medição no software. Selecione o potencial zeta no modo de medição. Nomeie o arquivo no campo Sem título e coloque os parâmetros de entrada (solvente, temperatura, etc.) e clique em iniciar.
   5. Para a determinação do tamanho das partículas e do potencial zeta dos endossomos, diluir a amostra do endossomo em água ultrapura, colocá-la nas respectivas cubetas e colocá-las na câmara da cubeta. Faça medições da mesma forma descrita para os padrões.
      NOTA: Faça uma diluição das amostras desconhecidas de acordo com a concentração das amostras em água ultrapura.
3. Análise NanoFCM
   NOTA: As concentrações de partículas de endossomo são determinadas usando o NanoFCM Flow NanoAnalyzer com o software Professional Suite V2.3¹⁸. A aquisição do sinal de partículas é realizada por 2 min usando um laser azul de 488 nm ajustado para 20 mW com 0,2% de decaimento SS e/ou um laser vermelho de 638 nm ajustado para 8 mW com 10% de decaimento SS, a uma pressão de amostragem de 1,0 kPa modulada e mantida por um módulo de pressão baseado em ar. A amostra é focada em 1,4 μm usando água ultrapur como fluido da bainha por meio de uma alimentação por gravidade. O alinhamento ideal do laser é testado e calibrado usando esferas de controle de qualidade de coquetel de nanoesferas de sílica (S16M-Exo). As medições de calibração de tamanho são realizadas antes da análise usando grânulos padrão de tamanho S16M-Exo (coquetel de nanopartículas de sílica contendo diâmetros de 68, 91, 113 e 155 nm de partículas com concentração conhecida de 2,17 × 10¹⁰/mL).
   1. Aquisição padrão de concentração:
      1. Inicie e inicialize os fluidos do nanoFCM. Dilua os grânulos de CQ (1:100) em água ultrapura filtrada por membrana de 0,22 μm, adicione a um tubo de 0,5 mL e coloque na doca de carregamento. Selecione QC FL SiNPs no menu suspenso Sample Inf e insira o fator de diluição da amostra de grânulos QC.
      2. No menu suspenso Sample Flow , selecione boost para introduzir a amostra de CQ em alta velocidade e remover a solução de limpeza do sistema por 45 s. Durante o impulso, defina a potência do laser para 20/50 mV para o laser azul de 488 nm e 20/100 mW para o laser vermelho de 638 nm, com 0.2% de decaimento SS.
      3. Selecione amostragem no menu suspenso Sample Flow e faça o ajuste de limite para o sinal grande. Durante a amostragem, ajuste o alinhamento da lente de condensação do sinal manualmente e o alinhamento da lente de foco a laser a partir do software, se necessário. O ajuste automático do limite para um sinal grande deve permanecer entre 50-120 para o canal de dispersão lateral e menos de 75 para ambos os canais de fluorescência.
      4. Clique em Tempo de registro para adquirir os dados por 120 s. Certifique-se de que a região de interesse (ROI) esteja entre 1500 e 15000 ao adquirir os dados. Salve o arquivo de resultado na pasta pop-up com a extensão "nfa" e descarregue o tubo de amostra.
