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Métodos dinâmicos de grampo para investigar a excitabilidade neuronal prejudicada associada ao autismo

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DOI:

10.3791/69155

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17 de outubro de 2025

 , 
1Department of Biology, Miami University

Neste artigo

Resumo

A eletrofisiologia dinâmica do clamp pode estabelecer ligações causais entre déficits de disparo neuronal e disfunção do canal iônico. Descrevemos métodos e protocolos de grampo dinâmico em neurônios de Purkinje cerebelares de camundongos, observando recursos úteis e considerações técnicas. Em um estudo representativo, adicionamos condutância de sódio modelada aos neurônios Tsc1-/- Purkinje para resgatar disparos repetitivos.

Resumo

O transtorno do espectro do autismo (TEA) surge de uma ampla gama de fatores genéticos e ambientais. Embora numerosas mutações ligadas ao TEA interrompam o desenvolvimento ou a plasticidade das sinapses, um número crescente demonstrou alterar a expressão e o funcionamento dos canais iônicos dependentes de voltagem, resultando em déficits na excitabilidade intrínseca neuronal. Os registros de grampo de voltagem de célula inteira podem ser usados para caracterizar como as mutações relacionadas ao TEA afetam a função do canal iônico. No entanto, esses experimentos não avaliam diretamente como uma condutância iônica alterada afeta o disparo do potencial de ação neuronal. A eletrofisiologia dinâmica preenche essa lacuna, permitindo a injeção em tempo real de condutâncias iônicas definidas pelo usuário em neurônios vivos. Isso permite o teste causal de como as mudanças nas propriedades do canal iônico afetam a atividade elétrica de um determinado tipo de célula. Neste artigo de métodos, descrevemos como implementar a eletrofisiologia dinâmica em neurônios de Purkinje de camundongos adultos registrados em condições fisiológicas em fatias de cérebro cerebelar preparadas agudamente. Os neurônios de Purkinje são um modelo particularmente relevante para este trabalho porque têm uma capacidade intrínseca de disparar potenciais de ação repetitivos de alta frequência (20-100 Hz) e estão consistentemente implicados na disfunção do circuito cerebelar relacionada ao TEA. Nós nos concentramos em Tsc1, um gene cujas mutações de perda de função estão entre as causas monogênicas mais comuns de TEA. Em neurônios de Purkinje de camundongos, a deleção de Tsc1 também foi associada à expressão reduzida do canal de sódio dependente de voltagem (Nav). Utilizamos modelos de estado cinético de Markov para simular e reproduzir as propriedades de condutância Nav do neurônio de Purkinje e passamos a usar o grampo dinâmico para avaliar diretamente como as mudanças na condutância de Nav afetam o disparo intrínseco de neurônios de Purkinje cerebelares intactos. Fornecemos instruções e recursos para modificar e ajustar modelos de condutância iônica. Ao integrar modelagem de condutância iônica, grampo dinâmico e técnicas convencionais de patch-clamp, essa abordagem fornece uma estrutura poderosa e flexível para vincular perturbações genéticas a resultados fisiológicos em neurônios relevantes para TEA.

Introdução

Investigações anteriores sobre os fatores moleculares e celulares do transtorno do espectro do autismo (TEA) frequentemente enfatizavam a disfunção sináptica como central para a fisiopatologia do distúrbio 1,2. Numerosos estudos demonstraram aumento da densidade de sinapses excitatórias 2,3,4, poda sináptica prejudicada5 e alterações nas proteínas de densidade pós-sináptica 6,7 em modelos de TEA. No entanto, trabalhos recentes mostraram que as mudanças na excitabilidade neuronal intrínseca também são impulsionadoras da patologia do TEA. Por exemplo, modelos de camundongos transgênicos com TEA e linhagens celulares derivadas de pacientes revelaram geração de potencial de ação prejudicada em Purkinje cerebelar 8,9,10 e neurônios piramidais corticais 11, bem como excitabilidade dendrítica atenuada e integração sináptica em subclasses de neurônios piramidais corticais12. Canalopatias envolvendo mutações de perda de função em SCN2A, codificando a subunidade de α formadora de poros Nav1.2 do canal de sódio dependente de voltagem (Nav), é agora uma causa monogênica bem conhecida de TEA13 e demonstrou causar déficits na excitabilidade intrínseca de várias classes de neurônios centrais 14,15,16,17. À medida que esses tipos de investigações progridem, é importante estabelecer ligações causais entre as alterações patogênicas nas condutâncias iônicas e os efeitos dessas alterações na função dos neurônios e dos circuitos. A eletrofisiologia dinâmica da pinça fornece uma abordagem eficaz para esta tarefa. Sharp et al. (1992 e 1993)18,19, juntamente com Robinson e Kawai (1993)20 descreveram inicialmente métodos de grampo dinâmico nos quais uma condutância iônica não linear simulada, com ou sem propriedades dependentes de voltagem, é injetada/adicionada em neurônios vivos, permitindo que os investigadores avaliem em tempo real como as propriedades ou supostas mudanças em uma condutância iônica dependente de voltagem afetam o disparo neuronal21, 22.

A implementação de experimentos dinâmicos de grampo foi facilitada por vários sistemas de software disponíveis gratuitamente, como RTXI23, QuB24,25 e StdpC26; No entanto, avanços recentes simplificaram a implementação do grampo dinâmico com sistemas comerciais plug-and-play que permitem que as condutâncias do modelo sejam desenvolvidas, modificadas e aplicadas em um único computador e em um único pacote de software. Aqui, fornecemos protocolos para realizar clamp dinâmico usando um sistema Sutter dPatch27 e fornecemos uma investigação de amostra na qual testamos como a deleção direcionada da esclerose tuberosa 1 (Tsc1) 9, que é um locus prevalente de mutações para ASD28, afeta o disparo intrínseco de neurônios de Purkinje cerebelares como resultado de mudanças na expressão da condutância de sódio dependente de voltagem8.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pelas diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Miami (Protocolo # 1044). Os experimentos utilizaram camundongos C57BL/6J machos e fêmeas selvagens e linhagens transgênicas com fundo de cepa C57BL/6J. Para experimentos eletrofisiológicos, os animais tinham de 6 a 7 semanas. Todas as gravações foram tiradas dos neurônios de Purkinje nos lóbulos 5, 6 ou 7 no vermis cerebelar.

