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Artigo de método

Inibição da osteoclastogênese por LY90009 por meio da modulação da sinalização Notch em modelos de doenças osteolíticas

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DOI:

10.3791/69178

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7 de outubro de 2025

 ,  , 
1Department of Rheumatology, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University, 2Department of Geriatrics, Feicheng People's Hospital, 3Department of Trauma Center, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar os efeitos inibitórios do inibidor da γ-secretase LY900009 na osteoclastogênese induzida por RANKL em macrófagos derivados da medula óssea. O protocolo inclui avaliação de citotoxicidade, ensaios funcionais, análises moleculares e validação in vivo em modelo osteolítico murino, com aplicações no desenvolvimento terapêutico de doenças osteolíticas.

Resumo

A atividade desregulada dos osteoclastos contribui profundamente para a progressão da doença osteolítica, mas a extensão das modalidades de intervenção terapêutica é limitada por efeitos adversos. Este estudo investigou LY900009, um inibidor da γ-secretase, e sua capacidade de suprimir a osteoclastogênese induzida por RANKL por meio da modulação da sinalização Notch. Usando macrófagos derivados da medula óssea, realizamos avaliações in vitro abrangentes de citotoxicidade, diferenciação e ensaios funcionais. Análises de expressão gênica e proteica usando qPCR e western blotting foram usadas para elucidar os mecanismos moleculares subjacentes. A eficácia in vivo foi corroborada usando um modelo de reabsorção óssea induzida por lipopolissacarídeo murino. LY900009 inibiu a formação de osteoclastos induzidos por RANKL e a função de reabsorção de maneira dose-dependente sem citotoxicidade em concentrações terapêuticas. Este tratamento reduziu significativamente o número de osteoclastos positivos para TRAP, prejudicou a formação do cinturão de actina e suprimiu a degradação da matriz óssea. A expressão de marcadores de osteoclastos, incluindo NFATc1, c-Fos, catepsina K e TRAP, foi acentuadamente regulada negativamente. Mecanicamente, LY900009 interrompeu a sinalização Notch e as vias MAPK / Akt a jusante. A administração in vivo reduziu substancialmente a destruição óssea induzida por LPS, melhorando os parâmetros ósseos e reduzindo a presença de osteoclastos. Esses achados demonstram que o LY900009 inibe efetivamente a osteoclastogênese e a reabsorção óssea modulando o eixo de sinalização Notch/MAPK/Akt, tornando-o um candidato terapêutico promissor para distúrbios osteolíticos.

Introdução

A homeostase óssea constitui um paradigma fisiológico primorosamente orquestrado em vertebrados, harmonizado pelo delicado equilíbrio entre a formação óssea mediada por osteoblastos e a reabsorção óssea impulsionada por osteoclastos1. Esse equilíbrio intrincado mantém a integridade esquelética, a resiliência biomecânica e a fidelidade metabólica ao longo da vida, respondendo dinamicamente a demandas mecânicas, distúrbios endócrinos e desafios patológicos2. O ciclo de remodelação óssea envolve fases sequenciais de ativação, reabsorção, transição, formação e término, cada uma governada por intrincadas cascatas moleculares que garantem a sincronização espaço-temporal das atividades celulares3.

A interrupção desse mecanismo homeostático, particularmente por meio da atividade excessiva dos osteoclastos ou da função inadequada dos osteoblastos, precipita a perda óssea patológica, característica de numerosos distúrbios osteolíticos 4,5. Essas condições abrangem um amplo espectro de doenças, incluindo osteoporose pós-menopausa e senescente, artrite reumatoide, artrite inflamatória, envolvimento ósseo neoplásico, doença de Paget e distúrbios periodontais6. As manifestações clínicas da reabsorção óssea excessiva incluem aumento do risco de fratura, deformidade esquelética, dor crônica, incapacidade funcional e uma carga substancial de saúde 6,7. Métricas epidemiológicas contemporâneas indicam que a osteoporose sozinha afeta mais de 200 milhões de indivíduos em todo o mundo, com fraturas associadas resultando em morbidade, mortalidade e custos econômicos significativos superiores a bilhões de dólares anualmente 7,8.

