Artigo de método

Preparação e Processamento de Artérias Calcificadas com Morfologia e RNA Preservados para Perfil Espacial Digital

DOI:

10.3791/69159

⸱

23 de janeiro de 2026

 ,  ,  , 
1Division of Vascular Surgery, Department of Surgery, University of Washington, 2Department of Laboratory Medicine and Pathology, University of Washington, 3Division of Vascular Surgery, VA Puget Sound Health Care System

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esse protocolo inclui um fluxo de trabalho passo a passo para amostras vasculares calcificadas: manuseio de tecidos, descalcificação, validação de RNA, detecção de níveis de calcificação e estratégias de seleção por região de interesse no Nanostring GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP). O objetivo é apresentar um método abrangente para preservar a morfologia do tecido vascular e o RNA para análise transcriptômica espacial confiável.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A transcriptômica espacial mapeia perfis de transcriptoma inteiro diretamente em seções de tecido, correlacionando-se entre vizinhanças celulares e expressão gênica e como essas atividades impulsionam a saúde e a doença. Embora a abordagem tenha transformado a oncologia, a neurociência, a imunologia, as ciências do desenvolvimento e muitos campos, ela tem sido menos amplamente utilizada na biologia vascular, embora a doença vascular continue sendo uma das principais causas de morte no mundo todo. Dois obstáculos se destacam: artérias e veias oferecem pouca superfície plana para corte, e amostras doentes, frequentemente ateroscleróticas, trombosadas, carregadas de placas ou calcificadas, exigem tratamentos rigorosos, como descalcificação, que colocam em risco a morfologia e a integridade do RNA. No entanto, esses mesmos vasos, com suas íntimas concêntricas, meios e estruturas em camadas adventícias, são ideais para análise espacial porque cada camada abriga tipos celulares distintos e programas gênicos que interagem através da parede.

Poucos protocolos detalhados abordam como preparar tecidos vasculares para transcriptômica espacial. Essa escassez limita a capacidade dos pesquisadores de explorar todo o potencial da técnica. Para preencher essa lacuna, apresentamos um fluxo de trabalho passo a passo otimizado para artérias tibiais humanas com lesões avançadas. O protocolo cobre o manuseio dos tecidos, fixação e descalcificação adequada que preservam a estrutura e a qualidade do RNA, seguidos por coloração histológica até a gravidade da calcificação. Também descrevemos a construção de microarranjos de tecidos (TMA) para conter os efeitos em lote e estratégias de seleção da região de interesse (ROI) no NanoString GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP).

Ao reduzir barreiras técnicas, esse protocolo permite que pesquisadores vasculares gerem dados espaciais transcriptômicos confiáveis e estudem atividades transcricionais específicas de camadas em vasos saudáveis e doentes. Prevemos que isso acelerará a descoberta dos mecanismos subjacentes à calcificação, inflamação, aterosclerose íntima e outras patologias vasculares, além de promover uma adoção mais ampla da transcriptômica espacial na biologia vascular.

Introdução

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Na última década, o sequenciamento de próxima geração e a imagem de alta resolução convergiram para avançar a transcriptômica espacial, um método de quantificação do transcriptoma inteiro, preservando a localização precisa de cada transcrito nas seções 1,2 do tecido. Quando combinadas com o campo de sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq), que amadurece rapidamente, as abordagens espaciais fornecem uma rota eficiente para ligar assinaturas gênicas com tipos celulares, estados e nichos específicos dentro de um tecido ou órgão, enriquecendo muito nossa compreensão dos mecanismos dadoença 3,4,5,6,7 . Múltiplas plataformas comerciais estão sendo desenvolvidas, como 10X Visium, NanoString GeoMx e CosMx, Slide-seq e DBiT-seq, cada uma suportada por protocolos otimizados para tecidos moles e altamente celulares, como tumores e tecido cerebral. O setor está passando por um crescimento explosivo, com o PubMed indexando aproximadamente 150 publicações em 2023, quase 300 em 2024 e a caminho de ultrapassar 500 em 2025. Apesar desse aumento, a biologia vascular continua sub-representada em comparação com câncer, neurociência e imunologia.

