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Imagem Molecular Espacial do Glycome Usando Espectrometria de Massa

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DOI:

10.3791/69154

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28 de novembro de 2025

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1Center for Advanced Spatial Biomolecule Research (CASBR), University of Florida, Gainesville, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Florida, Gainesville, 3Markey Cancer Center, University of Kentucky, 4Department of Pathology & Laboratory Medicine, University of Kentucky

Neste artigo

Resumo

Este protocolo detalha os passos principais para permitir uma medição rigorosa e reprodutível tanto do glicogênio quanto dos glicanos N-ligados por meio de imagens por espectrometria de massas.

Resumo

A organização espacial do glycome dentro dos tecidos é fundamental para a base molecular da função fisiológica. O glycome diverso e dinâmico é fundamental para processos celulares fundamentais, incluindo metabolismo, sinalização e adesão. Inovações em biologia espacial abriram novos caminhos para a imagem molecular espacial de diversas turmas de glycome. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para imagem biomolecular espacial do glycome em fígado de camundongos congelados frescos. O fluxo de trabalho compreende (1) colheita e congelamento rápidos, (2) seção criológica na espessura e posição ideais, (3) preparação de tecidos e digestão enzimática no tecido usando enzimas ativas em carboidratos, (4) aplicação de matrizes e aquisição de dados por dessorção a laser/imagem de espectrometria de massa assistida por matriz (MALDI-MSI), e (5) processamento e visualização de dados para colocar os achados em contexto biológico. O uso dessa abordagem permite a aquisição de mapas espaciais detalhados de glicanos N-ligados e glicogênio, revelando características fisiológicas e celulares chave. Esses dados permitem definir a heterogeneidade glicômica espacial chave associada à função e disfunção hepática. Esse fluxo de trabalho permite glicômicas espaciais altamente reprodutíveis e sensíveis do fígado de camundongo. Além disso, é facilmente adaptável a outros tecidos ou espécies, facilitando novos insights espaciais sobre a biologia dos glycome na saúde e doenças.

Introdução

O campo da biologia espacial está se expandindo rapidamente, fornecendo insights críticos sobre a complexidade biomolecular espacial dinâmica dos organismos vivos. Múltiplas abordagens estão sendo empregadas para estudar biomoléculas distintas em um contexto biológico. Embora algumas sejam técnicas altamente especializadas, a espectrometria de massa (EM) emergiu como uma técnica geral importante para quantificar uma ampla gama de biomoléculas no contexto de células, tecidos ou organismos.

A Imagem por Dessorção a Laser Assistida por Matriz/Espectrometria de Massas por Ionização (MALDI-MSI) é uma das técnicas gerais emergentes para a imagem multiômica espacial de biomoléculas. Foi inicialmente criado para a visualização de proteínas e peptídeos em fatias de tecido1. Desde então, ela foi estendida a muitas amostras e moléculas biológicasdiversas 2. A técnica pode ser aplicada a amostrascelulares 3,organoides 4, animaismodelo 5 e amostrasde pacientes 6,7. Algumas classes moleculares podem ser medidas diretamente usando abordagens baseadas em MSI, incluindo muitos metabólitos e lipídios, enquanto outros tipos de biomoléculas mais complexas, como proteínas e glicanos, requerem tratamento enzimático ou químico para serem adequadas à detecção baseada emMSI 2,8.

O MALDI-MSI também foi aplicado à análise espacial de glicanos N-ligados e glicogênio, utilizando fluxos de trabalho que requerem processamento enzimático para produzir fragmentos de glicanos adequados para a detecção deMSI 9,10,11,12,13,14,15. N-glicanos são separados do resíduo de asparagina das proteínas com PNGase F, e cadeias de glicose de glicogênio são clivadas com isoamilase. As principais vantagens da análise de glicogênio MALDI são que ela fornece definição espacial da distribuição de glicogênio na amostra biológica, quantificação relativa e informações sobre o ramificamento das cadeias de glicose. Como tanto os fluxos de trabalho de N-glicano quanto de glicogênio exigem processamento enzimático da amostra para análise MSI, eles foram combinados em um fluxo de trabalho integrado para análise de glycome (Figura 1A). Esse fluxo de trabalho exige preparação cuidadosa de amostras biológicas e processamento específico para permitir a análise do glicoma por EM, seguida pela aquisição e processamento de dados. Embora o fluxo de trabalho exija uma série de etapas especializadas, ele produz dados espaciais glycome ricos e de alta qualidade, altamente reproduzíveis e que podem ser adaptados a muitos tipos diferentes deamostras 16. Além disso, o fluxo de trabalho é modular, de modo que as etapas de processamento da amostra podem ser realizadas por laboratórios de pesquisa independentes antes do envio das amostras para instalações especializadas que realizam as etapas finais da aquisição e análise de dados do MALDI-MSI.

