Protocolo de miocina induzida por exercício CLCF1 para investigar os mecanismos de proteção óssea RANKL/OPG na osteoporose pós-menopausa

Resumo

Este artigo apresenta um protocolo abrangente para investigar o fator de citocina semelhante à cardiotrofina 1 (CLCF1) como mediador de proteção óssea induzido pelo exercício por meio da modulação do eixo RANKL/OPG na osteoporose pós-menopausa.

Resumo

Estudos recentes identificaram o fator 1 de citocina semelhante à cardiotrofina (CLCF1) como uma "molécula da juventude" induzida pelo exercício que medeia os benefícios musculoesqueléticos, mas diminui com a idade. Este protocolo descreve uma abordagem sistemática para investigar o papel regulatório do CLCF1 na proteção óssea mediada pelo exercício por meio de mecanismos de crosstalk imunoósseo. A metodologia engloba análise de amostras clínicas, técnicas de caracterização molecular e ensaios funcionais para elucidar a influência do CLCF1 no ativador do receptor do eixo de sinalização do ligante fator nuclear-κB (RANKL)/osteoprotegerina (OPG). Por meio de reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR), western blotting, edição de genes CRISPR/Cas9 e sistemas de co-cultura, este protocolo demonstra as ações duplas de proteção óssea do CLCF1 por meio da inibição de osteoclastos mediada por STAT1 e promoção de osteoblastos mediada por STAT3. Os métodos descritos permitem a avaliação abrangente dos padrões de expressão de CLCF1, análises de correlação com parâmetros de densidade mineral óssea e avaliação mecanicista de possíveis intervenções de tratamento mimético de exercício. Ao contrário das terapias antirreabsortivas tradicionais que visam principalmente os osteoclastos, as intervenções baseadas em CLCF1 podem oferecer a vantagem única de promover simultaneamente a formação óssea enquanto inibem a reabsorção. Este protocolo fornece aos pesquisadores procedimentos padronizados para investigar a regulação mediada por citocinas induzida pelo exercício do metabolismo ósseo e facilita o desenvolvimento de intervenções terapêuticas direcionadas para distúrbios ósseos relacionados à idade.

Introdução

A osteoporose pós-menopausa (PMOP) representa um exemplo paradigmático de declínio musculoesquelético relacionado à idade, no qual a desregulação do sistema imunológico precipita a perda óssea patológica ^1,2,3. Embora o exercício seja amplamente reconhecido como a intervenção não farmacológica mais eficaz para prevenir a deterioração óssea relacionada à idade, os mecanismos moleculares precisos subjacentes à proteção óssea induzida pelo exercício permaneceram indescritíveis até recentemente⁴. A compreensão contemporânea do metabolismo ósseo evoluiu além das estruturas endocrinológicas tradicionais para abranger interações osteoimunes complexas e miocinas induzidas pelo exercício que governam a homeostase esquelética⁵.

A recente identificação do fator 1 de citocina semelhante à cardiotrofina (CLCF1) como um fator induzido pelo exercício que combate o declínio musculoesquelético relacionado à idade representa uma mudança de paradigma na compreensão da interferência ósseo-muscular⁶. Esta descoberta inovadora explica os efeitos protetores ósseos bem estabelecidos do exercício por meio de um mecanismo molecular anteriormente desconhecido, posicionando o CLCF1 como o principal mediador do osteoanabolismo induzido pelo exercício⁷. Camundongos transgênicos que superexpressam CLCF1 demonstraram maior formação óssea, melhor tolerância à glicose e desempenho físico superior em comparação com controles do tipo selvagem⁶, sugerindo que a suplementação de CLCF1 poderia potencialmente imitar os benefícios do exercício em populações sedentárias ou com mobilidade reduzida.

O tratamento mimético do exercício é definido como intervenções farmacológicas que replicam a cinética da CLCF1 induzida pelo exercício, proporcionando benefícios terapêuticos semelhantes à atividade física por meio de vias moleculares⁸. O fator 1 de citocinas semelhantes à cardiotrofina (CLCF1), alternativamente designado como neurotrofina-1 (NNT-1) ou fator estimulador de células B-3 (BSF-3), pertence à superfamília de citocinas interleucina-6 (IL-6) e exibe funções biológicas pleiotrópicas⁸. Originalmente caracterizado por suas propriedades neurotróficas na sobrevivência e desenvolvimento do neurônio motor espinhal, o papel do CLCF1 como uma miocina induzida pelo exercício emergiu como uma área significativa de investigação. Estudos clínicos recentes validaram o CLCF1 como um biomarcador para o estado de saúde óssea, demonstrando que os níveis de proteína CLCF1 nas células mononucleares do sangue periférico estão significativamente diminuídos em mulheres na pós-menopausa com osteoporose em comparação com controles saudáveis⁹. Esses estudos mostraram correlações positivas entre a expressão de CLCF1 e a densidade mineral óssea em vários locais esqueléticos, fornecendo validação clínica que fortalece o potencial translacional das intervenções terapêuticas direcionadas ao CLCF1.

As citocinas operam por meio de complexos de receptores heteroméricos, incluindo receptores de fator neurotrófico ciliar solúvel (sCNTFR) e fator semelhante ao receptor de citocinas-1 (CRLF-1), para orquestrar diversas respostas celulares^10,11. Estudos mecanísticos recentes elucidaram o paradigma de dupla sinalização pelo qual o CLCF1 inibe simultaneamente a reabsorção óssea e promove a formação óssea 2,6,7,9. Essa dupla ação ocorre por meio da ativação da via do transdutor de sinal diferencial e do ativador da transcrição (STAT): a fosforilação de STAT1 medeia a supressão de osteoclastos, interferindo no ativador do receptor da sinalização do fator nuclear induzido pelo fator nuclear κB (RANKL) induzido pelo fator nuclear κB (NF-κB), enquanto a ativação do STAT3 em osteoblastos promove a expressão de marcadores de formação óssea, incluindo fosfatase alcalina e osteocalcina.