1. Configuração e preparação de tecido para experimentos de patch-clamp de neurônios de Purkinje

  1. Prepare 1 L de líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF) contendo: 125 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM de NaH2PO4, 25 mM de NaHCO3, 2 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2 e 25 mM de dextrose a pH 7,4 (~ 300 mOsM / L). Prepare também 250 mL de 'solução de corte' contendo: 240 mM de sacarose, 2,5 mM de KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 0,5 mM de CaCl2 e 7 mM de MgCl2. Pulverize (bolha) ACSF e soluções de corte com gás carbógeno (95 % O2/ 5% CO2) durante, pelo menos, 20 minutos antes da utilização e continuamente ao longo de todas as experiências.
  2. Prepare uma câmara de retenção de fatias de cérebro cheia de ACSF para uso posterior. Certifique-se de que as fatias cerebelares (uma vez adicionadas à câmara de fatias) estejam submersas com ambos os lados das fatias cerebelares expostos ao ACSF. Faça isso colocando fatias submersas em uma malha de náilon bem esticada que também está submersa.
  3. Prepare a estação de cirurgia. Prepare quatro pedaços de fita adesiva que serão usados para prender o animal anestesiado. Em um balde cheio de gelo ou panela de gelo, coloque a metade inferior de uma placa de Petri no gelo com as paredes voltadas para baixo e o fundo da placa de Petri voltado para cima. Coloque um papel de filtro (≥ 3 cm2) no fundo da placa de Petri e sature com 2-3 mL de solução de corte.
    NOTA: Para os experimentos descritos, um vibratomo compresstome é usado para cortar fatias cerebelares parassagitais de 350 μM. Com o compresstome, o tecido para fatiar é colado a um tubo de amostra de plástico que se encaixa em um tubo de metal fino circundante. Durante o corte, o tubo de amostra é empurrado através do tubo de metal, que permanece fixo. Depois que o tecido é colado ao tubo da amostra, o tecido é embebido em agarose a 2% aquecida. A lâmina do compresstoma é colada em um suporte fixo, que é preso ao braço do vibratome. Outros tipos de vibratomos não requerem a incorporação de tecido em agarose aquecida, mas devem funcionar da mesma forma para os experimentos descritos.
  4. Além disso, no gelo, coloque uma lâmina de barbear de um gume e um copo pequeno (10 mL) cheio de solução de corte. Mantenha um bloco de resfriamento, que é usado para resfriar rapidamente a agarose aquecida depois de adicionada ao tubo de amostra, bem como uma seringa de 30 mL cheia de solução de corte resfriada no gelo. Certifique-se de que a seringa de 30 mL está conectada a uma seção de 30-60 cm de tubo intravenoso (IV) (via cone macho Luer lock) que está conectada (na extremidade de terminação) a uma agulha (≥ 26 G) com uma base fêmea Luer lock.
  5. Coloque a solução de corte restante em um freezer a -80 °C. Assim que esta solução de corte ficar com uma consistência de gelo derretido (20-25 min), retire do freezer a -80 °C e coloque no gelo.
  6. Anestesiar um camundongo adulto de 5 a 8 semanas com uma injeção intraperitoneal de 1 mL / kg de peso animal de cetamina (10 mg / mL) / xilazina (0,25 mg / mL) coquetel.
  7. Faça uma solução de agarose a 2% dissolvendo 0,5 g de agarose em 25 mL de solução de corte. Depois que o animal estiver anestesiado (não responder ao beliscão do dedo do pé), aqueça a solução de agarose a 2% (~ 30 s no micro-ondas) e transfira a solução de agarose aquecida para um banho-maria a 40 ° C.
    NOTA: As etapas numeradas de 1.8 a 1.18 devem ser concluídas com urgência e antes que a agarose aquecida se solidifique.
  8. Prenda os membros do animal na mesa de cirurgia com fita adesiva. Usando uma tesoura, abra a cavidade torácica do animal, garantindo que os pulmões e órgãos abdominais não sejam cortados. Use uma pinça de travamento ou hemostáticos para manter a caixa torácica aberta, expondo o coração. Para conseguir isso, trave a pinça no esterno e coloque-a cuidadosamente em direção à parte anterior do animal (com os orifícios dos dedos da ferramenta ao lado da cabeça do animal).
  9. Insira a agulha conectada à seringa de 30 mL no ventrículo esquerdo e use uma pinça para comprimir o tecido ao redor da agulha, segurando a agulha dentro da câmara intraventricular esquerda. Com uma tesoura cirúrgica, faça um pequeno corte no átrio direito e perfunda rapidamente o animal com os 25 mL de solução cortante gelada.
    NOTA: Certifique-se de que o perfusato entra no ventrículo esquerdo e sai do átrio direito, limpando o sangue do sistema circulatório do animal.
  10. Quando a perfusão estiver completa, decapite rapidamente o animal e corte o couro cabeludo ao longo da linha média da cabeça em direção ao bregma para expor a superfície do crânio.
  11. Usando uma tesoura, remova o tecido conjuntivo da face posterior do crânio e remova o excesso de tecido da medula espinhal, garantindo que a medula espinhal não fique saliente do forame magno.
  12. Coloque uma lâmina de tesoura no forame magno e corte ao longo da circunferência do crânio em ambos os aspectos temporais em direção ao bregma, deixando algum tecido do crânio no lugar no bregma.
  13. Coloque uma lâmina de tesoura ou metade de uma pinça fina no forame magno e levante superiormente, separando o crânio do cérebro. Tenha cuidado para não empurrar a lâmina da tesoura ou a pinça para dentro do cérebro enquanto levanta o crânio.
  14. Use uma espátula cirúrgica para colher sob o cérebro (do anterior) e remova cuidadosamente o cérebro no béquer de 10 mL contendo solução de corte gelada, tendo o cuidado de proteger o cerebelo enquanto o cérebro é transferido. Coloque luvas limpas nesta fase.
  15. Retire cuidadosamente o cérebro do copo (usando a ferramenta espátula) e coloque-o sobre o papel de filtro (em uma placa de Petri). Use a lâmina de um gume para cortar ao longo do eixo parassagital a alguns milímetros da linha média. Descarte o tecido seccionado parassagital menor. Faça um segundo corte coronal no meio do prosencéfalo (anterior ao cerebelo). Descarte o tecido cortado coronalmente que é anterior ao cerebelo.
  16. Deslize a lâmina de borda única sob a porção anterior do prosencéfalo e levante para girar o tecido restante de modo que o lado do corte parassagital inicial fique voltado para baixo (no papel de filtro) e o hemisfério cerebelar não cortado fique voltado para cima.
  17. Coloque o tubo de amostra na vertical no gelo e adicione uma fina camada de supercola (adesivo de cianoacrilato) na superfície do tubo. Usando uma ferramenta de espátula com uma curvatura de 90°, transfira cuidadosamente o tecido cerebral do papel de filtro para a superfície do tubo de amostra, mantendo a orientação do tecido. Certifique-se de que o hemisfério cerebelar não cortado continue voltado para cima. Uma vez que o tecido é colocado/colado no tubo de amostra, deslize o tubo de metal para cima para que ele envolva o tecido cerebral.
  18. Usando uma pipeta motorizada de 10 mL, encha o tubo de amostra com a agarose aquecida (incorporando o tecido cerebral). Resfrie rapidamente o tecido (agora embebido em agarose aquecida) prendendo o bloco de resfriamento ao redor do tubo de metal por ~ 30 s.
  19. Coloque o tubo de amostra na câmara de banho de vibratomo e encha o banho com a solução de corte derretida. Pulverize continuamente a solução de corte durante o corte do tecido cerebral, mas não exponha diretamente as fatias cerebelares a bolhas de gás.
  20. Corte fatias parassagitais de 300-350 μm, transferindo imediatamente cada fatia para a câmara de retenção de fatias, preenchida com ACSF em temperatura ambiente aspergida. Quando todas as fatias estiverem na câmara de fatias, incubar a câmara de fatias em banho-maria a 33 °C durante 25 minutos.
  21. Após 25 minutos no banho-maria, coloque a câmara de corte (novamente) em temperatura ambiente, esperando pelo menos 35 minutos adicionais antes de tentar gravações de patch de qualquer uma das fatias cerebelares.