Protocolo

Essa pesquisa foi realizada em conformidade com as diretrizes do comitê institucional de cuidado e uso animal (IACUC) da Universidade da Flórida. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Colheita do fígado

  1. Eutanásia e dissecação animal
    1. Realize luxação cervical e decapitação para eutanasiar o camundongo (seguindo protocolos institucionalmente aprovados).
      NOTA: Para este exemplo, foi utilizado um mouse selvagem C57BL/6J de 6 meses. Nessa idade, os camundongos pesam entre ~25 e 33 g. Uma ampla variedade de idades, tamanhos e cepas é bem adequada para essa análise.
    2. Imediatamente coloque o animal sobre uma almofada absorvente e exponha a cavidade abdominal usando um bisturi estéril.
    3. Usando pinças e tesouras estéreis, isole o fígado com manipulação mínima e danos tecitários.
      NOTA: Mudanças metabólicas ocorrem rapidamente. Evite perfusão ou sedação, se possível, e garanta que as etapas de dissecação sejam realizadas o mais rapidamentepossível 17.
  2. Lave e limpe rapidamente o papel.
    1. Mergulhe suavemente o fígado em soro (PBS) tamponado com fosfato (PBS) para remover qualquer sangue.
    2. Mergulhe o tecido em água desionizada (DI) duas vezes.
    3. Enxugue o excesso de água tocando suavemente o lenço em um limpador limpo.
      NOTA: Amostras maiores do que o que cabem em uma lâmina padrão de microscópio devem ser cortadas em pedaços antes do congelamento.
  3. Congelamento de amostras
    1. Coloque o fígado limpo diretamente em um barco de pesagem descartável de poliestireno pré-refrigerado, flutuando sobre nitrogênio líquido.
    2. Quando o papel mudar de cor para um opaco brilhante, aproximadamente 3 minutos, coloque o papel em pacotes de papel alumínio pré-preparados e rotulados sobre gelo seco.
    3. Coloque os pacotes de papel alumínio junto com as amostras em um freezer a -80 °C para armazenamento. As amostras podem ser armazenadas a longo prazo a -80 °C.

2: Preparação de uma amostra biológica

  1. Preparação para criossecção
    1. Certifique-se de que o crióstato esteja ligado e equilibrado a uma temperatura adequada para o tecido, entre -16 °C e -20 °C. A temperatura exata vai depender do tipo de tecido. O fígado deve ser seccionado a uma temperatura um pouco mais quente, aproximadamente de -16 °C a -17 °C, para evitar rupturas no tecido, enquanto os demais tecidos devem ser seccionados a -20 °C.
    2. Certifique-se de que haja pelo menos dois mandris, dois pincéis finos, uma pinça fina e um inserto de vidro de 70 mm na temperatura do criostato. Além disso, etiquete as lâminas a lápis antes de colocá-las no crióstato para se aclimatar.
    3. Transfira o tecido do freezer a -80 °C para o crióstato sobre gelo seco.
    4. Deixe os tecidos se aclimatarem à temperatura do crióstato por pelo menos 30 minutos.
    5. Certifique-se de que não haja danos na borda do inserto de vidro e que ele fique liso onde o tecido encontrará o guia anti-rolamento, passando um dedo enluvado ao longo da borda.
    6. Coloque o inserto de vidro no guia anti-rolamento.
    7. Pegue uma lâmina de perfil baixo e deslize-a cuidadosamente no suporte aberto, e feche o suporte. Coloque a proteção vermelha da lâmina sobre a lâmina até a secção.
    8. Monte o papel de papel no mandril usando um meio de montagem M1, que é compatível com MS. Coloque o meio de montagem M1 em temperatura ambiente sobre o mandril dentro do criostato, cobrindo pelo menos dois anéis no mandril para que o tecido fique fixo no lugar.
      NOTA: O composto de temperatura de corte ótimo (OCT) é frequentemente utilizado na criosseção; no entanto, causa supressão de íons em aplicações de MS e deve ser evitada. Se o OCT for necessário, então um protocolo adicional de múltiplas etapas deve ser utilizado para minimizar ou remover o OCT. Além disso, alguns centros de recursos do MS não analisam amostras que foram incorporadas ao OCT.
    9. Pegue uma pinça fria e remova o papel do papel alumínio. Use a pinça para posicionar o papel sobre o mandril na orientação desejada.
    10. Coloque o mandril no criostato para permitir que o suporte congele, aproximadamente 2 minutos. Depois de congelado, ele ficará endurecido e parecerá opaco.
  2. Criosseção do tecido hepático
    1. Coloque o mandril com o papel de papel montado no suporte do mandrin. Posicione o mandril de modo que o tecido corte em um ângulo de 90° em relação à lâmina.
    2. Retraa o suporte do mandril até que o tecido não tenha contato com a lâmina. Leve lentamente o mandril até que o tecido fique imediatamente adjacente à lâmina para começar a seccionar.
    3. Comece a seccionar com uma fatia de espessura de 30 μm para remover tecido indesejado.
    4. Certifique-se de que a profundidade da placa de rolo crie uma seção lisa e que o papel não role sobre a placa de rolo. Se for esse o caso, então afrouxe um pouco a placa do rolo. Se o tecido mover a placa do rolo e bater nela uma segunda vez ao reiniciar a rotação, então aperte levemente a placa do rolo.
    5. À medida que a seção desejada se aproxima, diminua a espessura pretendida da fatia para 10 μm, ou outra espessura desejada adequada para a aplicação específica.
    6. Complete 10 rotações para que o mandril fique na espessura correta para evitar retalhos e seções irregulares.
    7. Use um pincel frio para limpar o palco em preparação para a secção. Feche a placa de rolo sobre a lâmina e pegue lentamente uma seção do papel.
    8. Levante a placa de rolo e use os dois pincéis finos e frios para afastar suavemente a seção da lâmina. Puxe a seção para o lado do palco para facilitar a montagem no ferrolho.
    9. Pegue uma lâmina gelada de um suporte de lâmina no crióstato e coloque um dedo indicador no lado oposto da lâmina em relação ao local onde o tecido ficará por 10 segundos.
    10. Coloque o ferrolho suavemente sobre o papel e levante-o novamente. Não pressione forte, pois isso pode rasgar o tecido. O tecido deve derreter sobre a lâmina e ficar translúcido.
    11. Transfira rapidamente as lâminas para um dessecador para secar. Seque o ferrolho no dessecador por 1 hora.
    12. Após a secagem, as lâminas podem ser processadas diretamente para MS ou seladas a vácuo e armazenadas a -80 °C.