Compreender como as respostas agudas ao exercício se traduzem em adaptações ósseas crônicas continua sendo fundamental para o desenvolvimento terapêutico¹³. Embora a elevação aguda do CLCF1 após sessões de exercício único forneça insights mecanicistas, respostas agudas repetidas ao longo de semanas a meses podem levar a efeitos protetores ósseos sustentados por meio de sinalização cumulativa e adaptações celulares¹⁴.

A justificativa para investigar a CLCF1 na fisiopatologia osteoimune decorre de seu papel estabelecido na regulação de linfócitos B e do reconhecimento de que as células B constituem produtores significativos de RANKL e osteoprotegerina (OPG)^12,13. O ativador do receptor do eixo fator nuclear-ligante κB (RANKL)/osteoprotegerina (OPG) serve como mecanismo regulador central para a diferenciação dos osteoclastos e reabsorção óssea^14,15. Ao contrário de outros membros da família IL-6 que demonstraram controle regulatório sobre a homeostase esquelética por meio da modulação da remodelação óssea, o mecanismo exclusivo de proteção óssea dupla do CLCF1 oferece potencial terapêutico superior 16,17,18.

As vantagens deste protocolo sobre as metodologias existentes incluem sua abordagem abrangente para a investigação osteoimune do exercício, incorporando análise de correlação clínica e estudos celulares mecanicistas para fornecer insights translacionais sobre a regulação do metabolismo ósseo mediada por CLCF1. A relevância clínica deste protocolo é reforçada por evidências emergentes de que os níveis de CLCF1 podem ser modulados por meio de intervenções no estilo de vida, posicionando-o como um alvo terapêutico acionável para distúrbios ósseos relacionados à idade.

Protocolo

Este protocolo foi aprovado pelo comitê institucional de ética em pesquisa (Protocolo #2024-CHSD-0156) e segue os princípios da Declaração de Helsinque. Todos os procedimentos com animais obedeceram às diretrizes do comitê institucional de cuidados e uso de animais (Protocolo #2024-037). Todos os participantes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido.

1. Coleta de amostras clínicas e avaliação da intervenção de exercícios

1. Recrutamento de participantes e avaliação do histórico de exercícios
   1. Recrute mulheres na pós-menopausa com idade entre 55 e 75 anos com duração mínima de 1 ano na pós-menopausa.
   2. Avalie o histórico detalhado de exercícios, incluindo frequência, intensidade, tipo e duração da atividade física nos últimos 6 meses usando questionários padronizados de atividade física.
   3. Categorize os participantes em grupos sedentários (< 150 min/semana), moderadamente ativos (150-300 min/semana) e altamente ativos (> 300 min/semana) com base nas diretrizes de exercícios da OMS.
   4. Realize uma avaliação abrangente do histórico médico e exame físico, incluindo revisão de medicamentos e triagem de comorbidades.
   5. Obtenha medições de absorciometria de raios X de dupla energia (DXA) usando o densitômetro Hologic Discovery A com o software APEX v4.5. Realize a calibração diária com o simulador de coluna. Posicione o paciente em decúbito dorsal com as pernas elevadas em um bloco de posicionamento de acordo com as diretrizes da Sociedade Internacional de Densitometria Clínica (ISCD).
   6. Classifique os participantes de acordo com os critérios de osteoporose da Organização Mundial da Saúde (T-score ≤ -2,5 DP).
   7. Aplicar critérios de exclusão: Terapia antiosteoporótica prévia dentro de 12 meses, tratamentos imunossupressores, doenças ósseas metabólicas, osteoporose secundária ou contraindicações ao teste ergométrico.
2. Avaliação da resposta CLCF1 induzida por exercício
   1. Colete amostras de sangue basais entre 8:00 e 10:00 após 12 h de jejum noturno em tubos de EDTA.
   2. Implementar protocolo padronizado de exercícios agudos: caminhada de intensidade moderada de 45 minutos a 65-70% da frequência cardíaca máxima. Calcule a frequência cardíaca máxima usando a fórmula de Karvonen (220 anos)¹⁹. Realize exercícios em uma esteira motorizada com monitoramento contínuo da frequência cardíaca por meio de um monitor de cinta torácica. Mantenha a velocidade de caminhada em 3.5-4.5 km/h com ajuste de grau para atingir a frequência cardíaca desejada.
   3. Colete amostras de sangue pós-exercício em pontos de tempo de 1 h, 4 h e 24 h para avaliar a cinética de CLCF1, mantendo condições de coleta consistentes.
   4. Armazenar alíquotas de soro a -80 °C para posterior quantificação de CLCF1. Use o kit ELISA CLCF1 humano com uma faixa de detecção de 31,2-2000 pg/mL. Diluir as amostras 1:2 no diluente do ensaio. Prepare uma curva padrão de 7 pontos usando diluições seriais de 2 vezes. Execute amostras em duplicata. Ler placas a 450 nm com correção de comprimento de onda de 540 nm. Aceitar coeficiente de variação (CV) < 20 % entre duplicados.
3. Protocolo de intervenção longitudinal de exercícios
   1. Projete um programa de exercícios progressivos de 12 semanas com três sessões por semana.
   2. Colete amostras de sangue no início do estudo, 4, 8 e 12 semanas para análise da trajetória CLCF1.
   3. Avalie as melhorias no condicionamento físico usando o teste de VO2 máximo na linha de base e no ponto final.
   4. Correlacione as alterações do CLCF1 com as melhorias da DMO medidas pela DXA em 12 semanas.
   5. Documente as adaptações de treinamento, incluindo tolerância ao exercício e padrões de recuperação.