Os osteoclastos se manifestam como células gigantes multinucleadas altamente especializadas derivadas de precursores hematopoiéticos da linhagem de fagócitos mononucleares, especificamente macrófagos derivados da medula óssea9. Sua formação representa um processo complexo de várias etapas que requer a coordenação precisa de sinais extracelulares, cascatas de sinalização intracelular e programas transcricionais10. As citocinas essenciais que governam a osteoclastogênese incluem o ativador do receptor do ligante do fator nuclear κB (RANKL) e o fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF), que se ligam aos seus respectivos receptores RANK e c-Fms para iniciar programas de diferenciação11. A interação RANKL-RANK desencadeia a ativação de múltiplas vias de sinalização a jusante, incluindo proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPKs), fator nuclear κB (NF-κB), fosfoinositídeo 3-quinase / proteína quinase B (PI3K / Akt) e vias de cálcio / calcineurina, que convergem para o fator nuclear das células T ativadas citoplasmáticas 1 (NFATc1), o regulador transcricional mestre da osteoclastogênese10 , 11 , 12 .

Dentre os vários mecanismos regulatórios que controlam a biologia dos osteoclastos, a sinalização Notch emergiu como um modulador crítico com funções complexas e dependentes do contexto13. A via Notch é um sistema de comunicação célula-célula evolutivamente conservado que governa a determinação, diferenciação, proliferação e apoptose do destino celular em diversos tecidos e estágios de desenvolvimento14. Em mamíferos, quatro receptores Notch (Notch1-4) interagem com cinco ligantes canônicos (Delta-like 1, 3 e 4 e Jagged 1 e 2) para mediar a sinalização intercelular. A ativação da via envolve ligação ao ligante, alterações conformacionais e clivagem proteolítica sequencial por metaloproteases ADAM e pelo complexo γ-secretase, que finalmente libera o domínio intracelular Notch (NICD) para a translocação nuclear e regulação transcricional de genes-alvo, incluindo as famílias Hes e Hey14,15. O papel da sinalização Notch na osteoclastogênese permanece controverso e parece ser altamente dependente do contexto, com estudos relatando efeitos estimulatórios e inibitórios, dependendo dos subtipos específicos de receptores, disponibilidade de ligantes, microambiente celular e condições experimentais 16,17,18.

As abordagens terapêuticas predominantes para doenças osteolíticas concentram-se principalmente em estratégias antirreabsortivas, incluindo bifosfonatos, denosumabe (inibidor de RANKL), moduladores seletivos do receptor de estrogênio e calcitonina 7,8,19. Embora esses tratamentos reduzam efetivamente a reabsorção óssea e o risco de fratura, eles estão associados a limitações significativas, incluindo toxicidade gastrointestinal, osteonecrose da mandíbula, fraturas atípicas, aumento do risco de infecção e preocupações com a segurança a longo prazo. Além disso, esses agentes podem suprimir excessivamente a renovação óssea, potencialmente comprometendo a qualidade óssea e os mecanismos de reparo. Consequentemente, há uma necessidade clínica urgente de novos agentes terapêuticos que possam inibir seletivamente a atividade patológica dos osteoclastos, minimizando os efeitos adversos e preservando a capacidade fisiológica de remodelação óssea 8,14.