3. Preparação de lâminas para MSI de glicômicos

  1. Preparação de enzimas
    NOTA: A PNGase Liofilizada F com baixo teor de sal pronta para MS pode ser adquirida e utilizada diretamente.
    1. A isoamilase requer diálise para remover o excesso de sal para aplicações em EM. Prepare um ou mais copos de diálise colocando-os em água HPLC por 15 minutos.
    2. Dialise 200 μL de isoamilase de estoque usando um copo de diálise de 500 μL em 14,3 mL de água HPLC por 2 horas a 4 °C, sem mexer. Substitua os 14,3 mL de água HPLC por água HPLC fresca e faça diálisa por mais 16 horas (durante a noite) a 4 °C. Substitua os 14,3 mL de água HPLC por água HPLC fresca e faça diálisa por mais 8 horas a 4 °C.
    3. Remova delicadamente a isoamilase do copo com uma pipeta e coloque-a em um tubo de microcentrífuga 1,5. Meça o volume total da solução de isoamilase após a diálise (em μL). A partir da atividade inicial do estoque, tipicamente 200 unidades/mL, e o volume final, calcula-se o volume total necessário para 3 unidades de isoamilase.
    4. Pipete aliquotas de 3 unidades de isoamilase em tubos de PCR de parede fina. Estali tubos de congelamento em nitrogênio líquido. Armazene a -80 °C. Um tubo de solução de isoamilase dialisada pode ser usado para cada protocolo de pulverização, o que é suficiente para quatro lâminas. Evite ciclos de congelamento/descongelamento para manter a atividade enzimática.
  2. Fixação e lavagem de tecido
    1. Coloque os lâminas em um suporte de lâminas e submerga em um recipiente de vidro cheio com formalina tamponada neutra (NBF) por 1 hora.
    2. Remova os slides do NBF. Submerga as lâminas em etanol 70% por 2 horas.
    3. Prepare quatro potes de Coplin contendo 70%, 80%, 90% e 100% etanol. Rotule cada pote claramente para evitar confusão durante a lavagem sequencial.
    4. Transfere sucessivamente slides da seguinte forma: 70% etanol por 5 minutos, 80% etanol por 5 minutos, 90% etanol por 5 minutos, 100% etanol por 5 minutos.
    5. Transfira as lâminas para uma placa de Petri de vidro cheia de xileno fresco 100%. Certifique-se de que os slides estejam totalmente submersos. Incube as lâminas em um shaker a 70 rpm por 1 hora, dependendo do teor lipídico do tecido. Repita essa etapa mais duas vezes usando xileno fresco para cada lavagem.
      NOTA: Este protocolo foi projetado para permitir a máxima delipidação, já que se sabe que lipídios resultam em supressão de íons e, portanto, máxima reprodutibilidade. No entanto, isso resulta na deslocalização dos sinais, diminuindo assim a resolução que pode ser obtida. A diminuição das etapas de lavagem, a limitação do tempo de processamento e o controle cuidadoso da umidade podem diminuir a deslocalização e, assim, resultar em melhor resolução dos dados.
    6. Coloque os lâminas em um dessecador durante a noite para secar.
    7. Coloque lâminas em etanol 70% por 1 minuto para reidratar. Coloque os escorregadores na água DI por 3 minutos. Repita a lavagem com água DI com água DI fresca.
    8. Seque os slides em um dessecador por 10 minutos, ou até ficarem completamente secos.
  3. Preparação de lâminas para aplicação enzimática
    1. Prepare uma câmara de umidade HTX para incubação colocando uma toalha de papel embebida em água DI abaixo do suporte metálico. Coloque a câmara em uma incubadora a 37 °C.
    2. Prepare um vaporizador de alimentos enchendo o reservatório de água até o topo com água da torneira. Configure o temporizador para 60 minutos para ligar a unidade.
    3. Prepare o tampão citracônico adicionando 50 mL de água de grau HPLC, 25 μL de anidrido citracônico e 2 μL de 12 M HCl a um tubo Falcon de 50 mL. Faça vórtice na solução por 10 segundos para misturar bem. Cada tubo centrífugo de 50 mL de buffer citracônico é suficiente para quatro lâminas. Verifique se o pH da solução é 3,0 (faixa aceitável: 2,5-3,5).
