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Artigo de método

In vivo Microscopia Confocal no Diagnóstico e Tratamento do Olho Seco: Um Foco em Protocolos de Imagem e Interpretação

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DOI:

10.3791/69156

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11 de novembro de 2025

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1Hankou Aier Eye Hospital, 2Aier Eye Hospital of Wuhan University, 3School of Stomatology and Ophthalmology, Xianning Medical College, Hubei University of Science and Technology

Neste artigo

Resumo

Este artigo demonstra a operação e o efeito da microscopia confocal in vivo no diagnóstico e tratamento do olho seco e investiga a aplicação e os resultados da microscopia confocal in vivo para fornecer uma base para pesquisas futuras.

Resumo

A microscopia confocal in vivo (MICI) tem ganhado atenção significativa por sua natureza não invasiva e alta resolução. Ele permite a observação in vivo e a quantificação objetiva de várias estruturas da superfície ocular relacionadas à doença do olho seco (DED), incluindo a córnea, conjuntiva, margem palpebral, glândulas meibomianas e parasitas como o Demodex, no nível celular. Esse recurso auxilia os oftalmologistas na identificação de etiologias e subtipos específicos de DED, facilitando assim o diagnóstico preciso, o tratamento direcionado e a avaliação prognóstica. No entanto, ainda faltam protocolos padronizados para operação e notificação de MCIV. A proficiência tanto no conhecimento oftálmico quanto na operação técnica é essencial para utilizar efetivamente este dispositivo e gerar relatórios de alta qualidade. Este artigo detalha as etapas processuais e as nuances do exame IVCM para pacientes DED. Este é o primeiro protocolo de CMIV passo a passo JoVE para DED. O objetivo é servir como referência para os médicos, ajudando-os a evitar ineficiências operacionais e obter consistentemente imagens de córnea e superfície ocular de alta qualidade para orientar o manejo clínico.

Introdução

Devido a restrições nos recursos médicos locais ou encargos financeiros do paciente, o diagnóstico clínico de DED geralmente se concentra apenas em um aspecto básico (por exemplo, observação ao microscópio com lâmpada de fenda, queixa de ressecamento e coceira nos olhos) ou mesmo em um único indicador (por exemplo, tempo de quebra do filme lacrimal invasivo, teste de secreção lacrimal ou infestação por Demodex). A aplicação do IVCM não está amplamente disponível, muito menos padronizando protocolos para ela. No entanto, para instituições oftalmológicas equipadas com MCIV, o autor recomenda que os pacientes de primeira viagem sejam submetidos a um exame microscópico abrangente para evitar omissões, incluindo córnea, conjuntiva e margem palpebral. Para casos de DED ambíguos ou para detectar Demodex, o IVCM é especialmente adequado para uma resposta explícita.

A doença do olho seco (DED) é definida como uma condição crônica da superfície ocular causada por anormalidades na qualidade ou quantidade de fluido lacrimal e diminuição da estabilidade do filme lacrimal. No Workshop de Olho Seco II (DEWS II), O DED é classificado em cinco tipos: olho seco deficiente em água (ADE), olho seco evaporativo (EDE), olho seco misto (MDE), predisposição ao olho seco e estado de olho seco pré-clínico1. Ralene et al. resumiram a importante prática clínica da MCIV em diferentes tipos de olho seco, incluindo a literatura publicada de 2017 a 20222. Pesquisas recentes mostraram que a inflamação desempenha um papel fundamental na patogênese do DED 3,4. Especialmente, a densidade de células dendríticas (DCs) pode ser um bom indicador de DED associado a um processo imunomediado sistêmico5.

O IVCM utiliza a tecnologia de tomografia confocal a laser. Oferece resoluções horizontais e verticais de 1 μm. As especificações técnicas detalhadas do dispositivo estão documentadas no relatório de Jeremy et al6. Durante o exame da superfície ocular, a CIVM é aplicada primeiramente nacórnea7, seguida da conjuntiva e das glândulas meibomianas8. A blefarite por Demodex tem recebido crescente atenção clínica nos últimos anos 9,10. A CIVV fornece imagens nítidas da córnea, conjuntiva e margem palpebral. Essas imagens permitem que os médicos avaliem o estado da doença e facilitem a imagem e a quantificação de células inflamatórias e imunológicas.