Os inibidores da γ-secretase representam uma classe promissora de compostos com potenciais aplicações em doenças osteolíticas por meio da modulação da sinalização Notch14,20. Esses agentes têm sido extensivamente estudados em oncologia e pesquisa de doenças neurodegenerativas, com vários compostos avançando para ensaios clínicos para a doença de Alzheimer e vários tipos de câncer. LY900009, um inibidor potente e seletivo da γ-secretase, demonstrou propriedades farmacológicas favoráveis, incluindo alta especificidade, biodisponibilidade e um perfil de segurança gerenciável em estudos preliminares21,22. No entanto, seus efeitos específicos na osteoclastogênese induzida por RANKL e potencial utilidade terapêutica em doenças osteolíticas permanecem incompletamente caracterizados. Este estudo foi desenhado para avaliar se LY900009 poderia inibir a osteoclastogênese por meio da interrupção da sinalização Notch, potencialmente oferecendo uma nova abordagem terapêutica para doenças osteolíticas. Desenvolvemos protocolos abrangentes para avaliar seus efeitos na formação de osteoclastos, atividade de reabsorção óssea, vias de sinalização e eficácia in vivo em modelos inflamatórios de perda óssea.

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Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais e foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Central afiliado à Shandong First Medical University (número de aprovação IACUC-2024-015). O estudo aderiu aos princípios éticos estabelecidos para pesquisa com animais e às diretrizes ARRIVE, incluindo alojamento de animais em gaiolas padrão (5 camundongos/gaiola, ciclo claro/escuro de 12 horas, comida/água ad libitum ) e randomização para grupos

1. Isolamento e cultura de macrófagos derivados da medula óssea

  1. Eutanasiar camundongos C57BL/6 machos de 5 semanas de idade (n=5 por isolamento) colocando-os em uma câmara de CO2 com uma taxa de fluxo de 30% do volume da câmara por minuto por 5 min. Confirme a morte por luxação cervical.
  2. Pulverize o mouse com etanol 70%. Faça uma incisão na linha média do púbis ao esterno usando uma tesoura estéril. Remova fêmures e tíbias assepticamente. Coloque os ossos em PBS estéril no gelo.
  3. Limpe os ossos dos tecidos moles usando gaze estéril. Corte as duas extremidades dos ossos com uma tesoura estéril. Lave a medula usando uma agulha 25G com 10 mL de α-MEM frio por camundongo. Passe a suspensão celular por um filtro de células de 70 μm.
  4. Centrifugue a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Ressuspenda o pellet em α-MEM contendo 10% de FBS e 33,3 ng/mL M-CSF. Conte as células usando um hemocitômetro com exclusão de azul de tripano. Placa a 2 x 106 células/ml em balões T75.
  5. Manter as culturas a 37 °C em atmosfera de 5% de CO2 com mudanças de meio a cada 48 h.
  6. Colha 1x 106 células. Lave com PBS contendo 2% de FBS. Incubar com anti-CD11b-FITC (1:100) e anti-F4/80-PE (1:100) durante 30 min a 4 °C na escuridão. Analise por citometria de fluxo usando a seguinte estratégia de gating: Primeiro, células-porta baseadas em dispersão direta (FSC) e dispersão lateral (SSC) para excluir detritos e selecionar células viáveis. Em segundo lugar, células CD11b-positivas da população de células viáveis. Terceiro, a partir de células CD11b-positivas, células F4/80-positivas para identificar macrófagos CD11b+/F4/80+ duplamente positivos. Defina portões com base em controles não manchados e controles de cor única. Prossiga apenas se as células >95% forem CD11b+/F4/80+.