    4. Preencha cada envelope com o buffer citracônico preparado. Coloque a lâmina com o tecido voltado para dentro para evitar que ele toque as laterais e permitir a coleta eficaz de antígenos. Dois slides podem ser usados por correspondência, usando as duas posições das bordas, com ambos os slides com tecidos voltados para dentro.
    5. Verifique se o vapor está sendo emitido pelo vaporizador de alimentos. Coloque os envelopes no vaporizador e incube por 30 minutos.
    6. Transfira os envelopes para um banho-maria DI por 5 minutos. Troque metade do buffer citracônico do envelope por água DI e deixe descansar por mais 5 minutos. Repita essa diluição mais duas vezes.
    7. Remova todo o solvente e lave os slides adicionando 100% de água DI ao envelope de slides e depois remova a água DI. Usando um lenço de laboratório, seque em áreas onde não haja tecido.
    8. Desenhe um círculo e um triângulo no verso de cada slide para marcar os locais padrão internos. Aplique 1 μL de 1 mg/mL de Peroxidase de Raiz-forte (HRP; círculo) e 1 μL de 10 mg/mL de glicogênio hepático de coelho (triângulo) na frente da lâmina.
    9. Coloque as lâminas no dessecador por 15 minutos para secar completamente.
  4. Pulverização enzimática e digestão
    1. Remova um tubo de 100 μg de PNGase liofilizada F (500 unidades/μg) e um tubo de 3 unidades de isoamilase e deixe descongelar por 10 minutos. Tubos de centrifugação a ~2000 x g por 5 s em um tubo de microcentrífuga. Isso é enzima suficiente para pulverizar 4 lâminas.
    2. Pipete 50 μL de água DI em cada tubo F da PNGase liofilizada, faça um vórtice suave por 10 s e gire em um microfuge a ~2000 x g por 5 s. Pipete a solução de 50 μL de PNGase F diretamente no tubo de isoamilase. Adicione água HPLC a um volume final de 1 mL.
    3. Faça vórtice no tubo microcentrífuga de enzima dupla por 10 s e desfaça a ~2000 x g por 5 s.
    4. Ligue o pulverizador HTX M5 e abra o software HTX M5. Certifique-se de que o tipo de bandeja esteja definido como Ambiente na aba Sistema .
    5. Desligue a bomba Knauer pressionando o botão de parada na frente direita. Ligue a bomba externa de seringa usando o interruptor no painel traseiro.
    6. No software HTX, na aba Métodos , selecione o método apropriado para pulverização com enzimas duplas. Os parâmetros devem ser ajustados para temperatura do bico de 45 °C, 15 passagens, vazão de 0,025 mL/min, velocidade de 1200 mm/min, espaçamento de trilho de 3 mm, padrão CC, pressão ajustada para 10 psi, vazão de gás de 3 L/min e altura do bico de 40 mm.
    7. Navegue até a aba Temperatura e ajuste a temperatura do bico do spray para 45 °C. Use uma chave inglesa para mover a linha do pulverizador até o conector superior.
    8. Abra a válvula de gás nitrogênio de pureza ultra-alta e certifique-se de que a pressão do pulverizador seja de 10 psi. Na bomba de seringa, ajuste a vazão para 95 μL/min.
    9. Usando uma seringa e agulha novas, encha com 4 mL de água HPLC. Remova todas as bolhas. Passe 2 mL de água por uma seção de ~6 polegadas da linha do pulverizador até um béquer de resíduos.
    10. Conecte a seringa à linha do pulverizador e faça passar água pela bomba da seringa iniciando e funcionando a 95 μL/min por 5 minutos.
    11. Ao lavar a bomba da seringa, colhe os ferrolhos no canto inferior esquerdo da bandeja aquecida usando um guia de alinhamento metálico para garantir que o tecido fique dentro da área do spray. Na aba Amostra , defina os parâmetros X e Y para a região de pulverização, permitindo um leve excesso para garantir cobertura total do lâmina.
    12. Após 5 minutos, pause a bomba, desconecte a seringa, puxe ar para dentro e então empurre o ar pela linha do pulverizador para purgar qualquer água residual. Repita conforme necessário.
    13. Coloque a solução de enzimas duplas em uma nova seringa e conecte-a à bomba, garantindo que não restem bolhas.
    14. Prenda a seringa na linha do pulverizador. Na bomba de seringa, ajuste a vazão para 25 μL/min.
    15. Quando o bico do spray atingir 45 °C, pressione Start na aba Ciclo . Clique em Não quando for solicitado para ligar a bomba Knauer. Pressione Start na bomba da seringa para iniciar o spray.