Tecidos duros ou mineralizados, como ossos, cartilagem, dentes e artérias ou veias calcificadas e carregadas de placa, têm se mostrado muito menos amenas. Os obstáculos técnicos são multifacetados. Primeiro, os tecidos com matrizes minerais densas exigem quelação ou remoção baseada em ácido, tratamentos agressivos que podem fragmentar o RNA e distorcer a morfologia tecidual. Segundo, tecidos doentes, lesados ou fibróticos, frequentemente contêm poucas células vivas embutidas em uma matriz extracelular abundante (MEC), reduzindo o rendimento de transcritos e complicando a normalização dos dados. Além disso, os tecidos vasculares possuem uma arquitetura fina e concêntrica (íntima, média, adventícia) envolta em torno de um lúmen oco. A espessura limitada da parede, especialmente a íntima de camada única de célula, significa que as áreas de captura podem conter tecidos escassos, e seções podem rasgar ou se desprender durante etapas de coloração e hibridização de várias horas. Como resultado, estudos transcriptômicos espaciais de tecido vascular continuam escassos, mesmo que doenças cardiovasculares estejam consistentemente entre as principais causas de morte e morbidade grave no mundo. Artigos de protocolo que existem enfatizam predominantemente o processamento de dados, visualização ou plataformas além do NanoStringGeoMx 8,9,10,11,12,13. Entre esses artigos, poucos descrevem métodos de laboratório para processar artérias tibiais doentes, um vaso clinicamente relevante na doença arterial periférica (DAP), especialmente para pacientes diabéticos que representam uma proporção crescente da população afetada.

Para suprir essa lacuna, apresentamos um fluxo de trabalho abrangente para artérias tibiais humanas calcificadas obtidas de pacientes com DAP que passaram por amputação. O protocolo abrange: (1) apara e dissecação de tecidos imediatamente após a coleta na sala de cirurgia; (2) fixação adequada dos tecidos e descalcificação que mantenham a integridade da morfologia e do RNA dos tecidos; (3) construção de microarranjos de tecidos (TMAs) que economizam custos para minimizar os efeitos em lote; (4) hibridização in situ por RNAscópio e coloração histológica de cálcio para controle de qualidade; e (5) Estratégia de seleção da região de interesse (ROI) especificamente projetada para artérias tibiais calcificadas na plataforma GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP). Essas etapas incluem todos os procedimentos anteriores à coleta de amostras no instrumento DSP, preparação da biblioteca, sequenciamento e análise de dados.

Embora demonstrados na plataforma DSP referenciada, os princípios podem orientar a preparação dos tecidos para 10X Visium ou outras plataformas, e a metodologia é facilmente adaptável a leitos vasculares adicionais ou modelos animais. Esse protocolo pode ser adaptado para tecidos de biobanco e pós-autópsia, mas seu sucesso depende criticamente das condições de preservação, fixação e armazenamento do tecido. Os tecidos devem ser corrigidos imediatamente após a colheita para minimizar o tempo isquêmico (idealmente dentro de 1 hora). Formalina padrão 10% com tampão neutro (NBF) é recomendada por pelo menos 16 horas em temperatura ambiente (RT). Os tecidos devem ser incorporados imediatamente após a fixação e não devem ser armazenados no etanol por mais de 3 dias. Blocos de parafina fixada em formol (FFPE) processados e armazenados sob condições recomendadas permanecem adequados para perfilamento espacial por aproximadamente 3 anos, embora a qualidade do RNA diminua com a idade do bloco. Assim, recomenda-se a avaliação da qualidade do RNA para amostras de baixa celularidade, blocos armazenados ao longo de 6 meses, amostras de biobanco e tecidos post-mortem. A qualidade mínima aceitável do RNA depende do ensaio selecionado, da seleção do ROI, da resolução desejada e das recomendações da instalação central. Na prática, aproximadamente 50-100 núcleos por segmento são comumente recomendados para resultados robustos. A plataforma DSP suporta tanto FFPE quanto tecidos congelados frescos. Neste protocolo, focamos nos tecidos FFPE.