2. Avaliação da citotoxicidade

  1. Semente de macrófagos derivados da medula óssea (BMMs) a 1 x 104 células por poço em placas de 96 poços usando 100 μL de meio por poço. Deixe as células aderirem por 4 h a 37 °C.
  2. Preparar LY900009 diluições em meio completo: 0, 0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6, 3,2, 6,4, 12,8, 25,6 μM. Remover o meio antigo. Adicione 100 μL de meio de tratamento por poço. Preparar triplicados para cada concentração.
  3. Incubar por 24 h, 48 h ou 96 h. Remova completamente o meio de cultura. Adicione 100 μL de meio fresco contendo 10% de reagente CCK-8 (10 μL de CCK-8 em 90 μL de meio). Incubar durante exatamente 2 h a 37 °C. Utilizar um leitor de microplacas para medir a absorvância a 450 nm com uma referência a 650 nm.
  4. Calcule o IC50 usando o GraphPad Prism. Software aberto, concentração de entrada (eixo X) e porcentagem de viabilidade (eixo Y). Selecione Analisar > Regressão não linear > Dose-resposta > Inibição > log(inibidor) vs. resposta com inclinação variável. Definir restrições: Inferior=0, Superior=100. Registre IC50 com intervalo de confiança de 95%.

3. Diferenciação de osteoclastos e coloração TRAP

  1. Semente de macrófagos derivados da medula óssea (BMMs) a 1 x 104 células por poço em placas de 96 poços. Cultura durante a noite em α-MEM com 10% de FBS e 33,3 ng/mL M-CSF.
  2. Substitua o meio por 100 μL de meio de diferenciação: α-MEM contendo 10% de FBS, 33,3 ng/mL M-CSF, 100 ng/mL RANKL e LY900009 (0, 100, 200, 400 nM). Prepare quadruplicados para cada condição.
  3. Substituir o meio a cada 48 h por meio de diferenciação fresco. Continue por 6 dias. Monitore diariamente usando um microscópio invertido a 100x para a formação de osteoclastos.
  4. Remova todo o meio por aspiração. Lave uma vez com 200 μL de PBS. Adicione 100 μL de paraformaldeído a 4% em PBS. Incubar por exatamente 15 min em temperatura ambiente. Remova o fixador. Lave 3x com 200 μL de PBS.
  5. Prepare a solução de coloração TRAP: Misture 50 mL de tampão acetato de sódio 0,1 M (pH 5,0), 10 mL de tartarato de sódio 50 mM, 1 mL de fosfato de naftol AS-MX 5 mg / mL em dimetilformamida e 0,5 mL de sal Fast Red Violet LB 11 mg / mL. Filtre através de um filtro de 0,22 μm. Aplicar 200 μL por alvéolo. Incubar a 37 °C durante 30 min na escuridão. Pare a reação lavando 3x com água destilada.
  6. Identifique os osteoclastos como células positivas para TRAP (roxo/vermelho) contendo três ou mais núcleos. Conte usando um microscópio invertido com ampliação de 100x. Fotografe cinco campos aleatórios por poço.
  7. Quantifique usando ImageJ. Clique na imagem > Converter para 8 bits (Tipo de > de imagem > 8 bits) > Definir limite (Imagem > Ajustar > Limite) > Selecionar áreas positivas para TRAP > Analisar partículas (Analisar > Analisar partículas: tamanho 100-Infinity μm2, circularidade 0-1,0) > Exportar resultados para o Excel 23.

4. Ensaio de reabsorção óssea funcional

  1. Cultura de BMMs em placas de seis poços (2 x 10,5 células/poço) com M-CSF por 24 h. Adicione RANKL (100 ng/mL) para induzir a formação de pré-osteoclastos por 3 dias.
  2. Colha células usando tripsina-EDTA a 0,25% por 5 min a 37 °C. Neutralizar com meio completo. Conte as células viáveis usando azul de tripano.
  3. Semeie 1 x 104 pré-osteoclastos por poço em placas de 96 poços revestidas com hidroxiapatita. Deixe a fixação por 4 h.
  4. Trate com M-CSF (33,3 ng/mL), RANKL (100 ng/mL) e LY900009 (0, 100, 200, 400 nM) por 4 dias. Troque o meio a cada 2 dias.
  5. Remova as células usando água sanitária a 10% por 10 min. Lave 5x com água destilada. Seque completamente ao ar.
  6. Visualize poços de reabsorção usando um leitor de imagem automatizado com ampliação de 4x. Capture toda a área do poço. Quantifique a área reabsorvida como uma porcentagem da área total usando ImageJ.