    16. Coloque uma lâmina em branco sob o bico do spray para confirmar a deposição visível do spray enzimático. Após observar, clique em Continuar no software, coloque a tampa de vidro no pulverizador e monitore o spray para uma aplicação uniforme, conforme indicado pela molhação uniforme.
    17. Quando o ciclo de pulverização estiver concluído, pressione para parar na bomba, desligue o gás nitrogênio e clique em Confirmar carga de válvula. Limpe a linha e o estágio do pulverizador e desligue o pulverizador, garantindo que a bomba Knauer esteja de volta ligada.
    18. Incube as lâminas na câmara de umidade HTX a 37 °C por 2 horas, posicionando as lâminas voltadas para cima. Quando terminar, coloque os slides no dessecador por 15 minutos. Os slides podem permanecer no dessecador durante a noite, ou o protocolo pode ser continuado.
  5. Preparação e aplicação da matriz MALDI
    1. Antes da aplicação da matriz, capture uma imagem óptica do slide usando um scanner.
    2. Pese 40 mg de CHCA sólido em um tubo cônico de 15 mL. Dissolva o pó de CHCA em uma solução de 0,1% de ácido trifluoroacético e 50% acetonitrila (ACN) a uma concentração de 7mg/mL.
    3. Sonice a solução matricial por 10 minutos usando ciclos de 90 s ligado e 30 segundos desligado. Repita esses passos 5 vezes para garantir a dissolução completa e homogeneidade.
    4. Ligue o pulverizador HTX M5 e abra o software HTX M5. Abra a válvula de gás nitrogênio e ajuste a pressão do sistema para 10 psi.
    5. No software HTX, na aba Métodos , selecione o método apropriado para a pulverização da matriz CHCA. Parâmetros ajustados para temperatura do bico de 79 °C, 10 passagens, vazão de 0,1 mL/min, velocidade de 1300 mm/min, espaçamento da pista de 3 mm, padrão CC, pressão ajustada para 10 psi, vazão de gás de 3 L/min e altura do bico de 40 mm.
    6. Navegue até a aba Temperatura , ajuste a temperatura do bico do spray para 79 °C. Na aba Bomba , defina a vazão para 100 μL/min.
    7. Prenda os ferrolhos no canto inferior esquerdo da bandeja aquecida usando um guia metálico para garantir o alinhamento correto na área de pulverização. Na aba Amostra , defina os parâmetros X e Y para a região de pulverização, permitindo um leve excesso para garantir cobertura total do lâmina.
    8. Use uma seringa e agulha descartáveis para extrair 5,5 mL de 50% de ACN (remover bolhas).
    9. Configure o pulverizador no modo CARREGAR . Insira a seringa de ACN e injete a ACN. Remova a seringa de ACN e substitua imediatamente por uma nova contendo 5,5 mL de solução filtrada de CHCA, injetando para evitar bolhas. Coloque o pulverizador no modo SPRAY .
    10. Quando o bico do pulverizador atingir 79 °C, pressione Start na aba Ciclo . Clique em Sim quando solicitado.
    11. Use um ferrolho de teste em branco e coloque sob o bico do pulverizador. Para confirmar a deposição visível por matriz de pulverização, uma deposição em matriz amarela será encontrada na lâmina. Depois de observar, clique em Continuar, coloque a tampa de vidro sobre o instrumento e monitore a consistência do spray. Spray consistente produzirá uma lâmina com opacidade uniforme.
    12. Quando o ciclo de pulverização terminar, configure o pulverizador no modo LOAD e clique em Confirmar carga da válvula.
    13. Limpe o pulverizador ajustando a bomba para 300 psi e reduzindo a temperatura para 30 °C. Absorva e empurra pela linha 5 mL de acetonitrila a 50% duas vezes e 5 mL de metanol a 50% duas vezes. Limpe o palco com metanol 100%. Quando a temperatura atingir 30 °C, alterne para LOAD, desligue o gás, desligue o pulverizador e certifique-se de que a bomba Knauer esteja ligada novamente.
    14. Coloque as lâminas no dessecador por 15 minutos até que a matriz esteja completamente seca. Os slides devem ser executados o mais rápido possível após a pulverização, no máximo 14 dias, para garantir coleta confiável de dados com sinal-ruído adequado.