Embora este estudo foque em transcriptômica espacial, ela é facilmente integrada ao scRNA-seq. Usando conjuntos de dados publicados de scRNA-seq e deconvolução espacial computacional, proporções de tipos celulares podem ser estimadas para cada ponto espacial, e estados celulares definidos por scRNA-seq podem ser projetados na arquitetura tecidual. Ao manter tanto a estrutura quanto a integridade do RNA, nosso protocolo possibilita validação posterior de célula única ou molécula única, maximizando o conhecimento biológico de espasmes vasculares valiosos e a adoção mais ampla da transcriptômica espacial na pesquisa em biologia vascular.

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Protocolo

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Todos os procedimentos para coleta de amostras arteriais humanas foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB) da Divisão de Assuntos Humanos da Universidade de Washington e pelo IRB do Sistema de Saúde VA Puget Sound (Seattle, WA). Consentimentos escritos e informados foram obtidos dos pacientes antes da coleta de tecido. Os materiais e equipamentos utilizados para este estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Corte e fixação de tecidos

  1. Apara de tecido
    1. Prepare a bolsa de transporte usando embalagens multicamadas, contendo um tubo interno, um recipiente secundário, um recipiente externo de transporte e uma bolsa para amostra de risco biológico. Encha o tubo interno da centrífuga de 50 mL com 30 mL de meio de armazenamento do Meio Modificado de Águia (DMEM) de Dulbecco, contendo 1% de ácido 4-[2-hidroxietil]-1-piperazina-ácido etanosulfônico (HEPES) e 1% de penicilina-estreptomicina (P/S).
    2. Coloque separadamente as artérias tibial anterior (AT), posterior tibial (PT) e peroneal tibial (PR) (idealmente > 5 cm de comprimento) separadamente nos tubos centrífugos de 50 mL. Transfira os recipientes para gelo da sala de cirurgia para a sala de cultura de tecidos.
      NOTA: Recomenda-se que o comprimento da amostra colhida tenha pelo menos 5 cm para permitir réplicas e tecido suficiente para crioarmazenar para outras avaliações ou validações.
    3. Transfira cada artéria para uma placa de Petri de 100 mm com o meio. Remova o excesso de tecidos conjuntivos perivasculares usando tesoura e pinças estéreis, deixando apenas a parede arterial (adventícia para dentro).
      NOTA: Manuseie e apare os tecidos em um armário de biossegurança limpo com uma solução de inativação de RNase para evitar contaminação por RNA. Use bisturi e pinças estéreis; Entre as amostras, enxágue-as em água estéril e sem nuclease para remover resíduos e limpe cuidadosamente com etanol 70%.
    4. Enxágue brevemente a artéria aparada com o Fosfato Tamponado (PBS) da Dulbecco em uma nova placa de Petri. Coloque uma tábua de corte estéril dentro de um recipiente novo e mova a artéria sobre ela.
    5. Corte a artéria transversalmente em segmentos de 1 cm com uma lâmina cirúrgica.
  2. Fixação e armazenamento de tecidos
    1. Congele rapidamente dois segmentos em criotubos para criopreservação em nitrogênio líquido (LN2) e armazene-os para futuros trabalhos com proteínas/RNA.
    2. Coloque os segmentos restantes em tubos de 15 mL contendo 10% de NBF e fixe a 4 °C por 24-48 horas para segmentos arteriais de 1 cm.
      NOTA: Recomenda-se o uso de 10% de NBF. Se estiver usando paraformaldeído (PFA) a 4%, prepare-o frescamente ou verifique um pH neutro antes do uso para minimizar danos ao RNA.