Na avaliação DED, nosso foco inclui: células epiteliais da córnea (CEC); fibras nervosas subepiteliais (SNF); células inflamatórias/imunes interepiteliais e subepiteliais; células caliciformes conjuntivais (CGCs); células inflamatórias/imunes conjuntivais; ácinos e orifícios da glândula meibomiana; Demodex folliculorum e Demodex brevis; e células inflamatórias dentro dos tecidos circundantes. Essa ênfase decorre da fisiopatologia: a disfunção da glândula meibomiana leva à redução da secreção ou à composição alterada da camada lipídica do filme lacrimal, resultando em evaporação lacrimal acelerada e danos à superfície ocular. A infestação por Demodex contribui para a coceira e desconforto ocular. Os CGCs secretam mucina, um componente crítico do filme lacrimal; sua depleção pode causar DED deficiente em mucina. Por outro lado, o próprio DED danifica as estruturas da superfície ocular, incluindo CEC e SNF, e subsequentemente eleva a densidade de células inflamatórias / imunes nos tecidos da córnea e da conjuntiva. Depois de obter as imagens ideais, podemos utilizar efetivamente as ferramentas quantitativas integradas do software para contar as inúmeras células mencionadas (Figura 1). Mas para a diversidade morfológica do SNF, precisamos contar com softwares analíticos para ajudar na quantificação11,12.

A CIVV é indispensável para a avaliação em tempo real das camadas da córnea, fibras nervosas e células inflamatórias/imunes nos tecidos da superfície ocular. Para avaliar CGCs, a citologia de impressão serve como um método alternativo. Essa técnica tem como alvo a conjuntiva do fórnix, onde a densidade de células caliciformes atinge o pico, produzindo valores tipicamente superiores às medidas da CIVM13,14. No entanto, os resultados estão sujeitos à variabilidade de coloração e à experiência do operador, enquanto o protocolo demorado limita a implementação clínica de rotina. A obstrução do orifício da glândula meibomiana é diretamente observável por meio de microscopia com lâmpada de fenda, mas esse método não pode detectar bloqueios induzidos por Demodex brevis, que o IVCM identifica com precisão. Para o diagnóstico de infestação por Demodex, a depilação de cílios com exame de microscopia óptica fornece um método de baixo custo. Embora tecnicamente simples, essa abordagem traz limitações significativas: o desconforto do paciente restringe a amostragem múltipla, os ácaros que residem profundamente nos folículos dos cílios ou nos orifícios das glândulas meibomianas permanecem indetectáveis15. Em contraste, a CIVV permite o exame abrangente de vários locais da margem da pálpebra, incluindo folículos dos cílios e orifícios da glândula meibomiana, com desconforto mínimo para o paciente. Essa abordagem atinge taxas de positividade diagnóstica substancialmente mais altas por meio da visualização in vivo em tempo real de parasitas em seus microhabitats16,17.

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Protocolo

O procedimento de exame foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hankou Aier Eye Hospital e o consentimento informado foi obtido de todos os pacientes.

NOTA: Os critérios de inclusão para seleção de pacientes incluem pacientes com queixas de olhos secos e coceira e indivíduos que procuram exames oftalmológicos de rotina. Os critérios de exclusão para seleção de pacientes incluem pacientes com perfuração da córnea ou perfuração iminente da córnea, aqueles alérgicos a anestésicos oculares tópicos, indivíduos muito jovens (por exemplo, com menos de 3 anos de idade) ou muito velhos para cooperar, pacientes com fissuras palpebrais estreitas incapazes de acomodar um espéculo palpebral, mulheres grávidas e indivíduos incapazes de cooperar por outros motivos. Um breve diagrama de fluxo de trabalho pode ser encontrado na Figura 2. E as etapas detalhadas da operação são as seguintes.

1. Pré-exame

  1. Preparo dos materiais: aparelho de MCIV, touca de contato corneano, anestésico tópico oftálmico, agente de acoplamento, cotonetes medicinais, espéculo palpebral, bolas de álcool, reservatório de álcool, colírio anti-inflamatório (Figura 3).
  2. Compreender os principais componentes do equipamento IVCM (Heidelberg Retinal Tomography Rostock Cornea Module (HRT-RCM)), botão de focagem, câmera de monitoramento, luz de orientação do olhar, apoio de queixo, apoio de testa, botão para alternar entre os olhos esquerdo/direito, botões giratórios para mover HRT-RCM triaxialmente, botão de captura de imagem e pedal, computador com software IVCM dedicado) e preparar o dispositivo IVCM com gel de acoplamento.
  3. Preparação do examinador: Use máscara e desinfete as mãos com gel à base de álcool ou use luvas descartáveis.
  4. Desinfecção do dispositivo: Limpe os apoios da testa e do queixo do equipamento com compressas embebidas em álcool.
  5. Explicação do procedimento: Explique brevemente ao paciente que o exame é indolor para aliviar a ansiedade.