4. Coleta de dados de glicômicos MALDI-MSI

  1. Preparação para a coleta de dados
    1. Fixe o slide no suporte de amostra do instrumento MALDI com o adaptador do slide. Insira o suporte da amostra no MS e certifique-se de que ele esteja devidamente encaixado para a imagem.
    2. Abra o software flexImaging e importe a imagem óptica do slide previamente registrada, veja o passo 3.4.1. Se necessário, calibre o alinhamento da imagem com o estágio do instrumento para que as seções de tecido e os pontos padrão estejam corretamente posicionados para a seleção da região.
    3. Defina as regiões de imagem para as seções do tecido, o padrão HRP, o padrão de glicogênio e o quadrado da matriz de controle no software. Descreva cada uma como uma região separada.
    4. Defina o tamanho do passo raster para 50 μm, obtendo uma resolução em pixels de 50 × 50 μm.
    5. No software de controle de instrumentos, selecione o modo MS de íons positivos e defina o alcance de varredura para m/z 500 - 4000 com um corte de baixa massa de 700,00 m/z.
    6. Carregue o conjunto pré-otimizado de parâmetros de afinação de imagem MALDI no software de controle do instrumento (ou insira os valores manualmente, se necessário). Verifique se as tensões da fonte e da óptica iônica estão ajustadas aos valores especificados: MALDI Plate Offset 50,0 V; Deflexão 1 Delta 70.0 V; Funil 1 RF 500.0 Vpp; Funil 2 RF 500.0 Vpp; Multipolo RF 500.0 Vpp; Energia Iônica 5.0 eV. Confirme as configurações de célula de colisão e temporização do TOF: Energia de Colisão 10.0 eV; Collision RF 4000.0 Vpp; Tempo de transferência 180,0 μs; Armazenamento pré-pulso 25,0 μs.
    7. Confirme as configurações do laser na aba Laser. Selecione Imaging 50 μm como padrão da aplicação.
    8. Calibre o espectrômetro de massa usando uma mistura de calibrantes externa, como a mistura de afinação. Introduza o calibrante e execute a rotina de calibração do instrumento. Ajuste a calibração para que o erro de precisão de massa fique dentro de 0,001% e a pontuação de precisão da calibração seja 100%.
    9. Configure a aquisição para realizar uma rajada de 320 disparos de laser na frequência de 10.000 Hz. A atenuação do laser deve ser ajustada para 37% para manter a intensidade do sinal dentro da faixa dinâmica ideal. Ajuste os disparos de laser e a atenuação conforme necessário.
    10. Use a função automatizada de alinhamento do feixe do instrumento, ajuste do perfil do alvo e ajuste de foco para garantir que o laser esteja corretamente focado na amostra. Em uma região fora do tecido, execute o Ajuste Automático de Feixe sob a aba Laser no software de controle para alinhar o laser com a óptica iônica. Isso garantirá que o laser e o estágio sejam ajustados para a coleta ideal de dados. Por fim, execute a geração de perfil de alvo e ajustes de ajuste de foco na aba de portador de amostra.
    11. Confirme que os pontos padrão internos produzem os picos iônicos esperados, indicando prontidão para coleta de dados. A HRP deve apresentar um pico proeminente de glicanos em 1211,42. O glicogênio deve ter picos proeminentes espaçados regularmente, com os picos de maior intensidade em 1013,32, 1175,37 e 1337,43.
      NOTA: Se houver problemas identificados com a intensidade, revise a configuração do laser. Se houver problemas identificados com precisão massiva, revise a calibração.
  2. Coleta de dados MALDI-MSI
    1. Inicie a aquisição de imagem MALDI-MS para as regiões definidas clicando no botão Start no software de imagem. O instrumento irá automaticamente raster o laser em cada região definida em intervalos de 50 μm, adquirindo um espectro MS1 de íons positivos (m/z 500-4000) a cada pixel. O tempo típico de coleta de dados para uma seção hepática nessa resolução é de 135 min.
      NOTA: Após a execução, o instrumento salvará automaticamente os espectros para cada pixel adquirido, criando uma pasta .d com os dados brutos.

5. Análise de dados MALDI-MSI

  1. Importação e exportação de dados
    1. Importe o conjunto de dados para o SCiLS Lab, ou software equivalente de análise MSI, para visualizar mapas de intensidade iônica do glycome nas seções do tecido.
    2. Abra o SCiLS Lab. Selecione Novo. Selecione o arquivo .mis da execução MALDI.
    3. Quando o arquivo .mis for aberto no SCiLS, clique em Próximo. Selecione a faixa automática para a faixa m/z. Selecione o eixo automático para os Parâmetros do Eixo. Selecione o tamanho absoluto da caixa. Clique em Próximo e depois em Importar. Selecione a pasta onde o arquivo será salvo.
    4. Após a importação terminar, abra o novo arquivo .slx.
    5. Clique em arquivo, Importar e selecione a lista de recursos na opção de arquivo. Importe anotações do glycome e crie imagens de íons indo ao painel da lista de recursos, selecionando a lista correta e clicando no botão criar imagens de íons.
      NOTA: Listas robustas de recursos estão disponíveis para N-glicanos16, 18, 19 e glicogênio13.
    6. Normalize os dados, conforme apropriado. A Contagem Total de Íons (TIC) é a normalização mais comumente utilizada.
    7. Depois que as imagens de íons forem carregadas, revise a lista de recursos e garanta a integração correta dos picos, ajustando manualmente para aqueles recursos em que o pico não está totalmente integrado. Para ajustar, clique com o botão esquerdo no pico enquanto mantém shift. Depois que o pico estiver integrado, pressione controle e barra de espaço no teclado. Isso gerará uma nova imagem iônica para o pico ajustado.
    8. Após repetir o restante da lista de recursos, dentro do painel de imagem de íons, selecione a lista Salvar de recursos, nomeie a lista e clique em Salvar.
    9. Vá para arquivo, tabela de recursos e abra a tabela de listas de recursos que acabou de ser salva. Ordene por m/z. As características ajustadas aparecerão com uma célula vazia na coluna do nome. Renomeie os picos ajustados copiando e colando o nome e removendo o pico original selecionando o botão remover linha selecionada da lista de recursos, localizado no topo central da tabela de características.
    10. Após ajustar todos os nomes, é obtida uma lista final anotada de picos. Clique no botão de adicionar intensidade localizado perto do botão de deletar. A partir daqui, selecione as amostras de interesse para exportar a intensidade média das características anotadas de cada região imageada.
    11. Certifique-se de selecionar o modo de processamento do intervalo de Área de Pico e a Contagem Total de Íons para a normalização. Clique em OK. Novas colunas aparecerão com os dados correspondentes. Para exportar os dados, selecione a seta que aponta para fora e salve como .csv.