2. Isolamento e processamento aprimorado de células mononucleares do sangue periférico (PBMC)

1. Isolamento PBMC otimizado para análise CLCF1
   1. Colete 20 mL de amostras de sangue venoso em tubos contendo EDTA (5 mL de EDTA por tubo) em condições estéreis.
   2. Processe as amostras dentro de 2 h após a coleta para viabilidade celular ideal e preservação da expressão de CLCF1.
      1. Dilua amostras de sangue 1:1 com solução salina tamponada com fosfato (PBS) em temperatura ambiente. Misture 20 mL de sangue com 20 mL de PBS.
      2. Camada de sangue diluído sobre meio gradiente de densidade em tubos cônicos de 50 mL. Use 15 mL de meio gradiente de densidade por 20 mL de sangue diluído (proporção de 1:1,33).
   3. Centrifugue a 400 × g por 30 min em temperatura ambiente sem freio.
   4. Aspirar cuidadosamente a camada de PBMC na interface plasma-Ficoll utilizando uma pipeta de Pasteur estéril.
   5. Lave as células duas vezes com PBS contendo 2% de soro fetal bovino (FBS) por centrifugação a 300 × g por 10 min.
2. Avaliação da viabilidade celular e medição de linha de base CLCF1
   1. Determinar a viabilidade celular usando o método de exclusão do azul de tripano (alvo > 95% de viabilidade)²⁰.
   2. Avalie a expressão intracelular basal de CLCF1 imediatamente após o isolamento.
   3. Ajuste a concentração celular para 1 × 10⁶ células / mL em meio apropriado.
   4. Aloque células para aplicações a jusante ou armazene nitrogênio líquido. Congele PBMCs em meio de congelamento contendo 90% de FBS + 10% de DMSO. Use um recipiente de congelamento de taxa controlada de -1 °C/min a -80 °C. Armazene alíquotas de 1 mL (5 × 10⁶ células/frasco) em crioviais.

3. Análise quantitativa abrangente da expressão gênica

1. Extração e purificação de RNA com considerações específicas de CLCF1
   1. Lise 1 × 10⁶ PBMCs em 1 mL de reagente de lise de RNA dentro de 1 h de isolamento.
   2. Adicione 200 μL de clorofórmio, vortex vigorosamente e incube por 3 min em temperatura ambiente.
   3. Centrifugue a 12.000 × g por 15 min a 4 °C para obter a separação de fases.
   4. Transfira a fase aquosa para um tubo fresco, adicione um volume igual de isopropanol.
   5. Precipitar o RNA por centrifugação a 12.000 × g durante 10 min a 4 °C.
   6. Lave o pellet de RNA com etanol a 75%, seque ao ar e dissolva em água sem nuclease.
   7. Avalie a integridade do RNA usando eletroforese em gel de agarose ou bioanalisador (alvo RIN >7.0).
2. Transcrição reversa e PCR quantitativa com conjuntos de primers atualizados
   1. Quantifique a concentração de RNA usando análise espectrofotométrica (razão alvo A260 / A280 1,8-2,2).
   2. Realize a transcrição reversa usando 1 μg de RNA total com o kit de reagentes de transcrição reversa.
   3. Prepare reações de qPCR: Prepare reações de 20 μL contendo 10 μL de Master Mix, 0,8 μL de cada primer (estoque de 10 μM, 400 nM final), 2 μL de molde de cDNA (50 ng), 6,4 μL de água livre de nuclease. Execute triplicatas. Use um sistema de PCR em tempo real.
   4. Use sequências de primer validadas:
      1. CLCF1 para a frente: 5'-CCTCCTGCTTCTTGCCTACC-3',
         reverso: 5'-TGCCACCATGTTTGTTTCCT-3'
      2. CRLF1 para a frente: 5'-TGAAGCTCATCCTGCAGTTC-3',
         reverso: 5'-CAGCATCTCCTCCTTGATGC-3'
      3. STAT1 para a frente: 5'-CAGCTTCAGCAGCTTGACTC-3',
         reverso: 5'-AAGGTCAGCGATGTCTTCAG-3'
      4. STAT3 para a frente: 5'-CAGCAGCTTGACACACGGTA-3',
         reverso: 5'-AAACACCAAAGTGGCATGTGA-3'
   5. Execute o protocolo qPCR: 95 °C por 10 min, seguido por 40 ciclos de 95 °C por 15 s e 60 °C por 1 min.
   6. Analisar os resultados usando o método 2^(-ΔΔCt) com normalização β-actina²¹.
3. Análise do painel genético de resposta ao exercício
   1. Inclua genes responsivos ao exercício: IL-6, TNF-α, IL-1β, BDNF, IGF-1 e miostatina.
   2. Use sequências de primer validadas:
      1. IL-6 para frente: 5'-AGCCACTCACCTCTTCAGAAC-3',
         reverso: 5'-GCCTCTTTGCTGCTTTCACAC-3';
      2. TNF-α para a frente: 5'-CCCAGGGACCTCTCTCTCTAATC-3',
         reverso: 5'-ATGGGCTACAGGCTTGTCACT-3';
      3. IL-1β para frente: 5'-ACAGATGAAGTGCTCCTTCCA-3',
         reverso: 5'-GTCGGAGATTCGTAGCTGGAT-3';
      4. BDNF para a frente: 5'-TAACATGGCTGCGCGTGTGT-3',
         reverso: 5'-CGAGTGGGTCACAGCGGCAG-3';
      5. IGF-1 para a frente: 5 ' - GCTCTTCAGTTCGTGTGTGTGGA-3 ',
         reverso: 5'-GCCTCCTTAGATCACAGCTCC-3';
      6. Miostatina para a frente: 5'-AGTGACGGGCTCTTTGGAAGA-3',
         reverso: 5'-GTTTCAGAGGCCGGTCAAGT-3'.
   3. Correlacionar as alterações induzidas pelo exercício no CLCF1 com outros padrões de expressão de miocinas.
   4. Avalie as taxas de co-expressão CLCF1/CRLF1 como indicadores da formação funcional de complexos de citocinas.