2. Configurando um modelo de condutância baseado em Markov no grampo dinâmico

NOTA: O grampo dinâmico é a aplicação em tempo real de uma condutância modelada a uma célula viva. A tensão da membrana é registrada/amostrada por meio de um eletrodo afiado ou patch, e o sinal digitalizado é enviado para o software de pinça dinâmica, que calcula, usando o(s) modelo(s) de condutância iônica que está sendo aplicado, a injeção de corrente de pinça dinâmica apropriada para a tensão amostrada. O sinal de injeção de corrente de pinça dinâmica calculado é enviado ao amplificador e ao estágio principal para ser injetado (via eletrodo) na célula. Para que uma condutância modelada seja apropriadamente adicionada a uma célula que dispara potenciais de ação, que conduzem mudanças transitórias rápidas na tensão da membrana, a frequência de amostragem de tensão deve ser alta o suficiente e o atraso entre a amostra de tensão e a injeção de corrente de pinça dinâmica (às vezes chamada de latência) deve ser mínimo e invariante29.

  1. Antes de qualquer experimento de grampo dinâmico, desenvolva ou obtenha o modelo matemático para a(s) condutância(s) iônica(s) a ser(em) usada(s) no experimento de grampo dinâmico. Esses modelos podem estar na forma de um modelo de estado cinético de Markov, um modelo de Hodgkin-Huxley (HH) ou condutância passiva (linear). Certifique-se de que o modelo de condutância escolhido reproduza com precisão as propriedades cinéticas e dependentes de tensão da condutância iônica pretendida.
    NOTA: Os experimentadores podem confirmar as propriedades de uma condutância iônica modelada, antes do uso em experimentos de grampo dinâmico, testando a condutância modelada (in silico) em estudos de simulação de grampo de tensão. Propriedades e considerações importantes do estado cinético de Markov e dos modelos de condutância HH são descritas na seção Discussão. As etapas abaixo descrevem a configuração de um modelo de condutância de Markov no software de grampo dinâmico.
  2. Crie ou obtenha um diagrama de transição de estado de Markov para o modelo de condutância a ser usado em experimentos de grampo dinâmico. Use este diagrama para montar com precisão o modelo de condutância de Markov dentro do software de grampo dinâmico (descrito abaixo).
    NOTA: SutterPatch é o dPatch amplifier software de aquisição de dados. Experimentos dinâmicos de pinça podem ser realizados dentro do software, o que permite a montagem e aplicação de condutâncias modeladas por meio de injeção de corrente durante protocolos de pinça de corrente. Um diagrama de transição de estado de Markov para uma condutância de sódio dependente de voltagem modelada, com base em medições de corrente Nav de neurônios de Purkinje de camundongos, é mostrado na Figura 1A. Este modelo foi desenvolvido por Ransdell et al., 202230 e tem sido usado para investigar o papel dos componentes persistentes e ressurgentes da corrente de sódio no disparo de neurônios de Purkinje31. Os estados de gating (C, IC, IF, IS e O) são interconectados por constantes de taxa de transição, denotadas por variáveis (ou seja, S0, S3, S1, S4). Esse modelo é usado nos experimentos de grampo dinâmico representativo e está disponível para download no GitHub: https://github.com/morenomdphd/Resurgent_INa.
  3. No software de aquisição de dados, abra a janela Dynamic Clamp Editor na guia SutterPatch > Dynamic Clamp Editor ou clicando no ícone correspondente na janela Painel . Partes da janela do editor de grampo dinâmico são mostradas na Figura 1B.
    NOTA: A janela Editor de grampo dinâmico contém todas as configurações necessárias para aplicar a condutância modelada durante um protocolo de gravação de grampo de corrente. A interface do conjunto de condutâncias (Figura 1B, canto superior esquerdo) permite que os usuários organizem e carreguem simultaneamente grupos de condutâncias do modelo.
  4. Na interface do Pool de Condutância (Figura 1B, canto superior esquerdo), crie um pool clicando em Novo e nomeando-o conforme desejado. Uma vez selecionado um pool de condutância, à direita da janela na interface do seletor Headstage (Figura 1B, canto inferior esquerdo), selecione o tipo de modelo para o respectivo pool de condutância (Model-Markov, Hodgkin-Huxley, condutância variável, etc.) e quando a(s) condutância(s) do modelo deve(m) ser aplicada(s), como durante uma rotina/protocolo (Modo Ativo). O Headstage interface seletora também permite a seleção do dinâmico clamp Taxa de atualização (em kHz) e o Vol Fonte de sinal (veja a Figura 1B, à direita). Para Fonte de sinal de tensão, selecione o headstage que está gravando o sinal de tensão.
  5. No painel seletor Headstage , para o exemplo Modelo de Markov de condutância de navegação (Figura 1A), selecione Modelo de Markov para Modelo, Durante varreduras para Modo ativo, 200 kHz para Taxa de atualização e Headstage 1 para Fonte de sinal de tensão. Verifique o Aplicar e Comando Sinal ao AuxOUT1 para iniciar os cálculos do modelo em resposta ao voltage sinal e adicionar injeção dinâmica de corrente de pinça a qualquer protocolo de pinça de corrente, respectivamente (Figura 1B, inferior esquerda).
  6. Abaixo dos painéis principais do Editor de grampos dinâmicos está a matriz de estado (Figura 1C, parte inferior). Edite a matriz de estado clicando primeiro em Editar parâmetros do modelo na interface do seletor Headstage (Figura 1B, canto inferior esquerdo). Uma nova janela aparecerá ao lado do editor chamada Parâmetros do modelo de Markov de grampo dinâmico. Neste painel, insira as equações da matriz de estado que representam a condutância do modelo de Markov.
  7. No painel Configurações do canal (Figura 1B, canto superior direito), selecione quais modelos de condutância salvos devem ser aplicados (em grampo dinâmico). Como alternativa, selecione um canal vazio e comece a criar uma nova condutância do modelo. À direita deste painel, insira a reversão V (potencial de reversão de íon(s) de condutância modelado). Para nosso estudo utilizando uma condutância de sódio, insira 55,0 mV para refletir o potencial de reversão do sódio com base no ACSF e na solução interna do eletrodo de conexão.