Resultados

O processamento cuidadoso de um fígado de um camundongo selvagem, incluindo o corte de uma seção transversal completa (Figura 1A), permitiu a definição do glycome pelo MALDI-MSI, com diversos oligossacarídeos derivados de glicossacarídeos e glicanos N-ligados em uma faixa de m/z (Figura 1B). O glicogênio estava amplamente localizado em todo o hepatócito hepático e ausente nos vasos e tecido conjuntivo nos tratos porta, como esperado (Figura 1C,D). Importante destacar que os dados MALDI-MSI permitiram medir tanto a distribuição espacial do glicogênio quanto a distribuição do comprimento da cadeia, uma característica fundamental do glicogênio no metabolismo normal e nos estados de doença (Figura 1D). Além disso, diversos glicanos ligados ao nitrogênio apresentam diferentes organizações. A distribuição espacial observada varia desde amplamente distribuídos em hepatócitos (Figura 1E) até focos regionais, consistente com a organização senoidal do fígado (Figura 1F), até a rotulagem específica dos elementos do trato porta (Figura 1G-I).

figure-results-1
Figura 1: Análise MALDI-MSI do glycome do fígado de camundongo. (A) Esquema para métodos críticos na preparação de amostras, aquisição de dados e análise. (B) Amostrar espectros de massa derivados da abordagem. Setas em vermelho demonstram os oligossacarídeos regularmente espaçados derivados do glicogênio, que diferem por um monossacarídeo de glicose. Setas em azul indicam N-glicanos, que são encontrados distribuídos por todo o espectro. No fígado, os picos de glicogênio geralmente são mais proeminentes, especialmente em valores m/z mais altos. (C) Distribuição espacial da maltohexaose (DP6) derivada do glicogênio no fígado. (D) Distribuição dos comprimentos das cadeias de glicogênio no fígado. (E-G) Distribuição espacial de diferentes espécies de glicanos ligados ao N no fígado. (H) Coloração de Hematoxilina e Eosina (H&E) para uma região central focada, juntamente com anotações anatômicas. (I) Correspondente inserto focado mostrando a localização espacial de glicanos N-ligados adicionais (Hex5dHex1HexNAc5) em elementos do trato porta. Barras de escala: 500 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O MALDI-MSI é uma ferramenta emergente para a biologia espacial dos glycomes. Importante destacar que, embora esse protocolo foque na coleta de dados usando hardware específico, ele pode ser facilmente adaptado às plataformas MALDI-MSI de múltiplosfornecedores 13. O processamento de amostras é idêntico até o método 4, embora alguns fornecedores possam exigir o uso de slides especializados. Modificações na coleta de dados, usando parâmetros específicos para a plataforma MALDI-MSI, permitem a rápida adaptação desse protocolo. Software específico para processamento de dados pode ser utilizado, conforme detalhado na etapa 5, ou, alternativamente, plataformas para processamento rigoroso e reproduzível de dados MALDI-MSI podem serempregadas 19.

O MALDI-MSI é uma ferramenta particularmente útil para entender a biologia, já que diferentes órgãos, tecidos e células têm padrões distintos para seu glicoma. O fígado é bem adequado para análise de glicógeno, pois possui altos níveis de glicogênio e diversos glicanosN-ligados 13. Outros órgãos apresentam níveis e diversidade mais altos de glicanos ligados à N, e níveis mais baixos deglicogênio 13. Importante, o glycome varia em diferentes órgãos dependendo do estado metabólico e da doença do organismo, e assim o glycome fornece uma rica fonte de informaçõesbiológicas 5,14,15,20. O desenvolvimento contínuo de enzimas únicas ativas em carboidratos para a análise MALDI-MSI promete estender a análise de glicome para biomoléculas ortogonais adicionais no glicoma.

Embora tenha muitas vantagens, o MALDI-MSI atualmente é limitado em resolução em comparação com outras ferramentas utilizadas em biologia espacial. Esse protocolo utilizava coleta de dados com resolução de 50 μm. Embora excelente para análise fisiológica, dados em resolução de célula única avançariam significativamente o campo21. Em particular, a deslocalização pode ser uma barreira significativa para o aumento da resolução em metodologias que utilizam pulverização enzimática e subsequente incubação em condições úmidas. Avanços recentes em hardware de processamento de amostras, metodologias de manuseamento de amostras, hardware de aquisição de dados, uso de rotulagem seletiva e processamento de dados estão permitindo que a coleta de dados MALDI-MSI se aproxime da resoluçãocelular 22,23. No entanto, existem compromissos entre resolução e sinal-ruído, além de limitações inerentes baseadas nos métodos atuais de preparação de amostras para MALDI que precisam ser consideradas. Aplicações muito específicas já estão alcançando o objetivo do MALDI-MSI resolvido por célula única usando inovações tanto no processamento deamostras 24 quanto em algoritmos inovadores, sugerindo que soluções gerais para esses problemas estão ao alcance 25,26,27.

Após a coleta de dados, a lâmina pode ser corada via H&E para fins de anotação histológica. No entanto, danos celulares e teciduais estão associados à coleta de dados MALDI-MSI, de modo que essa estratégia limita a extensão da anotação celular. Alternativamente, fatias de tecido sequenciais podem ser utilizadas para H&E. Essa estratégia fornece dados de alta qualidade, mas requer alinhamento e integração de cortes discretos de amostra.