5. Microscopia de imunofluorescência

  1. Cultive osteoclastos em lamínulas de vidro em placas de 24 poços por 5-7 dias, conforme descrito na etapa 3.
  2. Fixe com paraformaldeído a 4% por 15 min. Permeabilize com 0,1% de Triton X-100 em PBS por 10 min. Bloco com 1% de BSA em PBS por 1 h em temperatura ambiente.
  3. Incubar com rodamina-faloidina (1:200) em tampão de bloqueio por 45 min em temperatura ambiente no escuro. Contracorar os núcleos com DAPI (1 μg/mL) por 10 min.
  4. Monte lamínulas em slides usando meio de montagem anti-desbotamento. Examine usando um microscópio de fluorescência com ampliação de 200x. Meça a área do anel de actina usando ImageJ.

6. Análise quantitativa de PCR em tempo real

  1. Extraia o RNA total de 2 x 106 células usando um reagente de extração de RNA. Homogeneizar por pipetagem. Incube 5 min em temperatura ambiente.
  2. Adicione 200 μL de clorofórmio. Agite vigorosamente por 15 s. Incubar 3 min. Centrifugue a 12.000 x g por 15 min a 4 °C.
  3. Transfira a fase aquosa para um novo tubo. Adicione 500 μL de isopropanol. Misture delicadamente. Incube por 10 min em temperatura ambiente. Centrifugue a 12.000 x g por 10 min a 4 °C.
  4. Lave o pellet com 1 mL de etanol a 75%. Secar ao ar por 10 min. Dissolver em 30 μL de água isenta de RNase. Meça a concentração usando espectrofotômetro (requer relação A260/A280 >1,8).
  5. Sintetize cDNA usando 1 μg de RNA com o kit de transcrição reversa de acordo com o protocolo do fabricante.
  6. Prepare as reações de qPCR: 10 μL de Master Mix, 1 μL de cDNA, 0,5 μL de cada primer (10 μM), 8 μL de água. Execute no sistema de PCR em tempo real: 95 °C por 10 min, depois 40 ciclos de 95 °C por 15 s e 60 °C por 60 s. Calcular a expressão relativa utilizando o método 2-ΔΔCt com o GAPDH como gene de referência.

7. Análise de Western blot

  1. Lise as células em tampão RIPA contendo inibidores de protease e fosfatase no gelo por 30 min. Centrifugue a 14.000 x g por 15 min a 4 °C.
  2. Determine a concentração de proteína usando o ensaio BCA de acordo com as instruções do fabricante. Preparar amostras de proteínas de 30 μg em tampão de carga. Ferva por 5 min.
  3. Carregue as amostras em géis SDS-PAGE a 10%. Funciona a 80 V durante 30 min, depois a 120 V durante 90 min. Transfira para membranas de PVDF a 100 V por 90 min em tampão de transferência a frio.
  4. Bloqueie as membranas com 5% de leite desnatado em solução salina tamponada com Tris com 0,1% de Tween-20 (TBST) por 1 h em temperatura ambiente com balanço suave.
  5. Incubar com anticorpos primários detalhados na Tabela de Materiais (1:1000) durante a noite a 4 °C com balanço suave. Lave 3x com TBST por 10 min cada.
  6. Incubar com anticorpos secundários conjugados com HRP (1:5000) por 1 h à temperatura ambiente. Lave 3x com TBST.
  7. Detecte usando o reagente ECL de acordo com as instruções do fabricante. Capture imagens usando um sistema de imagem infravermelha. Quantifique a intensidade da banda usando ImageJ.