4. Análise aprimorada da expressão de proteínas com foco na via STAT

1. Extração e quantificação de proteínas para análise STAT
   1. Lise PBMCs em tampão de lise (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% desoxicolato de sódio, 0,1% SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8,0) suplementado com coquetéis inibidores de protease e fosfatase.
   2. Adicione alguns inibidores específicos da fosfatase: ortovanadato de sódio (1 mM) e fluoreto de sódio (50 mM) imediatamente antes do uso.
   3. Incubar lisados no gelo por 30 min com vórtice periódico em velocidade média a cada 10 min.
   4. Centrifugue a 12.000 × g por 15 min a 4 °C para remover os detritos celulares.
   5. Quantificar a concentração de proteínas usando o ensaio de Bradford ou o método BCA²².
   6. Ajustar as concentrações de proteínas para 2 μg/μL num tampão de amostra e conservar a -80 °C até uma análise mais aprofundada para aplicações de western blotting.
2. Análise abrangente de western blot com foco de sinalização STAT
   1. Prepare 10 mL de géis SDS-PAGE a 10% usando soluções padrão de acrilamida/bisacrilamida.
   2. Carregue 20 μg de proteína por pista ao lado de marcadores de peso molecular pré-corados e resolva a 120 V por 90 min.
   3. Transfira proteínas para membranas de PVDF a 100 V por 2 h a 4 ° C usando tampão de transferência (25 mM Tris, 192 mM de glicina, 20% de metanol).
   4. Bloqueie as membranas com 50 mL de leite em pó desnatado a 5% em solução salina tamponada com Tris com 0,1% de Tween-20 (TBST).
   5. Incubar com anticorpos primários durante a noite a 4 °C: Anti-CLCF1 (1:1.000); Anti-CRLF1 (1:1.000); Anti-OPG (1:1.000); Anti-RANKL (1:1.000); Anti-JAK2 (1:1.000); Anti-fosfo-JAK2 (Tyr1007/1008, 1:1.000); Anti-STAT1 (1:1.000); Antifosfo-STAT1 (Tyr701, 1:1.000); Anti-STAT3 (1:1.000); Antifosfo-STAT3 (Tyr705, 1:1.000); Anti-β-actina (1:1.000)
   6. Lave as membranas 3 vezes por 10 min cada com 15 mL de TBST. Incubar com anticorpos secundários apropriados por 1 h à temperatura ambiente.
   7. Detecte bandas de proteínas usando substrato de quimioluminescência aprimorado. Imagem usando sistema de imagem de quimioluminescência com otimização automática de exposição. Quantifique usando análise densitométrica com a ferramenta de análise de gel ImageJ v1.53.
3. Análise de via dupla STAT1/STAT3
   1. Calcule as proporções fosfo-STAT1/STAT1 total e fosfo-STAT3/STAT3 total usando o software ImageJ/Fiji versão 1.54f.
   2. Avalie o equilíbrio de ativação do STAT1/STAT3 como indicador da atividade funcional do CLCF1.
   3. Correlacione os padrões de ativação de STAT com as razões de expressão de RANKL/OPG.
   4. Avalie a fosforilação de STAT1/STAT3 via Western blot em 0, 15, 30, 60, 120 e 240 min após o tratamento com CLCF1. Normalize a fosfoproteína para os níveis totais de proteína usando densitometria.

5. Nocaute avançado de genes mediado por CRISPR/Cas9 com validação

1. Construção aprimorada do vetor lentiviral
   1. Projete RNA de guia único (sgRNA) visando a sequência do gene CLCF1:
      TTGAAGTCTGGCTCGTTGAA-3'.
   2. Inclua sequências de sgRNA adicionais para melhorar a eficiência do nocaute:
      GCTTGAACGAGCCAGACTTC-3'.
   3. Clone sgRNAs em vetor lentiviral usando técnicas padrão de clonagem molecular.
   4. Verifique a integridade da construção por meio da análise de sequenciamento de DNA.
   5. Avalie a eficiência de corte do sgRNA usando o ensaio de endonuclease I T7²³.
   6. Inclua a validação da especificidade da via usando inibidores: AG490 (JAK2, 50 μM), fludarabina (STAT1, 10 μM) e Stattic (STAT3, 5 μM).
   7. Realize experimentos de resgate usando construções STAT constitutivamente ativas para validar a necessidade do caminho.
2. Protocolo de transdução lentiviral otimizado
   1. Cultura de células Raji em meio RPMI-1640 (500 mL) suplementado com 10% de FBS. Manter todas as culturas de células a 37 °C numa incubadora humidificada com 5% de CO₂. Pré-equilibre os meios de cultura por pelo menos 30 minutos antes de usar.
   2. Pré-trate as células com polibreno (8 μg/mL) para aumentar a eficiência da transdução.
   3. Produza lentivírus usando células HEK293T com plasmídeos de embalagem e envelope via transfecção de fosfato de cálcio. Determine o título por p24 ELISA (> 10⁸ TU / mL necessário). Siga os procedimentos de contenção BSL-2²³.
   4. Transduzir células com lentivírus em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 100. Mudar de mídia 24 h após a transdução. Selecionar células transduzidas usando puromicina (4 μg/mL) por 7 dias e, em seguida, amplificar uma região de 500 pb abrangendo o local alvo usando as seguintes condições de PCR: desnaturação inicial a 95 °C por 3 min, seguida por 35 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 s, recozimento a 60 °C por 30 s e extensão a 72 °C por 30 s, com uma extensão final a 72 °C durante 5 min. Para o ensaio de endonuclease T7, desnaturar e recozer os produtos de PCR, digerir com endonuclease T7E1 por 30 min a 37 °C e, em seguida, analisar os produtos em um gel de agarose a 2%.
   5. Validar a eficiência do nocaute gênico por meio de western blotting e sequenciamento de Sanger^24,25.
   6. Realize análises fora do alvo usando GUIDE-seq ou metodologia semelhante²⁶.
      NOTA: Evidências recentes demonstram que a eficiência da secreção de CLCF1 requer co-expressão com a proteína chaperona CRLF1. Considere abordagens de nocaute duplo para ablação funcional completa²⁷.