2. Durante o exame

  1. Verifique e crie um novo registro do paciente com o software que o acompanha no computador.
  2. Administre anestésico tópico: Administre duas gotas no fórnice inferior em um intervalo de 3 minutos antes do procedimento.
  3. Prepare o módulo de córnea rostock (RCM) do dispositivo IVCM: Cubra a área emissora de laser do RCM com gel de acoplamento (certifique-se de que não haja bolhas de ar) (Figura 4 e Figura 5), e apenas uma quantidade suficiente de agente de acoplamento (geralmente uma ou duas gotas, não muito) pode garantir contato total com a tampa de contato da córnea e, finalmente, alcançar a interface de zeragem ideal. Coloque uma tampa de contato da córnea descartável.
  4. Posicione o dispositivo: Retraia totalmente o RCM. Prenda o apoio da testa horizontalmente. Ajuste a câmera de monitoramento para o lado temporal do assunto. Encontre a posição do ponto de paragem da câmara, que é perpendicular ao eixo óptico do RCM.
  5. Calibrar foco: Gire o botão de foco até que o software exiba uma fácula branca maximizada com o valor de qualidade de imagem exatamente 100. Redefina o valor da profundidade para zero (zeragem).
  6. Selecionar modo de digitalização: Padrão para Modo de seção , a menos que especificado de outra forma. Para observar a atividade dos ácaros Demodex, o Modo de Sequência pode ser usado para gravação contínua de imagens dinâmicas.
  7. Posicione os pacientes: Descanse o queixo firmemente no apoio do queixo. Pressione a testa contra o descanso da testa. Ajuste a mesa de exame e o apoio de queixo à altura do paciente.
  8. Insira o espéculo palpebral: Peça ao paciente para olhar para baixo enquanto usa um cotonete para levantar a pálpebra superior para colocação e peça ao paciente para olhar para cima enquanto puxa suavemente a pálpebra inferior para baixo com um cotonete para colocação.
  9. Instruções finais: Reconfirme o posicionamento adequado da cabeça. Lembre o paciente de permanecer relaxado e evitar movimentos. Relate qualquer desconforto imediatamente.
  10. Protocolo de exame da córnea
    1. Comece com o alinhamento macroscópico: Ajuste visualmente o RCM para se aproximar do ápice da córnea (Figura 6). Mude para a câmera de monitoramento do dispositivo para ajuste fino à medida que o RCM se aproxima da córnea. Oriente o paciente a girar o olhar para as córneas lesionais, centralizando a lesão sob o MCR. Mantenha contato suave para evitar danos à córnea.
    2. Técnica chave: A tampa de contato da córnea tem um tamanho físico grande, mas uma zona óptica extremamente pequena (limitada à área central emissora de laser). Requisito crítico: Obtenha contato de alta precisão entre a tampa e o tecido alvo, pois a má adesão causa artefatos de imagem (por exemplo, bolhas, interferência de óleo ou perda completa de sinal).
      NOTA: Para imagens contínuas, pressione o pedal para varredura prolongada para capturar imagens de profundidade sequencial e evitar a perda de dados críticos.
  11. Avaliação da córnea em camadas: Varredura das camadas superficiais para as profundas nesta ordem: CEC, SNF, células inflamatórias subepiteliais.
    1. Concentre-se no verticilo inferior, que é o ponto de referência recomendado, e nas regiões superior/inferior adjacentes18.
  12. Exame da conjuntiva nasal
    1. Redefina o plano focal para o valor de profundidade zero. Aplique gel de acoplamento na tampa. Instrua o paciente a olhar temporal ou inferotemporalmente. Avance o RCM suavemente na superfície conjuntival. Manobras simultâneas: Ajuste a posição do RCM para um campo de visão ideal com a mão direita. Gire o botão de foco para identificar as células caliciformes na camada conjuntival mais externa com a mão esquerda.
  13. Remoção do espéculo palpebral: Instrua o paciente a olhar para baixo e use um cotonete para levantar a pálpebra superior para remoção. E instrua o paciente a olhar para cima e pressionar suavemente a pálpebra inferior com um cotonete para remoção.
  14. Reinicialização do dispositivo: Solte e eleve o apoio da testa. Zere o botão de foco. Reaplique o gel de acoplamento na superfície RCM.
  15. Avaliação da glândula meibomiana e dos folículos das pestanas
    1. Posicionamento do paciente: Instrua o olhar para baixo. Manobra do examinador: Eleve suavemente e pressione a pele da pálpebra superior para dentro para alinhar a margem da pálpebra paralela ao plano da capa córnea. Mova o RCM horizontalmente para visualizar mais imagens do mesmo tipo de estrutura; mova o RCM verticalmente (de baixo para cima) para alternar do exame dos orifícios da glândula meibomiana para os ácinos da glândula e depois para as raízes dos cílios.
      NOTA: Os iniciantes podem evert a pálpebra para melhor exposição ao examinar os orifícios da glândula meibomiana. Sugerimos a localização da inspeção no 1/3 central da pálpebra superior para esta parte.
    2. Padrões quantitativos (protocolo institucional): Avalie 8 folículos consecutivos com ácinosadjacentes 15 e examine 4-8 orifícios sequenciais da glândula. Calibração de profundidade: Para adquirir imagens nítidas dos folículos, concentre-se até que os ácaros Demodex mostrem bordas nítidas (se presentes). Para adquirir imagens nítidas de ácinis, o valor recomendado é de cerca de 30-50 μm de profundidade. E para orifícios, é de cerca de 30 μm (ajuste para visibilidade do Demodex brevis se infestado) 19 .