8. Modelo de reabsorção óssea induzida por LPS in vivo

  1. Calcule o tamanho da amostra usando G*Power 3.1 (tamanho do efeito = 0,8, α = 0,05, power = 0,80, resultando em n = 5 / grupo). Aloque aleatoriamente camundongos C57BL/6 machos de 7 a 8 semanas de idade para grupos usando um gerador de números aleatórios. Abriga 5 ratos por gaiola com um ciclo claro/escuro de 12 h, temperatura de 22 ± 2 °C, umidade de 55% ± 10%, acesso ad libitum a ração e água padrão.
  2. Anestesiar camundongos usando injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico (50 mg / kg). Confirme a anestesia pelo reflexo de pinça do dedo do pé.
  3. Prepare o controle do veículo: PBS contendo 1% de DMSO. Prepare LY900009: Dose baixa (2,5 mg / kg) e dose alta (5 mg / kg) no veículo. Injetar 100 μL por via subcutânea sobre a calvária utilizando uma agulha 27G diariamente durante 14 dias. Injete LPS (10 mg / kg) nos dias 1 e 8.
  4. Monitore os ratos 2x ao dia em busca de sinais de angústia. Defina desfechos humanos: perda de peso >20%, incapacidade de deambular, postura curvada, higiene reduzida. Eutanasiar imediatamente se os pontos finais forem atingidos.
  5. Eutanásia no dia 15 usando overdose de pentobarbital (100 mg/kg por via intraperitoneal). Colha calvárias. Fixar em paraformaldeído a 4% durante 48 h a 4 °C.

9. Micro-CT e análise histológica

  1. Escaneie calvárias fixas usando um scanner micro-CT com os seguintes parâmetros: 70 kV, 114 μA, filtro de alumínio de 0,5 mm, resolução de 9 μm, rotação de 180° com passos de 0,4°.
  2. Reconstrua imagens usando o software NRecon. Analise usando o software CTAn. Defina a região de interesse como uma área de 3 x 3 mm centrada na sutura sagital. Calcule BMD, BV/TV, Tb.N, Tb.Th.
  3. Descalcifique as amostras em EDTA a 10% (pH 7,4) por 14 dias com trocas diárias. Teste a conclusão da descalcificação usando o teste de oxalato de cálcio24.
  4. Processo de inclusão de parafina: desidratar com álcool graduado, limpar em xileno, infiltrar-se com parafina. Corte com 4 μm de espessura usando micrótomo.
  5. Garantir o cegamento: codifique todas as amostras usando números aleatórios de três dígitos. Peça a um colega que mantenha a chave de código. Realize todas as análises sem conhecimento dos grupos de tratamento. Decodificar somente após a conclusão da coleta de dados.
  6. Realize a coloração H&E: desparafinizar, reidratar, corar com hematoxilina por 5 min, diferenciar em álcool ácido, corar com eosina por 2 min, desidratar e montar.
  7. Execute a coloração TRAP como na etapa 3.5. Conte as células multinucleadas positivas para TRAP ao longo da superfície óssea. Expresse como um número por mm de perímetro ósseo.

10. Análise estatística

  1. Calcule o tamanho da amostra necessária usando G*Power 3.1: Tamanho do efeito de entrada f=0,8, α=0,05, power=0,80, número de grupos. Registre o mínimo n por grupo.
  2. Teste a normalidade usando o teste de Shapiro-Wilk no SPSS 28.0. Considere p > 0,05 como normalmente distribuído. Teste a homogeneidade da variância usando o teste de Levene. Considere p > 0,05 como variâncias iguais.
  3. Aplique testes apropriados com base na distribuição: Para dados normais com variâncias iguais, use testes paramétricos. Para os dois grupos, aplique o teste t de Student não pareado. Para vários grupos, use ANOVA unidirecional.
  4. Realize análise post hoc: Para ANOVA significativa (p<0,05), aplique o teste de diferença honestamente significativa de Tukey para todas as comparações pareadas.
  5. Use alternativas não paramétricas para dados não normais: Aplique o teste U de Mann-Whitney para dois grupos e Kruskal-Wallis com post hoc de Dunn para vários grupos.
  6. Calcular tamanhos de efeito: d de Cohen para testes t, eta parcial ao quadrado para ANOVA.
  7. Relate valores de p exatos com três casas decimais e intervalos de confiança de 95%. Apresentar dados normais como média ± desvio padrão, não normais como mediana (intervalo interquartil).
  8. Considere p < 0,05 estatisticamente significativo. Aplique a correção de Bonferroni quando forem realizadas comparações múltiplas.