6. Sistema abrangente de co-cultura com mimética de exercícios

NOTA: Para validação translacional, adapte-se aos modelos de camundongos ovariectomizados administrando rhCLCF1 a 10 μg / kg i.p. diariamente por 4 semanas, avaliando a DMO via micro-CT.

1. Configuração avançada de co-cultura Raji-MG-63
   1. Semear células semelhantes a osteoblastos MG-63 em câmaras inferiores de placas de 24 poços a uma densidade de 2 × 10⁴ células/poço em uma incubadora umidificada a 37 ° C com 5% de CO₂ e 95% de umidade. Pré-equilibre o meio na incubadora por 30 minutos antes de usar. Para uma tradução aprimorada, substitua por osteoblastos humanos primários (densidade 1 × 10⁴ / poço) de fontes comerciais.
   2. Coloque inserções de membrana de tamanho de poro de 0,4 μm em poços contendo células MG-63.
   3. Semeie células Raji (tipo selvagem, nocaute CLCF1 ou superexpressão CLCF1) em câmaras superiores com densidade de 1 × 10⁵ células/poço.
   4. Manter co-culturas em meio RPMI-1640 completo (2 mL na câmara inferior, 1,5 mL na câmara superior) por períodos experimentais especificados (7, 14, 21 dias) a 37 ° C com 5% de CO₂.
   5. Inclua grupos de tratamento CLCF1 recombinante (5-10 ng/mL) para avaliar as relações dose-resposta.
2. Protocolo de tratamento CLCF1 mimético de exercício
   1. Trate os sistemas de co-cultura com concentrações fisiológicas de CLCF1 recombinante (5-10 ng/mL) com base nos níveis induzidos pelo exercício.
   2. Aplique o regime de tratamento pulsátil CLCF1: Aplique CLCF1 por pulsos de 2 h em 0, 8 e 16 h no dia 1, seguido de exposição contínua por 24 h e repita o ciclo. Duração total do tratamento: 7 dias com 9 pulsos totais.
   3. Avalie os efeitos dependentes do tempo em 1 h, 4 h, 24 h e 7 dias após o tratamento.
   4. Monitore a cinética de fosforilação de STAT1 / STAT3 em ambas as populações de células via Western blot em 0, 15, 30, 60 min. Lise as células em tampão (500 μL) com inibidores, normalize para STAT1/3 total e β-actina.
3. Avaliação aprimorada da diferenciação osteogênica
   1. Induza a diferenciação osteogênica usando meio osteogênico padrão contendo ácido ascórbico (50 μg / mL), β-glicerofosfato (10 mM) e dexametasona (10 nM). Troque o meio osteogênico a cada 3 dias (câmara inferior de 2 mL, câmara superior de 1,5 mL). Prepare uma solução fresca de ácido ascórbico para cada mudança; β-glicerofosfato e dexametasona permanecem estáveis.
   2. Avalie a atividade da fosfatase alcalina (ALP) usando ensaio enzimático colorimétrico nos dias 7, 14 e^{21 28}. Use 500 μL de volume de extração. Leia a 405 nm. Normalize para o teor total de proteína. Faixa de cores esperada: amarelo claro (baixo) a amarelo escuro (alto).
   3. Avalie a deposição de cálcio por meio da coloração e quantificação de Vermelho de Alizarina S no dia 21. Extrato com 500 μL de cloreto de cetilpiridínio, lido a 540 nm, faixa de cores esperada: rosa claro (baixa mineralização) a vermelho escuro (alta mineralização).
   4. Quantificar a mineralização medindo a absorbância a 540 nm após a extracção do cloreto de cetilpiridínio.
   5. Analise a expressão gênica osteogênica: RUNX2, ALP, COL1A1, OCN e OPG usando os protocolos qPCR descritos na etapa 3.2.
   6. Avalie os marcadores relacionados aos osteoclastos: TRAP, catepsina K e RANKL em células MG-63.

7. Análise estatística avançada e interpretação de dados

1. Metodologia estatística abrangente
   1. Realizar teste de normalidade usando o teste de Shapiro-Wilk para todas as variáveis contínuas²⁹. Use testes não paramétricos quando os pressupostos de normalidade forem violados (p < 0,05).
   2. Aplicar o teste U de Mann-Whitney para comparações não paramétricas entre os grupos³⁰.
   3. Realizar análise de correlação de Spearman para estudos de associação entre os níveis de CLCF1 e parâmetros clínicos³¹.
   4. Realize análises de regressão múltipla para avaliar preditores independentes de DMO.
   5. Use ANOVA de medidas repetidas para análise de curso de tempo de intervenção de exercício³².
   6. Aplique a correção de Bonferroni para comparações múltiplas³³.
   7. Definir o limite de significância estatística em p < 0,05 para todas as análises.
2. Apresentação e análise de dados aprimoradas
   1. Apresentar dados contínuos como média ± desvio padrão ou mediana com intervalo interquartil.
   2. Crie gráficos de correlação para expressão de CLCF1 versus DMO, contagem de linfócitos e parâmetros de exercício usando o GraphPad Prism v9 para estatísticas, ImageJ v1.53 para densitometria. Nenhum script personalizado é necessário. Gere ROC por meio da ferramenta integrada do Prism; correlações via Spearman em Prisma.
   3. Gere gráficos de curso de tempo para a cinética de resposta CLCF1 induzida por exercício.
   4. Desenvolver curvas ROC (receiver operating characteristic) para CLCF1 como um biomarcador de osteoporose.
      NOTA: Imagens representativas de western blot foram criadas usando análise densitométrica quantitativa.