2. Descalcificação, processamento de tecidos e seccionamento

  1. Prepare a solução de descalcificação: dissolva ácido sólido etileno-diamina-tetraacético (EDTA) a 10% (p/v) em solução estabilizadora de RNA (RSS). Filtração não é obrigatória. Ajuste o pH para 9,2 com pellets de hidróxido de sódio (NaOH) para dissolver completamente o EDTA, depois diminua para 5,2 com 10 M HCl, que é o pH típico de trabalho do RSS e ajuda a preservar a integridade do RNA.
  2. Enxágue rapidamente os lenços fixos no PBS manualmente. Transfira cada amostra para um tubo de 15 mL contendo a solução de descalcificação e agite a 4 °C por 72 horas.
  3. Quando a descalcificação estiver concluída, lave as amostras em PBS (2 × 5 min). Coloque os tecidos em e carregue-os em um processador de tecidos usando um programa de processamento de 4 horas.
  4. Insera múltiplos segmentos de artéria por bloqueio de tecido. Marque a área de tecido restrita nas costas do slide e verifique se todas as seções estão dentro dessa área.
  5. Corte o excesso de parafina. Divida os blocos a 5 μm com um microtomo e lâminas de perfil baixo, e monte as seções de tecido dentro da área marcada da lâmina.
    NOTA: Descarte as primeiras seções após encarar e colete as seções de tecido subsequentes. Use pincéis sem RNase e limpe o banho-maria entre os lotes de amostras.
  6. Prepare pelo menos quatro seções seriadas por bloco para diferentes colorações e para o experimento de perfil espacial digital (DSP). Armazene as lâminas a 4 °C até o uso (idealmente < 6 meses).

3. RNAscope Hibridização in situ (ISH) e coloração histológica

  1. RNAscope ISH
    1. Assar as lâminas em forno seco a 60 °C durante a noite para melhorar a adesão dos tecidos às lâminas.
    2. Deparafinização: Imergir lâminas em xileno (3 × 5 min), seguida por 100% de etanol (2 × 3 min). Desliza a seco a 60 °C por 7 minutos.
    3. Realize o ensaio RNAscope 2.5 HD Red ISH de acordo com o protocolo do fabricante. Bloqueie a peroxidase endógena com 3% deH2O2 por 10 minutos em RT; Enxágue em água destilada (DI).
    4. Incube as lâminas em tampão de recuperação pré-aquecido a 100 °C (diluído 1:10 em água DI) por 15 minutos (use 200 mL de tampão de recuperação para um suporte de até 24 lâminas em um vaporizador), mergulhe em etanol 100% 5 vezes e sece as lâminas a 60 °C por 7 minutos. Crie uma barreira hidrofóbica para soluções ao redor do tecido usando uma caneta PAP com barreira hidrofóbica.
    5. Coloque as lâminas em uma grade de forno de hibridização, adicione 200 μL de suplemento enzimático digestivo (pré-diluído pelo fornecedor em frascos conta-gotas) a cada lâmina e incube a 40 °C por 15 minutos. Enxágue os slides duas vezes em água DI.
    6. Aplique a sonda controle positiva Human Ppib nas lâminas e incube por 2 horas a 40 °C. Lave os slides duas vezes no buffer de lavagem.
    7. Realize amplificação sequencial: AMP1 a 40 °C por 30 minutos; AMP2 a 40 °C por 15 minutos; AMP3 a 40 °C por 30 minutos; AMP4 a 40 °C por 15 minutos; AMP5 no RT por 30 minutos; e AMP6 em RT por 15 minutos. Lave por 2 x 2 minutos entre cada um.
    8. Adicione a solução Fast Red funcionando, incube em RT por 10 minutos. Drene, submerga os slides em água DI, depois mergulhe 5 vezes em água doce DI. Confirme que os pontos de controle positivo do Ppib aparecem como pontos vermelhos discretos e pontuados.
    9. Contra-colorir com 1 hematoxilina de Gill, mergulhar 5 vezes em 2 mudanças de água DI, azul em 0,02% hidróxido de amônio e mergulhar 5 vezes em 2 trocas de água DI. Confirme que os núcleos se colorem de azul e que a morfologia do tecido está preservada. Deixe os slides secarem durante a noite e faça o coverslip com o meio de montagem.
  2. Coloração S com Alizarin Red
    1. Para seções seriais adicionais, repita a deparafinização e reidratação nos Passos 3.1.2.
    2. Confirme que o pH da solução de trabalho Alizarina Vermelho S está entre 4,1 e 4,3.
    3. Imerga as lâminas em Alizarin Red S por 30-60 s, ou até que os depósitos de cálcio desenvolvam uma cor alaranjada-avermelhada.
    4. Sacuda o tingimento excessivo. Desidrate com 20 mergulhos rápidos em acetona 100%, depois 20 mergulhos em acetona:xileno (1:1).
    5. Limpe os escorregadores em dois banhos frescos de xileno, 3 minutos cada. Slip de cobertura com meio de montagem.