Vale ressaltar que tecidos fixos em formalina e parafina embutida (FFPE) são muito adequados para análise de glivem pelo MALDI-MSI, com pequenas alterações no protocolo para preparação daamostra 13. No entanto, o tecido FFPE não pode ser utilizado de forma eficaz para metabolômica e outras análises similares, portanto amostras frescas congeladas, conforme detalhado aqui, são preferidas para abordagensmultiômicas 28. A preparação de amostras é um componente crítico de qualquer pipeline MSI para biomoléculas lábeis, o que requer abordagens especiais para a colheita e manuseio dasamostras 17, 29, 30.

Metodologias para expandir a generalidade e a utilização generalizada das abordagens baseadas em MALDI-MSI estão avançando rapidamente, com melhorias dramáticas em hardware esoftware 19. Além disso, abordagens recentes de ponta multiômica28 e multimodal21 , combinadas com aprendizado de máquina e inteligência artificial, são particularmente promissoras para lidar com esses conjuntos de dados altamentecomplexos 31.

Divulgações

R.C.S., M.S.G. e C.W.V.K. são co-diretores do Centro de Pesquisa Avançada em Biomoléculas Espaciais (CASBR) da Universidade da Flórida e cofundadores da Sugar3 LLC. A R.C.S. recebeu apoio à pesquisa e/ou honorários de consultoria da Maze Therapeutics. O M.S.G. recebeu apoio em pesquisa, compostos para pesquisa ou honorários de consultoria da Maze Therapeutics, Valerion Therapeutics, Ionis Pharmaceuticals, PTC Therapeutics e Aro Biotherapeutics. M.S.G. é membro do conselho consultivo científico da Chelsea's Hope, da Fundação Síndrome de Deficiência Glut1 e da Fundação para Doenças Corporais de Poliglicosano em Adultos.

Agradecimentos

Agradecemos aos membros dos laboratórios Vander Kooi, Sun e Gentry por discussões frutíferas. Este estudo foi apoiado por bolsas do National Institutes of Health (NIH) para a Biospecimen Procurement & Translational Pathology Shared Resource Facility do University of Kentucky Markey Cancer Center, P30CA177558 a D.B.A., R01AG066653, R01CA266004, R01AG078702, R01CA288696, RM1NS133593 a R.C.S., R35NS116824 a M.S.G., R01DC019054 a C.W.V.K. e à Faculdade de Medicina da Universidade da Flórida.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Base absorventeDenville ScientificB1623
Acetonitrila (ACN)Sigma-Aldrich34851-4X4L
Papel alumínioFisher Scientific & nbsp;15078292
Anidrido citracônicoSigma-Aldrich125318
Tubo cônico (15mL)Alkali ScientificCW5600
Potes CoplinDWK Ciências da Vida900570
Criostato LeicaCM1860
Mandril criostatoLeica14041926491
DessecadorBel ArtF424004131
Copo de diáliseThermo Fisher88400
EtanolFisher Scientific & nbsp;22032601
Cozinheiro a vaporRival CKRVSTLM21   
Inserto de vidro (70 mm)Companhia de GelLGI50
GlicogênioSigma-AldrichG8876Padrão
Peroxidase de raiz-forte (HRP)Sigma-AldrichP8125Padrão
Água HPLCSigma-Aldrich270733-4X4L
Pulverizador HTXTecnologias HTXM5
Ácido clorídricoFisher Scientific & nbsp;A144-500
IsoamilaseMegazimaE-ISAMY
Bomba KnauerKnauerP 4.1 S
Lâmina de perfil baixoCiências da Microscopia Eletrônica63059-01
Mídia de montagem M1Epredia1310
Espectrômetro de MassaBruker DaltonicstimsTOF fleX
Tubo Microfuge (1,5mL)Alkali ScientificCN3016
AgulhaBD305109
NBF de formol bufferizado neutroMillipore sigmaHT501128-4L
Gás NitrogênioAirgasNIUHP300
PBSFisher Scientific & nbsp;SH30256. FS
Tubos de PCRParceiros MedSupply62-1091-1
PNGase F PRIME-LY ULTRA & nbsp;Biografia do BulldogNZPULT10LY
Laboratório SCiLSBruker Daltonics1889000
ShakerTermo Científica88882007
Slide   Ciências do Microscópio Eletrônico71873-02
Corredor de slideProdutos RPI212620A
Sonicater (Bioruptor Pico)DiagenodoB01080010
Pinças EstérilesDR InstrumentsS08098
Bisturi EstérilWPIWPI-500240
Tesoura SterilesFerramentas Científicas Finas14084-08
Seringa   Grainger19G342
Bomba de seringaNova EraNE-300
FitaFisher Scientific & nbsp;15-901-R
Pincel finoAnezus#00
Ácido trifluoroacéticoSigma-AldrichT6508-1L
Tune Mix, ESI de baixa concentraçãoAgilentG1969-85000
Barcos de pesoSigma-AldrichHS120882
XyleneSigma-Aldrich534056
Ácido &alfa;-ciano-4-hidroxicinâmico (CHCA)Companhia Química das Ilhas Cayman15254

Referências

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