3. Pós-exame

  1. Cuidados pós-procedimento: Realize a higiene das mãos e desinfete bem as mãos. Limpe suavemente o gel de acoplamento residual, rasgos ou detritos da superfície ocular usando um cotonete. Administre colírios antibióticos para prevenir infecções.
  2. Instruções do paciente: Aconselhe o paciente a evitar esfregar os olhos no dia do exame.
  3. Relatórios: Analise todas as imagens adquiridas de forma abrangente e gere um relatório de diagnóstico. Requisitos de relatório: Inclua pelo menos uma imagem por estrutura de tecido, adicionando mais para achados anormais conforme necessário. Todas as imagens selecionadas devem ser organizadas por sequência de exame e valor de profundidade, seguidos de descrições e medições precisas.
  4. Instruções de descarte de resíduos: Para materiais descartáveis (tampas de contato, cotonetes, recipientes anestésicos), jogue-os na lixeira para posterior descarte profissional.

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Resultados

Todas as imagens microscópicas do IVCM foram adquiridas com resolução de 384 pixels × 384 pixels, campo de observação de 400 μm × 400 μm. Quando devidamente "zerado", este exame exibirá apenas três resultados possíveis no quadro de imagem: i) Nenhuma imagem (experimento malsucedido): A zona óptica central não fez contato com o tecido alvo. ii) Apenas uma imagem parcial (Figura 7) ou outras situações anormais (Figura 8) (experime...

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Discussão

Uma pesquisa bibliográfica no PubMed usando as palavras-chave "in vivo confocal microscopy" e "dry eye disease" (recuperada em junho de 2025) rendeu > 300 publicações. Notavelmente, as taxas anuais de publicação se estabilizaram em aproximadamente 40 artigos por ano desde 2021. Aplicações mais amplas da MCIV em distúrbios da superfície ocular geraram > de 2.000 estudos nas últimas duas décadas (2004-2024). Clinicamente, a CIVV revolucionou a avaliação das patologias da superfíci...

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

Os autores agradecem a Lina Jin, do Hankou Aier Eye Hospital, e a Min Chen, do Departamento de Oftalmologia do Wuhan Asia Heart Hospital, por ajudarem com algumas fotos, e a todos os participantes e funcionários que trabalham para o procedimento operacional. Esta pesquisa foi apoiada por uma bolsa de Projetos de Pesquisa Científica da Comissão Municipal de Saúde de Wuhan (WX23A20).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Bolinhas de algodão absorventesJIAN QI, Chinahttp://www.hnjianqi.comPara fazer bolas de álcool, pequenas
Gel à base de álcoolLi Kang, Xangai, China31107904Gel antisséptico para mãos sem enxágue, 500ml
Colírios CarbomerVidisic, Alemanha8187195Gel oftálmico estéril para agente de acoplamento, 10g
Tampa de contato corneal (TomoCap)Heidelberg, Alemanha18829Meio óptico e córnea em contato asséptico
Espéculo da pálpebraAsicon, China6102APor abrir os olhos
Software Heidelberg Eye ExplorerHeidelberg, AlemanhaVersão 1.5.2.0O software que vem com o dispositivo IVCM
Dispositivo IVCMHeidelberg, AlemanhaHRT-?,08398O principal equipamento do exame
Cotonetes médicosEsound Med, Chinawww.e-soundmed.comPara limpar os olhos dos pacientes e auxiliar na abertura dos olhos, 10cm
75% Álcool medicinalHUICHANG, Chinawww.huichang888.cnPara fazer bolas de álcool, 75% e maismn; 5% 500ml
Colírios de oxibuprocaína cloridrato 0,4%Santen, Japãohttp://www.santen.co.jpAnestésico tópico oftalmológico, 0,4% (0,5ml: 2mg)
Colírios com TobramicinaTOBREX, Bélgica8453824Colírios anti-inflamatórios, 0,3% (5ml: 15mg)

Referências

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  26. Kryszan, K., et al. Artificial-intelligence-enhanced analysis of in vivo confocal microscopy in corneal diseases: a review. Diagnostics. 14, 694(2024).

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