  8. Também no painel Configurações do canal , forneça o número de estados cinéticos da condutância selecionada (consulte a Figura 1B, canto superior direito, caixa vermelha). Aqui, insira 9 para refletir os 9 estados cinéticos da condutância modelada (consulte a Figura 1A).
  9. Abaixo do painel Configurações do canal está o painel Equações de estado . Coloque as equações constantes da taxa de transição de estado apropriadamente na matriz de estado de gating para refletir o arranjo topológico do modelo de Markov. Insira as equações no painel Equações de estado e forneça um ID, começando em "S0" (Figura 1B, meio).
    NOTA: A ordem com a qual essas equações são inseridas não é importante, desde que essas variáveis sejam preenchidas adequadamente na matriz de estado de gating para refletir a topologia do modelo de Markov.
  10. Para preencher a matriz de estado de passagem com as variáveis constantes de taxa agora definidas, clique em Editar matriz de estado no lado direito do painel Equações de estado (Figura 1B, meio). Cada estado cinético recebe um número, começando em 0. Por exemplo, para um modelo de estado cinético duplo, contendo estados X e Y, esses estados serão chamados de "0" e "1" e incluirão duas constantes de taxa de transição a1 e b1, onde a1 faz a transição de 0 para 1 e b1 faz a transição de 1 para 0.
  11. Para conectar adequadamente essas equações usando o Editor de Matriz de Estado (Figura 1B, parte inferior), insira as constantes de taxa em uma tabela contendo linhas e colunas numeradas, ambas começando em 0 (veja o exemplo na Figura 1C).
    NOTA: O movimento de um estado para outro é determinado por sua posição nesta tabela na forma "linha para coluna". Por exemplo, no exemplo de modelo de dois estados na etapa 2.1, a transição do estado 0 para o estado 1 depende da constante de taxa "a1", que é então colocada na linha 0, coluna 1. A constante de taxa de transição "b1" conduz as transições do estado 1 para o estado 0 e, portanto, a constante de taxa deve ser colocada na linha 1, coluna 0. Na Figura 1C, a matriz de estado de gating de exemplo tem constantes de taxa que refletem a topologia do modelo de condutância Nav mostrado na Figura 1A. Por exemplo, "S0" é a constante de taxa que define as transições do estado cinético IC1 para o IC2; assim, "S0" é colocado na linha 0, coluna 1 da Matriz de Estado de Gating (Figura 1C). As equações da constante de taxa de transição que definem a variável de cada constante de taxa preenchem uma matriz de estado preenchido (Figura 1C, inferior).
  12. À medida que as equações constantes de taxa são conectadas por meio do painel do editor de matriz de estado, as conexões (a linha e a coluna correspondentes) preencherão o painel Conexões ao lado da equação (Figura 1B, meio à direita). Observe o estado Aberto/Condutor no modelo representativo de condutância de sódio (Figura 1A), adicionado à linha e coluna 7 da Figura 1C (superior, caixas vermelhas), o que é importante para a próxima etapa.
  13. Na Figura 1B (canto inferior direito), use o painel Equações de condutância (nS) para definir a amplitude da condutância do modelo que será aplicada durante o grampo dinâmico. Selecione os estados abertos/condutores no modelo de Markov e forneça um valor de condutância (Figura 1B, inferior, caixa vermelha).
  14. Para este experimento, insira "400 nS" na caixa "G7", que adiciona valores de corrente de pico de Nav semelhantes às correntes de pico de Nav medidas em estudos de pinça de tensão em neurônios de Purkinje de camundongos.
  15. Depois que as etapas acima forem concluídas, clique em Carregar para preparar o modelo para aplicação dinâmica de grampo assim que uma rotina de grampo de corrente for iniciada.
  16. Use um processo semelhante para organizar modelos de HH; no entanto, adicione equações para definir estados de passagem independentes (em Equações de Porta) e condutância abaixo de G máximo.
  17. Para aplicar a condutância dinâmica do grampo, primeiro crie uma rotina de grampo de corrente usando o Editor de Rotina (clique na guia SutterPatch > Editor de Rotina) (Figura 1D). Para criar uma rotina de pinça de corrente, selecione o Canal de Saída Pai (que é StimOut1 neste exemplo). Isso abrirá um painel que permite ao usuário definir a saída do comando atual durante a rotina. Certifique-se de que o Modo de gravação esteja definido como CC_Mode no Editor de rotina.
    NOTA: Nos experimentos representativos, como este protocolo está trabalhando com células de disparo espontâneo, é usada uma rotina/protocolo de pinça de corrente sem lacunas que tem injeção de corrente zero.
  18. Nos Canais de Entrada do Editor de Rotina (Figura 1D, canto superior direito), defina os sinais de entrada, que, durante os experimentos, preencherão as janelas de escopo gravadas. Essas entradas devem incluir um sinal de tensão, e também incluir a injeção de corrente de comando da rotina, bem como a injeção dinâmica de corrente de pinça, denominadas Corrente1 e AuxIN1, respectivamente (Figura 1D, canto inferior esquerdo).
  19. Para rotinas de pinça de corrente que envolvem comandos de injeção de corrente positiva e/ou negativa, o sinal de injeção de corrente de comando será automaticamente combinado com o sinal de corrente de pinça dinâmica. Crie uma janela de osciloscópio virtual para subtrair o sinal de corrente de comando para que haja um registro da injeção de corrente de pinça dinâmica isolada. Para criar a nova janela de escopo virtual, primeiro selecione um canal de entrada adicional marcando a caixa de seleção Virtual1.
  20. No Editor de rotinas, em Tipo matemático, selecione Equação e selecione (em Canal de origem) o sinal de entrada de comando da rotina de pinça de corrente, que neste exemplo é Current1. Insira uma equação em campo aberto para subtrair o sinal de comando do pinça de corrente do sinal de injeção de corrente do grampo dinâmico.
    NOTA: Para este experimento de exemplo, isso é feito com a equação t[3]-t[2]. A janela do osciloscópio Virtual1 agora exibe a injeção dinâmica de corrente de pinça (isolada do sinal de comando atual). Os usuários podem personalizar os rótulos dos canais de entrada ou saída clicando duas vezes em Rótulo.