         NOTA: Após cada execução de amostra, use solução de limpeza (1x) para remover a amostra processada da tubulação, impulsionando-a por 45 s. Em seguida, mergulhe a ponta capilar em água ultrpura para remover a solução de limpeza residual do lado de fora do capilar antes de carregar a próxima amostra.
   2. Aquisição padrão de tamanho:
      1. Diluir as "esferas de tamanho padrão" (1:100) em água ultrpaure filtrada por membrana de 0,22 μm e colocá-las no cais de carga. Selecione 68-155 S16M-Exo no menu suspenso Sample Inf e insira o fator de diluição da amostra de grânulos padrão de tamanho.
      2. No menu suspenso Sample Flow , selecione boost para introduzir o tamanho padrão de grânulos e remova a solução de limpeza do sistema por um período de 45 s. Durante o impulso, defina a potência do laser para 8/50 mV para o laser azul de 488 nm e 20/100 mW para o laser vermelho de 638 nm, com 10% de decaimento SS.
      3. Selecione Sampling no menu suspenso Sample Flow e faça o ajuste de limite para um sinal pequeno. Quatro picos distintos (68 nm, 91 nm, 113 nm, 155 nm) devem ser visíveis na janela. Clique em Tempo de registro para adquirir os dados por 120 s. Salve o arquivo de resultado na pasta pop-up com extensão "nfa" e descarregue o tubo de amostra.
   3. Aquisição standard em branco:
      1. Use água ultrapura ou (tampão/diluente da amostra) para fazer a medição no mesmo processo descrito acima, salve o file com o nome "em branco" na pasta com extensão "nfa" e descarregue o tubo de amostra.
   4. Determinação da concentração de partículas de endossomos
      1. Diluir a amostra do endossomo em água ultrapura e colocá-la no cais de carga.
      2. Depois de aumentar e amostrar a amostra, clique em Tempo de gravação para iniciar as medições. Se o limite não estiver dentro da faixa de 50-120 para o canal de dispersão lateral, ou o ROI for superior a 15.000, considere diluir a amostra.
   5. Análise de dados:
      1. Alterne da guia Aquisição para a guia Análise no software e abra os arquivos "nfa" salvos. Defina o padrão de concentração abrindo o arquivo salvo de resultados de CQ date__QC FL SnNPs.nfa, defina o limite no sinal grande clicando na ferramenta definir limite.
      2. Selecione a concentração de partículas usando a ferramenta de passagem circular. Clique em Contar STD e verifique a concentração de grânulos de CQ (2,17 × 10¹⁰/mL) antes de fechar a janela.
      3. Para definir o padrão de tamanho, abra o arquivo date_68-155 S16M-Exo.nfa. Clique na ferramenta Tamanho para abrir a janela de geração de curva padrão e defina o limite para o sinal pequeno clicando na ferramenta definir limite.
      4. Selecione S16 exo 68-155 nm no menu suspenso Definido pelo usuário . Clique em Localizar Picos para identificar as intensidades de pico de SS das populações de quatro tamanhos.
      5. Selecione o arquivo em branco e clique em Definir em branco para identificar o número de falsos positivos para remoção da amostra. Para analisar a concentração do endossomo, primeiro selecione a amostra e defina o limite em um pequeno sinal clicando na ferramenta definir limite. Apresente os dados quantificados como um relatório de tamanho (nm) e concentração (partículas/ml).