Resultados

A implementação deste protocolo demonstra com sucesso o papel regulador do CLCF1 no metabolismo ósseo imunomediado usando várias abordagens experimentais. Os estudos de validação clínica mostram uma regulação negativa significativa da expressão de CLCF1 em pacientes com PMOP em comparação com controles saudáveis, conforme demonstrado na Figura 1A, a análise quantitativa de PCR de células mononucleares do sangue periférico dem...

Discussão

O protocolo aqui descrito fornece uma estrutura metodológica abrangente para investigar o papel do CLCF1 como mediador da proteção óssea induzido pelo exercício por meio de uma análise sistemática do eixo RANKL/OPG. Pesquisas recentes identificaram o CLCF1 como um fator induzido pelo exercício que combate o declínio musculoesquelético relacionado à idade, posicionando-o como um mediador central da proteção óssea induzida pelo exercício 34,35,36.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cultura Celular Reagentes
Dimetil Sulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	Purpose_Application:  Componente do meio de criopreservação Specifications_Comments: Grau de biologia molecular, filtrado estéril
Meio DMEM	Thermo Fisher Scientific	11965092	Purpose_Application:  Meio de cultura de osteoblastos MG-63 Specifications_Comments: Formulação de alta glicose com L-glutamina
Soro Bovino Fetal (FBS)	Thermo Fisher Scientific	16000044	Purpose_Application:  Suplemento de cultura celular (inativado por calor) Specifications_Comments: Inativado por calor em 56Â ° C por 30 min
Penicilina-Estreptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140122	Purpose_Application:  Suplemento antibiótico para cultura estéril Specifications_Comments: 100X estoque, concentração final 1%
Polibrena (brometo de hexadimetrina)	Santa Cruz Biotecnologia	SC-134220	Purpose_Application:  Potenciador de transdução lentival Specifications_Comments: 8 & icirc; ¼ Concentração de trabalho g/mL
Puromicina dihidrocloreto	InvivoGen	ANT-PR-1	Purpose_Application:  Antibiótico de seleção para células transduzidas Specifications_Comments: 4 & Icirc; ¼ Concentração de seleção g/mL por 7 dias
RPMI-1640 médio	Thermo Fisher Scientific	11875093	Purpose_Application:  Meio de cultura de linfócitos B Raji Specifications_Comments: Com L-glutamina, preferido sem fenol vermelho
Solução Trippan Blue	Thermo Fisher Scientific	15250061	Purpose_Application:  Avaliação de viabilidade celular Specifications_Comments: 0,4% solução para ensaio de exclusão
Contêiner de Congelamento de Taxa Controlada	Thermo Fisher Scientific	5100-0001	Purpose_Application:  Congelamento de células por taxa controlada (-1Â ° C/min) Specifications_Comments: Sr. Frosty ou equivalente para -1Â ° Resfriamento em C/min
Tubos de Coleta de Sangue EDTA	BD em Biociências	366643	Purpose_Application:  Coleta venosa de sangue com anticoagulante Specifications_Comments: capacidade de 10-20 mL, tubos superiores roxos
Gradiente de Densidade Ficoll-Paque PLUS	Cytiva (GE Saúde)	17144003	Purpose_Application:  Isolamento de PBMC via centrifugação de densidade Specifications_Comments: Estéril, testado por endotoxinas para separação celular
Soro Tamponado com Fosfato (PBS)	Thermo Fisher Scientific	14190144	Purpose_Application:  Lavagem celular e tampão de diluição Specifications_Comments: Estéril, grau de cultura celular
RNA forte e qPCR
Clorofórmio (Grau ACS)	Sigma-Aldrich	C2432	Purpose_Application:  Separação de fases na extração de RNA Specifications_Comments: grau de reagente ACS, â ‰ ¥ 99% de pureza
Etanol (75%, grau molecular)	Sigma-Aldrich	E7023	Purpose_Application:  Lavagem de pellets de RNA Specifications_Comments: Grau de biologia molecular, preparar fresco
Isopropanol (grau molecular)	Sigma-Aldrich	I9516	Purpose_Application:  Precipitação de RNA Specifications_Comments: Grau de biologia molecular, â ‰ ¥ 99,5% de pureza
Água livre de nuclease	Thermo Fisher Scientific	AM9930	Purpose_Application:  Preparação para reação PCR Specifications_Comments: Livre de DNase/RNase, testada para aplicações de PCR
Filme adesivo óptico	Thermo Fisher Scientific	4311971	Purpose_Application:  Vedação óptica para placas qPCR Specifications_Comments: Qualidade óptica para aplicações qPCR
Placas PCR (96 poços)	Thermo Fisher Scientific	N8010560	Purpose_Application:  Formato de 96 poços para qPCR Specifications_Comments de alta produtividade: Fundo branco e transparente para detecção óptica
Tiras de tubos PCR	Thermo Fisher Scientific	AB0451	Purpose_Application:  Reações de PCR de pequeno volume Specifications_Comments: tiras de 8 tubos com capacitores individuais
PrimeScript RT Reagent Kit	Biografia de Takara	RR037A	Purpose_Application:  Transcrição reversa de RNA para cDNA Specifications_Comments: Com apagador de gDNA para remoção genômica de DNA
SYBR Green Master Mix	Biossistemas Aplicados	4309155	Purpose_Application:  Amplificação e detecção por PCR em tempo real Specifications_Comments: Com corante de referência ROX para normalização