3. Aquisição de gravações de pinça de corrente de neurônios de Purkinje de camundongo em fatias cerebelares parassais

  1. Equipar o equipamento de eletrofisiologia com uma câmara de corte de tecido que seja (gravidade) perfundida com ACSF aquecida a uma temperatura próxima da fisiológica (34-36 °C). Coloque cuidadosamente uma fatia cerebelar parassagital na câmara de fatia e use uma harpa de fatia para manter a fatia cerebelar em uma posição submersa e fixa. Certifique-se de que um eletrodo de aterramento cloreto e uma sonda de temperatura também estejam submersos e estáveis dentro da câmara de corte cerebelar.
  2. Localize a camada de neurônios de Purkinje usando uma lente objetiva de imersão de 40x. Os neurônios de Purkinje são grandes e em forma de lágrima. A membrana plasmática das células de Purkinje saudáveis geralmente parece lisa e o núcleo não é visível.
  3. Assim que um neurônio de Purkinje saudável for identificado e direcionado para gravação de patch-clamp, ajuste a lente objetiva do microscópio para cima. Posicione e concentre-se na ponta de um microeletrodo de vidro preso a um suporte de eletrodo e headstage. Controle o headstage/microeletrodo por um micromanipulador robótico de 3 eixos.
    NOTA: Para esses experimentos, certifique-se de que os microeletrodos tenham valores de resistência de 2-4 MΩ e sejam preenchidos com uma solução interna de pinça de corrente apropriada. A solução interna usada em experimentos representativos contém: 144 mM de K-gluconato, 0,2 mM de EGTA, 3 mM de MgCl2, 10 mM de HEPES, 8 mM de NaCl, 4 mM de Mg-ATP e 0,5 mM de Na-GTP.
  4. Antes de se aproximar do neurônio de Purkinje alvo, adicione 2-3 mL de pressão de ar positiva na porta de pressão do porta-eletrodo.
  5. Mude para o modo VC no amppainel de controle do amplificador e aplique as funções de compensação de eletrodo e deslocamento de tensão do eletrodo. No exemplo aqui, faça isso clicando em Auto ao lado das opções de compensação de eletrodo e deslocamento de tensão.
  6. Inicie um protocolo de teste contínuo de vedação de membrana (clique em Teste de membrana). Defina os parâmetros de teste de membrana em varreduras de 5 ms (ou próximas) com um passo de 5 mV ou 10 mV. Defina o potencial de retenção (retenção em V) para 0 mV.
  7. Mova o microeletrodo em direção à célula-alvo, ajustando o plano focal para manter o foco na ponta do eletrodo ou ligeiramente abaixo dela. Posicione o eletrodo ligeiramente acima da membrana plasmática da célula-alvo. Use o micromanipulador e a pressão positiva da ponta do eletrodo para afastar os detritos extracelulares do soma da célula-alvo, 'limpando' a membrana da superfície.
  8. Depois que a célula-alvo estiver livre de detritos extracelulares, posicione lentamente o eletrodo próximo à superfície da membrana na extremidade larga do soma do neurônio de Purkinje, a partir do qual o axônio se estende do corpo celular. À medida que a ponta do eletrodo é abaixada para a membrana, uma covinha provavelmente se tornará visível na superfície da membrana (devido à pressão positiva do eletrodo). Neste ponto, libere a pressão positiva e use a sucção bucal para aplicar uma pequena quantidade de pressão negativa.
  9. No painel de controle do amplificador , altere o potencial de retenção de V para -80 mV (de 0 mV). Monitorando o teste de vedação da membrana, quando a resistência da pipeta atingir ≥ 1 GΩ, aumente a pressão negativa e clique na função Zap no painel de teste de vedação da membrana para romper a membrana e obter uma configuração de patch clamp de célula inteira.
  10. Use um breve protocolo de grampo de tensão para medir as propriedades passivas da membrana (valores de capacitância e resistência de entrada) antes de comutar, através do amppainel de controle do amplificador, para o modo de grampo de corrente.
  11. Depois de alternar para o modo de pinça de corrente, aplique uma compensação de equilíbrio da ponte para ≥ 70%.
  12. Antes de aplicar uma condutância dinâmica do grampo com um eletrodo de remendo, corrija o erro de potencial de junção (que é calculado com base na composição do eletrodo interno e das soluções ACSF). Para as soluções nos experimentos representativos, aplique uma correção de potencial de junção de 17,5 mV. Em estudos de pinça dinâmica, uma correção precisa do potencial de junção é crítica para que um sinal de tensão preciso seja usado pelo(s) modelo(s) de condutância para calcular as injeções dinâmicas de corrente da pinça.

4. Aplicando a condutância dinâmica da pinça

  1. Como os neurônios de Purkinje disparam potenciais de ação repetitivos espontaneamente, registre as propriedades de disparo antes de adicionar (ou subtrair) uma condutância iônica modelada para testar a saúde celular e medir as propriedades basais da excitabilidade da membrana. Aplique a condutância modelada clicando em Carregar na janela de configurações de grampo dinâmico . Um pequeno rótulo DynC agora estará visível no controlador dPatch, sobrepondo CC (consulte a Figura 1D, caixas vermelhas).
  2. Depois que o grampo dinâmico é ligado/carregado, a condutância do grampo dinâmico é aplicada automaticamente enquanto uma rotina/protocolo de grampo de corrente está ativo. View a injeção dinâmica de corrente de alicate na janela do osciloscópio correspondente ao sinal de entrada selecionado AuxIN1 .
    NOTA: Gravações alternadas de disparo espontâneo com e sem aplicação de condutâncias dinâmicas mediadas por grampo são importantes para determinar como a condutância do modelo aplicado afeta a excitabilidade e para determinar se os níveis basais de excitabilidade são estáveis / consistentes ao longo do experimento.

Resultados

Nos experimentos apresentados, aplicamos, usando grampo dinâmico, uma condutância de sódio dependente de voltagem (Nav) modelada para neurônios de Purkinje cerebelares de camundongos adultos (6-7 semanas de idade) que são agudamente isolados em uma preparação de corte cerebelar parassagital. Os estudos são realizados em camundongos do tipo selvagem (controle) e camundongos transgênicos, nos quais a recombinação Cre-loxP é usada para excluir seletivamente a esclerose tuberosa 1 (Tsc1) dos neurônios cerebelares de Purkinje. O complexo de esclerose tuberosa (CET) é um distúrbio multissistêmico causado por mutações de perda de função em TSC1 ou TSC2 32,28,33. Indivíduos com CET são comumente diagnosticados com transtornos epilépticos, comprometimento cognitivo e transtorno do espectro autista34,35. Camundongos com deleção Tsc1 específica do neurônio de Purkinje, referida aqui como Tsc1mut / mut, exibem vários fenótipos comportamentais relacionados ao TEA, incluindo deficiências na função motora, comportamento de interação social e vocalizações, bem como comportamentos repetitivos exagerados 9,36. Tsc1mut/mut Os neurônios de Purkinje também demonstraram ter disparo atenuado do potencial de ação ( Figura 2A , B ), que está ligado a amplitudes de corrente de Nav significativamente reduzidas ( Figura 2C ) e expressão do canal de Nav nos segmentos iniciais do axônio dos neurônios de Purkinje Tsc1mut / mut 8. As correntes de navegação nos neurônios de PurkinjeTsc1 mut / mut têm propriedades cinéticas e dependentes de voltagem semelhantes às dos neurônios de Purkinje do tipo selvagem8. Neste modelo de camundongo transgênico Tsc1mut / mut, usamos grampo dinâmico para testar se a adição de condutância Nav aos neurônios Tsc1mut / mut Purkinje pode resgatar disparos repetitivos. Continuamos testando se a subtração da condutância de Nav em neurônios de Purkinje do tipo selvagem causa uma atenuação semelhante no disparo de neurônios de Purkinje medida em neurônios de Purkinje Tsc1 mut / mut (Figura 2B). Para subtrair a condutância Nav expressa nativamente, aplicamos a condutância Nav usando pinça dinâmica; no entanto, a polaridade da condutância é invertida.