4. Preparação de slides GeoMx DSP e seleção de ROI

  1. Antes de começar, limpe todos os equipamentos e recipientes com solução inativante de RNAse e seque ou enxágue com água tratada com DEPC para evitar contaminação por RNA. Siga as instruções para o ensaio de perfil espacial de RNA.
  2. Assar as lâminas em forno seco a 60 °C durante a noite para melhorar a adesão dos tecidos às lâminas.
  3. Deparafinização e reidratação: Submerga as lâminas em xileno (3 × 5 min), seguida de 100% de etanol (2 × 5 min) e 95% de etanol diluído em água tratada com DEPC por 5 minutos. Transfira os slides para 1× PBS por 1 minuto.
  4. Incube as lâminas em tampão de recuperação de antígeno Tris/EDTA pré-aquecido, pH 9,0 de 100 °C, por 20 minutos e transfira as lâminas para 1× PBS por 5 minutos em RT.
  5. Incube as lâminas em 1,0 μg/ml de Proteinase K pré-aquecida por 15 minutos e enxágue em 1× PBS por 5 minutos em tempo de descanso.
  6. Coloque as lâminas em 10% de NBF (200 μL por lâmina) por 5 minutos em tempo de descanso, e lave em PBS por 5 minutos.
  7. Remova as lâminas do PBS, toque em um papel toalha, limpe o excesso de líquido ao redor do lenço com um Kimwipe e coloque no suporte de tingimento de hibridização.
  8. Adicione 200 μL de solução de hibridização (diluída 1:10 em Buffer W) a cada lâmina e aplique um deslizamento de hibridização. Feche a câmara de hibridização, insira-a no forno e incube a 37 °C durante a noite.
  9. O mergulho desliza em um tampão de soro fisiológico-citrato de sódio (SSC, 2×) e permite que a hibridização escorregue sozinha em até 5 minutos.
  10. Lave as lâminas com um tampão de lavagem rigoroso composto por partes iguais de 4× SSC e formamida deionizada a 37 °C, 25 minutos por lavagem. Lave os slides em 2× SSC buffer, 2 min por lavagem.
  11. Bloqueie os slides com o Buffer W no RT por 30 minutos.
  12. Cubra o tecido com solução primária de anticorpos (Rabbit anti-CD45) por 1 h na caixa de lâminas da câmara de umidade na RT, lave com 2× SSC buffer 3 vezes.
  13. Aplique solução secundária de anticorpos (anti-Coelho de Cabra IgG-AF647) por 1 hora e lave em 2× tampão de SSC.
  14. Cubra o tecido com anticorpo marcado (Mouse anti-SMA-AF488) por 1 hora na caixa de lâminas da câmara de umidade no RT. Lave em 2× buffer SSC.
  15. Tinga as lâminas por 10 minutos em marcador nuclear Syto83 de 2 μM diluído no tampão W por 10 minutos.
  16. Escaneie as lâminas com um instrumento de perfil de RNA para visualizar a coloração morfológica dos marcadores. Selecione as ROIs proximal e distal a calcificadas de cada tecido arterial, anotando a localização específica de cada ROI por camada.
    NOTA: Tenha cuidado para evitar a formação de bolhas de ar ao aplicar o engobe de hibridização nas seções de tecido.

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Resultados

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O protocolo aqui descrito orienta os pesquisadores desde o recebimento de artérias tibiais até a geração de lâminas de TMA que mantêm tanto a morfologia quanto a integridade do RNA para análise de transcriptômica espacial. Também detalha métodos histológicos para visualizar depósitos de cálcio nas artérias, coloração morfológica de marcadores e estratégias de seleção do ROI.

Na Figura 1, as artérias estão fixas em 10% de NBF (pass...

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Discussão

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Esse protocolo detalha as etapas necessárias para preparar artérias tibiais humanas calcificadas para o perfil transcriptômico espacial no NanoString GeoMx DSP. As artérias tibiais, como todos os vasos, possuem camadas concêntricas íntimas, médias e adventícias, cada uma abrigando populações celulares distintas que orquestram lesão e reparo. Manter a arquitetura dessas camadas é essencial para análises transcriptômicas resolvidas por camadas, mas várias etapas preparatórias frequentement...