5. Cultura primária de cardiomiócitos

NOTA: Isole os cardiomiócitos usando um kit de isolamento primário de cardiomiócitos, que fornece reagentes suficientes para o isolamento de cardiomiócitos de até 50 corações de camundongos ou ratos neonatais. O kit também inclui componentes adequados para apoiar a cultura primária de cardiomiócitos. Todos os meios e tampões devem ser removidos com cuidado para evitar perturbar as células. Recomenda-se a pipetagem manual usando uma ponta de pipeta de 1000 μL, a aspiração a vácuo deve ser evitada. A solução salina balanceada de Hank (HBSS) deve ser pré-resfriada a 4 °C antes de iniciar o procedimento.

1. Reconstitua a enzima de isolamento de cardiomiócitos 1 (contendo papaína), disponível no kit, adicionando 2. mL de HBSS resfriado para um frasco. Misture delicadamente por aproximadamente 5 min ou até que a enzima esteja totalmente dissolvida. Mantenha a solução enzimática no gelo durante todo o procedimento.
   NOTA: Um único frasco para injetáveis de enzima 1 reconstituída é suficiente para o isolamento de cardiomiócitos de 10 corações neonatais. Pode ser armazenado a -20 °C por até 6 meses e é estável por dois ciclos de congelamento e descongelamento. Se conservada a 4 °C, a solução deve ser utilizada no prazo de 1 semana para assegurar a atividade enzimática.
2. Coloque os corações neonatais recém-dissecados em um esterilizado individual 1. mL e adicione imediatamente 500 μL de HBSS gelado a cada tubo.
   NOTA: Recomenda-se processar um coração por tubo para maximizar o rendimento e a reprodutibilidade.
3. Pique o tecido cardíaco em fragmentos de 1 mm³ usando uma tesoura de dissecção estéril. Lave cada amostra duas vezes com 500 μL de HBSS gelado para remover o sangue residual.
4. A cada tubo, adicione 200 μL de Enzima de Isolamento de Cardiomiócitos 1 reconstituída (papaína) e 10 μL de Enzima de Isolamento de Cardiomiócitos 2 (contendo termolisina), disponível no kit. Misture e incube suavemente os tubos a 37 °C por 30-35 min.
   NOTA: A enzima de isolamento de cardiomiócitos 2 é fornecida como uma suspensão em HBSS e deve ser descongelada em gelo antes do uso. Homogeneizar a enzima pipetando para cima e para baixo para garantir uma suspensão uniforme antes de ser adicionada às amostras.
5. Após a digestão enzimática, aspirar cuidadosamente a solução enzimática e lavar cada amostra duas vezes com 500 μL de HBSS gelado.
6. Adicione mL de DMEM completo para isolamento de células primárias a cada tubo. Triture suavemente o tecido pipetando para cima e para baixo 25-30 vezes usando uma ponta de pipeta estéril de 1,0 mL. Minimize a formação de bolhas de ar durante esta etapa.
   NOTA: Interromper o tecido por pipetagem melhora o rendimento celular. No entanto, a pipetagem excessiva pode causar danos às células.
7. Centrifugar o sobrenadante a 300 × g durante 5 min.
8. Remova o DMEM completo cuidadosamente com uma pipeta. Adicione 1 mL de DMEM completo fresco ao tubo e pipete para cima e para baixo 25-30 vezes usando uma ponta de pipeta estéril de 1,0 mL. Evite bolhas de ar ao pipetar.
9. Depois que o tecido for principalmente uma suspensão de célula única, adicione 0,5 mL de DMEM completo para isolamento de células primárias a cada tubo para trazer o volume total para 1,5 mL. Combine suspensões celulares individuais para a determinação da concentração e viabilidade celular.

6. Co-cultura de endossomo com cardiomiócitos

1. Semear os cardiomiócitos numa placa de 60 mm e adicionar DMEM completo ao volume total.
   NOTA: Espera-se que cada coração de camundongo neonatal seja semeado em um prato, e o volume total de cada poço deve ser de 5 mL (Figura 1B).
2. Incubar a placa de 60 mm a 37 °C numa incubadora de CO₂ a 5% durante 24 h. Após 24 h, substitua o meio por um volume equivalente de DMEM completo fresco para isolamento de células primárias contendo suplemento de crescimento de cardiomiócitos diluído 1000x.
3. Transferir o eluído endossomaico produzido pela etapa 3 de -80 °C para -20 °C por 1 h. Em seguida, coloque os endossomos no gelo e descongele-os gradualmente.
   NOTA: O descongelamento gradual no gelo pode tornar a membrana dos endossomos mais intacta e reduzir a degradação.
4. Após 48 h, misture cada 100 μL de eluído de endossomo com 5 mL de DMEM completo fresco e substitua o meio antigo em cada placa. Co-cultura de endossomos com cardiomiócitos por 24 h.
5. Lave os cardiomiócitos com 2 mL de PBS estéril frio. Adicione tampão de lise gelado a cada prato com tampão de lise de 80-100 μL. Raspe as células usando um raspador de células de plástico frio e colete as células em tubos de 1,5 mL.
6. Execute o protocolo WB descrito na etapa 4.1.
7. Para imunocoloração (IF), siga as etapas descritas abaixo.
   1. Semeie cardiomiócitos em uma lâmina de câmara de 8 poços. Diluir a suspensão de célula única com DMEM completo de 1,5 mL para 3 mL.
   2. Semear 300 μl da suspensão em cada câmara. Repita as etapas 6.2 a 6.4.
   3. Fixe os cardiomiócitos com 200 μL de paraformaldeído a 4% (PFA) por 20 min em temperatura ambiente e lave com 200 μL de PBS estéril três vezes. A corrediça da câmara de 8 poços está pronta para IF.
      CUIDADO: Ao manusear 4% de PFA, use EPI apropriado. Por favor, descarte 4% de PFA em um recipiente adequado após o uso.