O modelo de estado cinético de Markov (Figura 1A) usado para simular a condutância Nav do neurônio de Purkinje contém nove estados cinéticos, oito dos quais não condutores, que são rotulados como fechados (C1, C2 e C3), inativados-fechados (IC1 e IC2), inativados rapidamente (IF1 e IF2) e inativados lentamente (IS). Existe um estado cinético aberto/condutor (O)30,31. As constantes de taxa de transição, mostradas entre os estados cinéticos rotulados (Figura 1A), determinam a proporção de canais/condutância simulados ocupando cada estado cinético. A tensão da membrana afeta cada uma das constantes de taxa do modelo. As correntes de Nav simuladas produzidas por este modelo (in silico) em experimentos simulados de pinça de tensão são mostradas (em vermelho) à direita das correntes de Nav medidas a partir de neurônios de Purkinje agudamente isolados, que são mostrados em preto (Figura 1A, inferior). O comando de tensão que evoca essas correntes Nav simuladas (vermelho) e neurônio de Purkinje (preto) é apresentado acima dos traços de corrente em preto. Observe que, no comando de tensão, uma etapa inicial de despolarização (até 0 mV) resulta em uma corrente interna de sódio transitória rápida, que, no traço simulado, reflete os canais que transitam dos estados fechados não condutores para o estado cinético aberto, permitindo uma breve corrente interna antes que os canais de estado aberto se acumulem nos estados cinéticos inativados rapidamente (IF1 e IF2). Este passo de tensão de despolarização é breve (5 ms) e o potencial de membrana é subsequentemente escalonado para uma tensão repolarizada intermediária de -45 mV, na qual o potencial é mantido por 80 ms (Figura 1A, inferior). Durante esta etapa de tensão de repolarização, é notável que há um ressurgimento da corrente interna de sódio, um componente de corrente conhecido como corrente de sódio ressurgente (INaR). Durante este passo de 80 ms para -45 mV, INaR exibe um decaimento lento (em comparação com INaT) na amplitude, eventualmente atingindo um estado estacionário de corrente interna, que é o componente de corrente Nav persistente (INaP). A ativação do INaR modelado (Figura 1A, inferior, vermelho) durante a repolarização da membrana reflete os canais simulados que se recuperam dos estados cinéticos rapidamente inativados (IF1 + IF2) para o estado aberto / condutor. Com o tempo (mantendo -45 mV), uma parte dos canais simulados que ocupam o estado aberto se acumula em um estado cinético absorvente de inativação lenta (IS), que é refletido como decaimento de INaR, e uma parte desses canais permanece no estado aberto / condutor, refletido como o componente de corrente INaP de estado estacionário30,31.

Nos experimentos/resultados representativos, o modelo de condutância de Nav Markov (Figura 1A) foi adicionado aos neurônios de Purkinje adultos em fatias cerebelares agudamente isoladas. Uma representação em desenho animado dessa configuração experimental é apresentada na Figura 3A. Para aplicar a condutância Nav modelada por meio de injeção dinâmica de corrente de pinça, usamos o sistema amplificador dPatch (mostrado na Figura 3B), que possui conversão analógico-digital (A/D) e digital-analógico (D/A) totalmente integrada. Este sistema também lida com transformações de sinal por meio de processadores de núcleo ARM integrados (externos ao PC) e possui um circuito FPGA (matriz programável em campo) integrado que permite o processamento quase instantâneo de sinais de entrada e feedback (envio de sinais de saída) para o eletrodo de injeção de corrente27. Os experimentos aqui envolveram a aplicação (em pinça dinâmica) de um modelo complexo de condutância de Markov, que pudemos aplicar com taxas de atualização de injeção de corrente de até 500 kHz.

A adição da condutância de Nav simulada (400 nS) aos neurônios de Purkinje Tsc1mut / mut durante os registros de pinça de corrente sem intervalos resultou em aumentos claros nas frequências de disparo repetitivo das células ( Figura 3C1 , D1 ), indicando que a adição de condutância de Nav nessas células pode ser suficiente para resgatar déficits na excitabilidade do neurônio de Purkinje Tsc1mut / mut , embora não tenhamos examinado o repertório completo de déficits relatados em Tsc1mut / mut Excitabilidade do neurônio de Purkinje8. Como é evidente a partir dos traços representativos mostrados na Figura 3C2 (acima), os neurônios de Purkinje do tipo selvagem têm uma capacidade intrínseca de disparar potenciais de ação repetitivos em altas frequências. Usando grampo dinâmico, subtraímos a condutância de Nav modelada dos neurônios de Purkinje do tipo selvagem, aplicando a condutância de Nav modelada com uma polaridade invertida (negativa) (-400 nS). Subtrair a condutância de Nav modelada resultou em uma redução imediata e óbvia no disparo repetitivo (Figura 3C2, inferior), o que também é consistente com a hipótese de que as correntes de Nav reduzidas medidas nos neurônios de Purkinje Tsc1mut / mut contribuem para as propriedades de disparo atenuadas medidas nessas células8. Em vários neurônios Tsc1mut / mut ou Purkinje do tipo selvagem, esses experimentos dinâmicos de grampo, nos quais a condutância Nav foi adicionada ou subtraída, respectivamente, resultaram em efeitos consistentes na frequência de disparo. A adição de condutância de Nav significativamente (P = 0,029) aumentou a frequência de disparo do neurônio de PurkinjeTsc1 mut / mut (Figura 3D1) e, nos neurônios de Purkinje do tipo selvagem, a subtração da condutância de Nav significativamente (P = 0,031) reduziu a frequência de disparo (Figura 3D2) (teste t pareado de Student).