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esse trabalho foi apoiado por uma bolsa inicial do VA Puget Sound, pelo prêmio VA Merit I01 BX004975-02, além de recursos e uso das instalações do VA Puget Sound Health Care Center.  O trabalho é dos autores e não reflete necessariamente a posição ou política do Departamento de Assuntos de Veteranos ou do governo dos Estados Unidos.  Gostaríamos de reconhecer o serviço de imagem prestado pelo Núcleo de Histologia e Imagem (HIC) da Universidade de Washington.  Gostaríamos de agradecer ao Dr. Shreeram Akilesh por sua orientação sobre experimentos de DSP na Universidade de Washington e seu grupo nos Laboratórios MANTIS: UW Spatial Biology Core.  Também gostaríamos de reconhecer Nishi Ivanov, do Centro de Pesquisa de Diabetes da Universidade de Washington, pela coloração histológica.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Médio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM), glicose alta, piruvato e nbsp;Thermo Fisher Scientific11995065
Solução tampão de ácido tampão 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina, etanolsulfônico (HEPES), 1 MThermo Fisher Scientific15630080
Penicilina-Estreptomicina (P/S), 10.000 U/mLThermo Fisher Scientific15140122
Formalina Tamponada Neutra 10% (NBF)Millipore Sigma65346-M
Etileno-diamina-ácido tetraacético (EDTA)Millipore Sigma3620
Solução de estabilização de RNAlaterThermo Fisher ScientificAM7024Solução de estabilização de RNA (RSS)
Peróxido de hidrogênio (H2O2)Advanced Cell Diagnostics, Inc322335
Solução de recuperação de alvosAdvanced Cell Diagnostics, Inc322001
Protease PlusAdvanced Cell Diagnostics, Inc322331Suplemento enzimático digestivo
DapB (controle negativo)Advanced Cell Diagnostics, Inc310043
Buffer de lavagem RNAscope (kit de ensaio RNAscope 2.5 HD Red ISH)Advanced Cell Diagnostics, Inc320058
AMP1Advanced Cell Diagnostics, Inc324511
AMP2Advanced Cell Diagnostics, Inc324512
AMP3Advanced Cell Diagnostics, Inc324513
AMP4Advanced Cell Diagnostics, Inc324514
AMP5 RedAdvanced Cell Diagnostics, Inc324515
AMP6 RedAdvanced Cell Diagnostics, Inc324516
Fast Red AAdvanced Cell Diagnostics, Inc324517
Ppib HumanoAdvanced Cell Diagnostics, Inc313901
Gill' s hematoxilinaMillipore SigmaGHS132
Coleta de antígeno, Tris/EDTA pH 9Thermo Fisher Scientific00-4956-58
Proteinase KThermo Fisher ScientificAM2546
Solução de hibridização - Hs WTANanostring121401102
HybrislipDeslizamento de hibridização
Solução de hibridização - Buffer RNanostring121300313
Rabbit anti-CD45 Sinalização de Celular1317
Buffer WNanostring121300313
Anti-Coelho de Cabra IgG-AF647Jackson Immunoresearch111-605-144
Mouse anti-SMA-AF488 Thermo Fisher Scientific53-9760
Syto83 Thermo Fisher ScientificS11364
Lâmina cirúrgicaBD em Biociências371110
Superfrost  Além das lâminas de microscópioThermo Fisher Scientific1255015
Caneta ImmEdge
Lâminas de micrótomoThermo Fisher Scientific22-500-125
RNase AWAYSolução inativadora de RNase
Equipamento
Forno de hibridização HybEZ  Advanced Cell Diagnostics, Inc321710
Perfilador Espacial Digital GeoMxNanostring Modelo: GeoMx DSP
Plataforma de acesso a dados: GeoMx DSP Control Center (Versão 3.1.2.12)		Configuração de varredura de canal: para FITC, o tempo de explosão é 300 ms, e o fluoróforo é AlexaFluro 488; para o canal Cy3, o tempo de exposição é de 50 ms, e o fluoróforo é Syto83; e para o canal Cy5, o tempo de exposição é de 300 ms, e o fluoróforo é AlexaFluor 647.

Referências

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