Reagente Trizol (Lisis de RNA)	Thermo Fisher Scientific	15596026	Purpose_Application:  Lise celular e extração de RNA Specifications_Comments: Armazenar em 4Â ° C, uso em até 6 meses
Proteína Forte - Western Blot
Acrilamida/Bis-acrilamida (29:1)	Bio-Rad	1610146	Purpose_Application:  SDS-PAGE polimerização em gel Specifications_Comments: solução de estoque de acrilamida 30%
Kit de Ensaio de Proteína BCA	Thermo Fisher Scientific	23225	Purpose_Application:  Quantificação da concentração de proteínas Specifications_Comments: Compatível com redução para quantificação precisa
Substrato de Quimioluminescência Aprimorada (ECL)	Thermo Fisher Scientific	32106	Purpose_Application:  Detecção de proteínas quimioluminescentes Specifications_Comments: Detecção de sensibilidade por femtogramas
Leite desnatado	Laboratório Científico	170-6404	Purpose_Application:  Agente bloqueador Western Blot Specifications_Comments: Grau de bloqueio, baixo fundo
Coquetel Inibidor de Fosfatase	Roche Applied Science	4906845001	Purpose_Application:  Previne a desfosforilação de proteínas Specifications_Comments: Inclui ácido okadaico e caliculina A
Escada de Proteínas Prestainadas	Bio-Rad	1610394	Purpose_Application:  Padrões de referência de peso molecular Specifications_Comments: faixa de 10-250 kDa com 11 faixas
Cocktail de Inibidores de Protease	Roche Applied Science	11697498001	Purpose_Application:  Previna a degradação de proteínas durante a lise Specifications_Comments: Livre de EDTA para fosfatases dependentes de metais
Membranas PVDF (0,45 & icirc; ¼ m)	Millipore Sigma	IPVH00010	Purpose_Application:  Membrana de transferência de proteínas (0,45 & Icirc; ¼ poro m) Specifications_Comments: Fundo de baixa fluorescência
Buffer de Lise RIPA	Tecnologia de Sinalização Celular	9806S	Purpose_Application:  Extração de proteína de célula inteira Specifications_Comments: Buffer de lise pronto para uso com detergentes
Buffer de Carregamento de Amostras (4X)	Bio-Rad	1610747	Purpose_Application:  Preparação de amostra de proteína para SDS-PAGE Specifications_Comments: Carregando o corante com Î ²-mercaptoetanol
SDS-PAGE Buffer de Execução	Bio-Rad	1610732	Purpose_Application:  Eletroforese proteica Specifications_Comments: Sistema tampão Trisglicina-SDS
Fluoreto de sódio	Sigma-Aldrich	201154	Purpose_Application:  Inibição adicional de fosfatase Specifications_Comments: 50 mM de concentração de trabalho
Ortovanadato de sódio	Sigma-Aldrich	S6508	Purpose_Application:  JAK2/STAT fosforilação preservação Specifications_Comments: 1 mM concentração de trabalho, preparar fresco
Concentrado de Buffer de Transferência	Bio-Rad	1704156	Purpose_Application:  Transferência de proteína semi-seca Specifications_Comments: 10x concentrado, diluir antes do uso
Tris-Buffer de Soro Fisiológico com Tween-20 (TBST)	Tecnologia de Sinalização Celular	9997S	Purpose_Application:  Lavagem de membrana e diluição de anticorpos Specifications_Comments: 0,1% Tween-20, pH 7,6
CRISPR/Edição Genética
Kit de Transfecção de Fosfato de Cálcio	Promega	E1200	Purpose_Application:  Transfecção de DNA em células de embalagem Specifications_Comments: Alta eficiência de transfecção para produção de lentivírus
Kit de Extração de Gel de DNA	Qiagen	28706	Purpose_Application:  Purificação de produto por PCR para sequenciamento Specifications_Comments: Sistema de purificação baseado em colunas
Vetor lentiviral GV371	GeneChem Co., Ltd	GV371	Purpose_Application:  Expressão CRISPR/Cas9 para knockout gênico Specifications_Comments: Sistema lentiviral CRISPR/Cas9 pronto para uso
HEK293T Linha Celular	ATCC	CRL-3216	Purpose_Application:  Linha celular de embalagem lentival Specifications_Comments: Linha celular de embalagem altamente transfectável
Serviço de Sequenciamento Sanger	Macrogen Inc.	Costume	Purpose_Application:  Validação de knockout e análise off-target Specifications_Comments: Sequenciamento padrão com primers personalizados
T7 Endonuclease I	Biolaboratórios da Nova Inglaterra	M0302S	Purpose_Application:  Validação da eficiência de corte CRISPR Specifications_Comments: Endonuclease específica de desajuste para validação CRISPR
ELISA & Imunoensaios
Placas ELISA (96 poços, fundo plano)	Corning	3590	Purpose_Application:  Reação do substrato ELISA Specifications_Comments: Alta ligação, fundo plano para ELISA
CLCF1 DuoSet Humano ELISA	R& Sistemas D	DY1234	Purpose_Application:  Quantificação da proteína CLCF1 (31,2-2000 pg/mL) Specifications_Comments: Faixa de detecção: 31,2-2000 pg/mL, CV & 10%
Kit ELISA p24 (título lentiviral)	ZeptoMetrix Corporation	801111	Purpose_Application:  Determinação de títulos lentivais Specifications_Comments: Para determinação de títulos lentivirais (>10â ¸ TU/mL)
Funcionais
Kit de Tingimento Alizarin Red S	Sigma-Aldrich	A5533	Purpose_Application:  Visualização da deposição de cálcio Specifications_Comments: solução 2% em água destilada, pH 4,1-4,3