Resultados

Examinamos os níveis de expressão de marcadores para endossomas iniciais, endossomas tardios, lisossomos e autofagossomos entre cinco grupos: lisado do tecido cardíaco, fração nuclear, fração mitocondrial, outras vesículas intracelulares da etapa 2.6 e etapa 3.6 e endossomos da etapa 2.5 e etapa 3.6. O resultado do Western blot mostrou que o EEA1 (Antígeno Endossomo Precoce 1) teve o maior nível de expressão nos endossomas e quase não foi expresso em outros grupos (Figura 2A, B

Discussão

Neste estudo, apresentamos um método rápido e reprodutível para isolar endossomos de alta pureza de tecidos cardíacos de camundongos, combinando fracionamento subcelular com uma plataforma de isolamento ultrarrápida¹⁴. As abordagens tradicionais para isolamento de endossomos, como centrifugação com gradiente de densidade¹² ou isolamento imunológico, geralmente são demoradas e trabalhosas e requerem grandes quantidades de tecido ou anticorpo...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
µ-Slide 8 bem alto	ibidi	80806-90
Tubo de microcentrífuga graduado de 1,5 mL	EUA Científico	1615-5500
10x Tampão Tris/Glicina	Bio Rad	1610734
4x Tampão de Amostra Laemmli	Bio Rad	1610747
Centrífuga de bancada	Eppendorf	Centrífuga Eppendorf 5810R
Albumina de soro bovino	Sigma	A9418
filtro de células	Corning	CLS431750	Tamanho do poro 40  μ m, estéril
CELLSTAR Placas de cultura de tecidos	VWR	82050-546	Poliestireno, Estéril, 60 mm e agudo; 15 milímetros
Sistema de imagem ChemiDoc	Bio Rad	ChemiDoc XRS+
Solução de limpeza	NanoFCM	17159
DMEM para kits de isolamento de células primárias Pierce	Fisher Científico	PI88287
TDT	Fisher Científico	BP172
Dulbecco' s solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Thermo Científico	10010023
Reagente de detecção de Western blotting ECL	Bio Rad	1705061
EDTA	Sigma	E4884
EEA1	Sinalização celular	3288S	WB (1:1000)
EGTA	Sigma	E-4378-25
EID	ÊXODO	MA03 EID
ERp72	Sinalização celular	5033S	WB (1:1000)
Etanol	Loja de Pesquisa UH		200 Provas, 5 Galões
ÊXODO H-600	ÊXODO	H-600
GAPDH	Tecnologia de proteína	10494-1-AP	WB (1:5000)
Hank' s solução salina balanceada (HBSS)	Thermo Científico	14175095
HEPES	Sigma	H3375
Homogeneizador	Fisher Científico	15340167
Kcl	Sigma	Pág. 3911
Lâmpada1	Abcam	AB320851	WB (1:2000)
LC3	Sinalização celular	2775S	WB (1:1000)
Litesizer 500	Anton Paar	Litesizer 500	Outros equipamentos, como Zetasizer (Malvern) ou DLS  (Wyatt) pode ser usado
mCereja	Biorbyt	orb66657	WB (1:500)
MgCl2	Fisher Científico	BP214-500
NaCl	Sigma	S7653
NanoFCM	NanoFCM	NanoAnalisador de Fluxo
Padrões de tamanho de nanoesferas	Thermo Científico	3020UMA
Microscópio confocal Nikon AXR	Nikon	AXR
Solução de paraformaldeído 4% em PBS	Santa Cruz Biotecnologia	SC-281692
Sondas de marcação de faloidina	Invitrogen	Rolamento A22284	SE (1:500)
Pierce BCA Kits de Ensaio de Proteína	Thermo Científico	23227
Kit de isolamento de cardiomiócitos primários Pierce	Thermo Científico	88028
Filtro de seringa de polietersulfona	Millipore	SLHPR33RS	Tamanho do poro 0,45  μ m, estéril
Géis de proteína pré-moldados	Bio Rad	4561093
Grânulos QC	NanoFCM	QS2503
rab7	Sinalização celular	9367S	WB (1:1000)
Tampão de lise e extração RIPA	Thermo Científico	89900
Roche PhosSTOP (Coquetel PI)	Roche	4906837001
Nanoesferas de sílica	NanoFCM	S16M-Exo
Sacarose	Sigma	84097
Rotor de caçamba oscilante	Beckman Coulter	SW55Ti
Sistema de Transferência Turbo Trans-Blot Kits de Transferência RTA	Bio Rad	1704270
Pré-adolescente 20	Bio Rad	1662404
Ultracentrífuga	Beckman Coulter	Optima XE-90
Tubos de ultracentrífuga	Beckman Coulter	326819
Banho de limpeza ultrassônica	Ultrassom de Branson	CPX952238R
VWR Tube Cent 50 mL	VWR	89039-656
Centrífuga de tubo VWR 15 mL	VWR	89039-666
Material de referência potencial zeta	Anton Paar	175108