figure-results-1
Figura 1: Configurando um modelo de Markov no software de grampo dinâmico. (A) Um diagrama de transição de estado de Markov é mostrado para um modelo que reproduz as propriedades de condutância de Nav medidas em neurônios de Purkinje cerebelaresde camundongo 30. Este modelo inclui nove estados cinéticos. Destes, 8 são estados não condutores: três fechados (C), dois inativados-fechados (IC), dois inativados rapidamente (IF) e um inativado lentamente (IS). O modelo inclui um estado cinético aberto (O), que é condutor. Entre estados cinéticos adjacentes, a transição de conexões/ocupação de estado ao longo do tempo é definida por constantes de taxa de transição, mostradas como S0-S15. Observe que cada estado cinético também recebe um valor numérico (vermelho), que permite aos usuários definir o modelo de Markov e sua topologia de estado cinético em uma matriz de estado de gating (mostrada no painel C, descrito abaixo). (B) Painéis / interfaces gráficas com os quais os usuários trabalham no SutterPatch Dynamic Clamp Editor são apresentados. Observe que a disposição desses painéis do Editor de grampo dinâmico não é consistente com a disposição como aparece no software de grampo dinâmico. Além disso, nem todos os painéis associados ao Editor de grampo dinâmico são mostrados. (C) (painel superior) Um exemplo de uma matriz de estado de gating é mostrado com variáveis inseridas que correspondem à topologia do diagrama de transição de estado mostrado no painel A. As caixas vermelhas na matriz de estado de gating destacam a linha e a coluna 7, que correspondem ao estado cinético aberto (O) do modelo. Na coluna 7, todas as constantes de taxa que definem transições para o estado cinético aberto (O) são listadas e, na linha 7, todas as constantes de taxa que definem transições que saem do estado cinético aberto (O) são listadas. Com essa organização, a matriz de estado de gating descreve o número de estados cinéticos, as variáveis constantes de taxa e a topologia (interconexões entre estados cinéticos) do modelo. Mostrados em (D) são os painéis/interfaces de usuário SutterPatch associados ao carregamento de modelos dinâmicos de condutância de grampos, juntamente com as interfaces envolvidas na criação de rotinas de grampo atuais. As interações do usuário com esses modelos são descritas nas etapas de protocolo 2.17-2.20. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Os neurônios de Purkinje Tsc1mut / mut têm excitabilidade de membrana atenuada em comparação com os controles do tipo selvagem. (A) Registros de pinça de corrente de célula inteira de neurônios de Purkinje do tipo selvagem (superior, preto) e Tsc1mut / mut (inferior, azul) revelam disparo atenuado na célula mutante Tsc1 . (B) Frequências de disparo reduzidas em neurônios Tsc1mut / mut Purkinje, em comparação com controles do tipo selvagem, são consistentes entre as células. A frequência média (±± SEM) de disparos espontâneos dos neurônios de Purkinje Tsc1mut / muté significativamente (P < 0,0001) menor em comparação com as células do tipo selvagem (teste t não pareado de Welch; controle N = 13, n = 32; Tsc1mut/mut N = 6, n = 21). (C) Medições de pinça de voltagem de correntes Nav em neurônios adultos de Purkinje revelam que o pico médio (±± SEM) de corrente Nav transiente rápida (INaT) é significativamente reduzido em células Tsc1mut / mut , em comparação com controles do tipo selvagem. (P = 0,007, ANOVA bidirecional RM; controle do tipo selvagem: N = 6, n = 22, preto; Tsc1mut/mut: N = 6, n = 16, quadrados azuis). Os registrosNaT do Exemplo I, evocados por uma etapa de despolarização de -35 mV, são mostrados como um painel inserido à direita do painel C. Dados publicados anteriormente em Brown et al.8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: Usando grampo dinâmico para determinar os efeitos de uma condutância iônica na excitabilidade do neurônio de Purkinje. A pinça dinâmica envolve a amostragem da tensão da membrana (por meio de um eletrodo de gravação) e o cálculo, com base na tensão amostrada, da saída de corrente de uma condutância do modelo. A corrente computada é então aplicada a uma célula biológica usando um eletrodo de injeção de corrente. O painel (A) descreve esse arranjo experimental. Se a amostragem de tensão for realizada em uma frequência suficiente e houver um atraso mínimo (latência) entre a amostragem de tensão e a aplicação da corrente computada, essa técnica pode ser usada para avaliar como a adição ou subtração de uma condutância modelada afeta o disparo neuronal e a excitabilidade da membrana. (B) Em experimentos representativos, as gravações dinâmicas de grampos foram adquiridas usando o software SutterPatch e o sistema amplificador dPatch. O dPatch é um amplificador patch-clamp que possui processadores de sinal externos e um digitalizador totalmente integrado, o que o torna adequado para gravações dinâmicas de grampos (consulte a Discussão). (C) Registros representativos de pinça de corrente de disparo espontâneo de neurônios de Purkinje, antes e depois de usar a pinça dinâmica para adicionar ou subtrair 400 nS da condutância de Nav modelada (apresentada na Figura 1A). Em C1 (à esquerda), os registros são de um neurônio Tsc1mut / mut Purkinje com disparo atenuado. A adição de condutância Nav de 400 nS resulta em um claro aumento na frequência de disparo desta célula. Alternativamente, em C2, os registros são de um neurônio de Purkinje do tipo selvagem. Neste experimento, a condutância Nav modelada é aplicada com uma polaridade reversa (-400 nS), resultando em subtração da condutância Nav e uma clara redução na frequência de disparo repetitivo. Os registros dinâmicos de injeção de corrente de pinça, mostrados em cinza, são apresentados abaixo dos registros de disparo de potencial de ação (tensão), mostrados em preto. (D) Os resultados desses experimentos dinâmicos de grampo, apresentados como as mudanças na frequência de disparo espontâneo após a adição de condutância Nav aos neurônios Tsc1mut / mut Purkinje (D1, n = 3) ou subtraindo a condutância Nav dos neurônios Purkinje do tipo selvagem (D2, n = 3), revelam efeitos consistentes e significativos da adição ou subtração dessa condutância em Tsc1mut / mut (P = 0,029) e tipo selvagem (P = 0,031), respectivamente (teste t de Student pareado). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Os circuitos cerebelares funcionam na propriocepção e no controle motor37,38, mas também são críticos para comportamentos complexos, como interações sociais e processamento emocional 39,40,41. A patologia na estrutura e função cerebelar está frequentemente ligada ao TEA 42,43,44,45,46. A arquitetura simples dos circuitos cerebelares47 e o claro papel do cerebelo na patologia do TEA o tornam uma região cerebral atraente para investigar os fatores moleculares e celulares dos déficits comportamentais do TEA, bem como possíveis terapêuticas. A eletrofisiologia dinâmica do grampo oferece uma ferramenta importante para essas investigações, permitindo que os investigadores testem diretamente as relações causais entre as alterações relacionadas ao TEA nas propriedades do canal iônico / condutâncias iônicas e o disparo de neurônios cerebelares. Embora os métodos de clamp dinâmico sejam particularmente adequados para investigações de alterações relacionadas ao TEA na excitabilidade neuronal, essa técnica é relevante para investigar uma variedade de mecanismos patológicos que afetam células com membranas excitáveis. Além disso, o grampo dinâmico continua sendo uma excelente ferramenta para dissecar os processos complexos pelos quais os neurônios e as células musculares regulam e mantêm o disparo do potencial de ação apropriado.

A execução precisa de experimentos de grampos dinâmicos requer um controle cuidadoso dos parâmetros técnicos. Especificamente, os experimentadores devem conhecer e compreender as consequências da variabilidade potencial no atraso entre a amostragem de tensão e a injeção de corrente, muitas vezes referida como jitter29, bem como as propriedades passivas do eletrodo, limitações de grampo de espaço e a fidelidade fisiológica da preparação experimental sob investigação. Bettencourt et al. (2008)48 e Butera et al. (2001)29 mostraram anteriormente que atingir altas taxas de amostragem de pelo menos 50 kHz é fundamental para capturar com precisão condutâncias iônicas rápidas, com latências de feedback idealmente mantidas abaixo de 25% (≤ 5 μs) do intervalo de amostragem. As taxas de amostragem nominais relatadas por sistemas comerciais, particularmente plataformas baseadas em Windows, podem ser enganosas; portanto, muitas vezes é necessária uma verificação independente do desempenho, o que é discutido com mais detalhes por Milescu et al. (2008)25 e Clausen et al. (2012)49. As restrições de grampo de espaço também devem ser consideradas, particularmente ao trabalhar com neurônios intactos que possuem morfologias complexas e propriedades de membrana não isopotenciais. Por exemplo, tentar aplicar (ou subtrair) uma condutância com um eletrodo distal ao local integrador, como o AIS, resultará em um retrato impreciso dos efeitos da condutância aplicada. Baixa (alta) resistência do eletrodo, compensação inadequada de capacitância e/ou falha em corrigir o erro do potencial de junção também podem causar uma deturpação das medições de tensão (sinal de entrada) e, consequentemente, aplicação incorreta de condutâncias iônicas modeladas50,51.

Milhares de modelos Markov e HH estão disponíveis gratuitamente para pesquisadores em bancos de dados on-line, como ModelDB52 e Channelpedia53, apoiados pelo Projeto Cérebro Humano e pelo Laboratório de Microcircuitos Neurais, respectivamente. Esses bancos de dados incluem modelos para condutâncias sinápticas, condutâncias de canais iônicos e modelos de neurônios baseados em condutância, que são escritos principalmente em NEURON, MATLAB ou Python. Os arquivos de banco de dados normalmente fornecem as equações de modelo necessárias, bem como quaisquer informações diversas sobre o(s) tipo(s) de célula e experimentos que informaram o modelo.