Kit de Atividade de Fosfatase Alcalina	Abcam	ab83369	Purpose_Application:  Medição enzimática ALP Specifications_Comments: ensaio colorimétrico, lido a 405 nm
Ácido ascórbico (L-ácido ascórbico)	Sigma-Aldrich	A4544	Purpose_Application:  Componente do meio osteogênico Specifications_Comments: 50 & icirc; ¼ Concentração final g/mL
Cloreto de cetilpiridínio	Sigma-Aldrich	C9002	Purpose_Application:  Extração Riz Red S para quantificação Specifications_Comments: solução 10% para extração de corante
Dexametasona	Sigma-Aldrich	D4902	Purpose_Application:  Componente do meio osteogênico Specifications_Comments: concentração final de 10 nM
Î ²-Glicerofosfato	Sigma-Aldrich	G9422	Purpose_Application:  Componente do meio osteogênico Specifications_Comments: concentração final de 10 mM
Meio de Diferenciação Osteogênica	PromoCell	C-28010	Purpose_Application:  Indução de diferenciação de osteoblastos Specifications_Comments: Meio osteogênico completo pronto para uso
Inserções de cultura celular Transwell (0,4 & icirc; ¼ m)	Corning	3470	Purpose_Application:  Sistema de cocultura com 0,4 & Icirc; ¼ Separação M Specifications_Comments: Membrana de tereftalato de polietileno, estéril
Equipamento - Instrumentos Principais
Centrífuga (Alta Velocidade, Refrigerada)	Eppendorf	5430R	Purpose_Application:  Processamento de amostras e separação de células Specifications_Comments: Refrigerado, máximo 30.000 x g
Sistema de Imagem de Quimioluminescência	Laboratórios Bio-Rad	12003154	Purpose_Application:  Imagem e quantificação por Western blot Specifications_Comments: Documentação de gel e imagem por Western blot
Incubadora de CO2 (Umidificada)	Thermo Fisher Scientific	51030287	Purpose_Application:  Manutenção da cultura celular (37Â ° C, 5% CO2) Specifications_Comments: Gás triplo (CO2/O2/N2), controle de umidade
Monitor de Frequência Cardíaca (Faixa Torácica)	Polar Electro	H10	Purpose_Application:  Monitoramento contínuo da frequência cardíaca Specifications_Comments: conectividade Bluetooth e Acirc; ± Precisão de 1 bpm
Descoberta Hologic: Um Scanner DXA	Hologic Inc.	Descoberta A	Purpose_Application:  Medição da densidade mineral óssea Specifications_Comments: Com o software APEX v4.5, é necessário controle de qualidade diário
Leitor de Microplacas (Multimodo)	BioTek Instruments	Sinergia H1	Purpose_Application:  Leitura de placas ELISA e medição de absorvança Specifications_Comments: UV-Vis, fluorescência, detecção de luminescência
Esteira motorizada	Aptidão para a Vida	95Ti	Purpose_Application:  Intervenção padronizada de exercício Specifications_Comments: Velocidade variável 0-16 km/h, inclinação 0-15%
Sistema de PCR em tempo real (CFX96 ou equivalente)	Laboratórios Bio-Rad	1855195	Purpose_Application:  Amplificação e detecção em tempo real por PCR Specifications_Comments: bloco de 96 poços, capaz de gradiente
Software & Software Ferramentas de Análise
APEX Software v4.5 (Análise DXA)	Hologic Inc.	v4.5	Purpose_Application:  Análise de varredura DXA e cálculo de DMO Specifications_Comments: Análise de DMO com banco de dados de referência
Bio-Rad CFX Maestro	Laboratórios Bio-Rad	CFX Maestro	Purpose_Application:  Análise de dados qPCR e determinação de CT Specifications_Comments: Análise PCR em tempo real e exportação de dados
GraphPad Prism v9.0	GraphPad Software	v9.0	Purpose_Application:  Análise estatística e geração de grafos Specifications_Comments: Software estatístico com geração de grafos
ImageJ/Fiji v1.53	Institutos Nacionais de Saúde	v1.53	Purpose_Application:  Densitometria de Western blot e análise de imagem Specifications_Comments: Análise de imagem com ferramentas de medição
Microsoft Excel 365	Microsoft Corporation	365	Purpose_Application:  Organização de dados e cálculos básicos Specifications_Comments: Organização de dados e funções estatísticas básicas
Consumíveis & Consumíveis Plástico
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL	Eppendorf	22363204	Purpose_Application:  Armazenamento e processamento de amostras de pequeno volume Specifications_Comments: livre de DNase/RNase, baixa ligação
Tubos Cônicos de 15 mL	Corning	430766	Purpose_Application:  Processamento de amostras de médio volume Specifications_Comments: Polipropileno, graduado, com tampas
Placas de Cultura Celular de 24 poços	Corning	3524	Purpose_Application:  Co-cultura e configuração funcional do ensaio Specifications_Comments: Cultura de tecidos tratada, fundo plano
Tubos Cônicos de 50 mL	Corning	430829	Purpose_Application:  Coleta e processamento de amostras de grande volume Specifications_Comments: Polipropileno graduado, com tampas
Criovais (1 mL)	Thermo Fisher Scientific	375418	Purpose_Application:  Armazenamento de células e amostras de longo prazo em -80Â ° C Specifications_Comments: Rosca externa, vedação do anel O, -196Â ° Classificação C
Pipetas Pasteur (Estéreis)	Fisher Scientific	13-678-20A	Purpose_Application:  Coleta e transferência de amostras estériles Specifications_Comments: Individualmente enroladas, estérils