Os modelos de condutância de Markov e HH contêm estados/variáveis de regulação condutores (simulando canais abertos/ativados) e não condutores (canais simulados fechados). No entanto, esses tipos de modelo diferem na maneira como o valor de condutância é calculado em cada tensão amostrada, com os modelos de Markov exigindo mais poder computacional, mas fornecendo mais detalhes nas propriedades de passagem dos canais simulados. Por exemplo, em modelos HH, os estados condutores e não condutores são variáveis independentes, cada uma determinada pela entrada de tensão e cinética de passagem do respectivo estado 54,55. Em contraste com os modelos de Markov, os modelos HH não simulam ou restringem as transições entre os estados de gating, como o trânsito de canais simulados do estado cinético ativado / aberto diretamente para o estado cinético inativado rapidamente em um modelo de condutância de sódio dependente de voltagem25. Isso torna os modelos HH menos complexos computacionalmente54,55 e permite que os investigadores adicionem vários modelos HH de condutância rápida simultaneamente, mantendo altas taxas de amostragem e atualização.

Os modelos de estado cinético de Markov são compostos por estados cinéticos discretos, que podem ser condutores ou não condutores, e esses estados estão interconectados em uma topologia fixa. Nas simulações do modelo de Markov, a condutância é calculada em cada tensão amostrada pela proporção de canais simulados que ocupam o(s) estado(s) cinético(s) condutor(es). A proporção de canais simulados que ocupam cada estado cinético (ao longo do tempo) é determinada por constantes de taxa, que são parâmetros que governam a taxa na qual a ocupação do estado transita de um estado cinético para outro. As constantes de taxa têm unidades de segundos inversos (s-1), representando uma probabilidade de transição por unidade de tempo. Dependendo do modelo, os valores constantes de taxa podem depender de fatores dinâmicos, como tensão ou temperatura.

Nos modelos de Markov, as equações diferenciais ordinárias são usadas para descrever a ocupação dependente do tempo de cada estado cinético. Essas equações governam como a probabilidade de estar em cada estado evolui ao longo do tempo, com base nas constantes da taxa de transição. Isso é representado por uma matriz de taxa Q: figure-discussion-156. Conforme discutido acima, as constantes de taxa de transição (r), que determinam o movimento entre os estados, podem ser influenciadas pela tensão de entrada (V) e pelos parâmetros α e β, que refletem a cinética da condutância entre as tensões. Essas equações podem ser descritas como: figure-discussion-2, e podem ser representadas visualmente na forma de gráficos que incluem conexões (constantes de taxa de transição) para dentro e para fora de cada estado cinético do modelo 56,57,58. Uma discussão útil sobre o desenvolvimento de modelos de Markov e sua topologia pode ser encontrada em Schoening e Silva (2024)56.

Desde o início do grampo dinâmico em sua forma atual, no qual condutâncias iônicas não lineares são modeladas e aplicadas (via eletrodo de injeção de corrente) a células vivas em tempo real19,59, os métodos e recursos para essa técnica evoluíram e são cada vez mais acessíveis e econômicos devido a inovações como sistemas de baixo custo baseados em microcontroladores60 e software livre e de código aberto23, 25,26. Sistemas comerciais, como o dPatch da Sutter Instrument ou o Cybercyte da Cytocybernetics, facilitam ainda mais a implementação rápida de experimentos dinâmicos de grampos por meio de soluções integradas de hardware e software27,61.

A versatilidade do grampo dinâmico permite diversas aplicações, incluindo a criação de sinapses químicas e elétricas virtuais, incorporando neurônios reais em redes artificiais (ou vice-versa) e adicionando canais iônicos virtuais62. É importante ressaltar que a dependência de voltagem, as propriedades cinéticas e as amplitudes de uma condutância aplicada podem ser ajustadas rapidamente, permitindo que os investigadores testem diretamente como a escala de um ou mais parâmetros afeta o disparo do potencial de ação e a excitabilidade da membrana31. Os sistemas atuais oferecem altas taxas de amostragem, permitindo a aplicação precisa de condutâncias transientes rápidas e podem ser facilmente integrados a equipamentos eletrofisiológicos convencionais60,63, solidificando o grampo dinâmico como um método ideal para avançar nossa compreensão da função e disfunção neuronal.

Divulgações

Os autores declaram não ter conflitos de interesse.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer a Telly Galiatsatos e Josh Stanford, da Sutter Instrument, por sua assistência em consultas técnicas. Também reconhecemos e agradecemos a Jan Dolzer pela ajuda no início dos estudos de grampos dinâmicos dPatch.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
CaCl2Fisher ChemicalC79-500 Reagente
Tubo de vidro capilar boroscilicata, parede padrão de 1,5 mm DI, 0,86 mm de comprimento 10 cmWarner Instruments64-0793Equipamento
CleanBenchTMC63-9090EEquipamento
Compresstome VF-500-Z vibratome Instrumentos Precissionárioshttps://precisionary.com/product-category/compresstome-parts/parts-by-model/vf-500-0z/Equipamento
Dell OptiPlex 7080Valehttps://www.dell.com/en-us/shop/desktop-computers/optiplex-7080-tower-and-small-form-factor/spd/optiplex-7080-desktop/s005o7080sffusEquipamento
DextroseFisher ChemicalD16-500 Reagente
Sistema amplificador dPatchInstrumento SutterFG-PATCHEquipamento
EGTAEMD Millipore324626-25GMReagente
HEPESFisher Chemical7365-45-9Reagente
Aquecedor em linhaWarner Instruments64-0102Equipamento
KclFisher ChemicalP330-500 Reagente
KetaminaProdutos Veterinários Dechra193.40620.3 Reagente
K-gluconatoTCI ChemicalsG0040Reagente
Software LinLabScientificahttps://www.scientifica.uk.com/products/scientifica-linlab-2Equipamento
Banho-maria LSE 6LCorning6783Equipamento
Mg-ATPSigma-Aldrich74804-12-9Reagente
MgCl2Fisher Chemical012288.A9Reagente
Puxador de pipetas modelo P-1000Instrumento SutterFG-P1000Equipamento
NaClFisher ChemicalS271-500 Reagente
Na-GTPMP Biomédicos56001-37-7Reagente
NaH2PO4J.T. Baker02-004-220 Reagente
NaHCO3Fisher ChemicalS233-500 Reagente
Software ocularDigital Optics Limitedhttps://www.scientifica.uk.com/products/qimaging-ocular-softwareEquipamento
LâminaPersonna60-0139-CTNEquipamento
Harpa de corteWarner Instruments64-0255Equipamento
SliceScope Pro 3000Scientificahttps://www.scientifica.uk.com/products/slicescope-pro-3000Equipamento
SupercolaLoctite8040-00-142-9193Equipamento
Software SutterPatchInstrumento Sutterhttps://www.sutter.com/amplifiers/sutterpatchEquipamento
Controlador de temperaturaWarner Instruments64-2400Equipamento
XilazinaMP Biomédicos158307Reagente

Referências

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