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Resultados

A implementação bem-sucedida deste protocolo revelou que LY900009 exerceu potentes efeitos inibitórios na formação e função dos osteoclastos por meio de múltiplos mecanismos interconectados. A avaliação inicial da citotoxicidade em macrófagos derivados da medula óssea demonstrou aumentos dependentes do tempo na toxicidade, com valores calculados de IC50 de 4,44 μM, 3,66 μM e 2,93 μM em 24 h, 48 h e 96 h, respectivamente ( Figura 1A, B ). É importante ressaltar que...

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Discussão

A presente investigação fornece evidências convincentes de que a LY900009 representa um agente terapêutico promissor para doenças osteolíticas por meio de sua inibição potente e seletiva da osteoclastogênese, consistente com o crescente interesse em inibidores da γ-secretase para distúrbios relacionados ao osso 14,20,21. Os resultados demonstram que este inibidor da γ-secretase suprime efetivame...

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Divulgações

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes ou conflitos de interesse. Nenhum autor tem qualquer relação financeira com as entidades comerciais mencionadas neste trabalho. Todos os autores preencheram os formulários de divulgação do ICMJE.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer à equipe do Hospital Central Afiliado à Shandong First Medical University e ao Feicheng People's Hospital por seu apoio técnico e assistência durante o curso deste estudo. Também agradecemos as contribuições de nossos colegas de laboratório por suas valiosas discussões e assistência em experimentos com animais.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placas de cultura celular de 24 poçosCorning3524Microscopia de imunofluorescência
Placas de cultura de células de 6 poçosCorning3516Cultura celular e western blot
70% de etanolSigma-AldrichE7023Esterilização e desinfecção
75% de etanolSigma-AldrichE7148Tampão de lavagem de RNA
Placas de cultura de células de 96 poçosCorning3596Cultura celular e ensaios
Filtro de alumínio (0,5 mm)BrukerN/AFiltro de varredura Micro-CT
Anticorpo anti-CD11b-FITCBioLegend101206Citometria de fluxo - marcador de macrófagos
Anticorpo anti-clivado Notch1 (monoclonal de coelho)Tecnologia de sinalização celular4147SWestern blot - Sinalização de entalhe
Anticorpo anti-F4/80-PEBioLegend123108Citometria de fluxo - marcador de macrófagos
Meio de montagem anti-desbotamentoLaboratórios de vetoresH-1000Montagem em microscopia de fluorescência
Anticorpo anti-Hes1 (monoclonal de coelho)Tecnologia de sinalização celular11988SWestern blot - Alvo a jusante do entalhe
Anticorpo anti-NFATc1 (monoclonal de camundongo)Santa Cruz BiotecnologiaSC-7294Western blot - regulador mestre de osteoclastos
Anticorpo anti-fosfo-Akt (Ser473)Tecnologia de sinalização celular4060SWestern blot - Sinalização PI3K/Akt
Anticorpo anti-fosfo-ERK1/2 (Thr202/Tyr204)Tecnologia de sinalização celular4370SWestern blot - sinalização MAPK
Anti-fosfo-NF-κ B p65 (Ser536) anticorpoTecnologia de sinalização celular3033SWestern blot - NF-κ Sinalização B
Anticorpo anti-fosfo-p38 MAPK (Thr180/Tyr182)Tecnologia de sinalização celular4511SWestern blot - sinalização p38 MAPK
Anticorpo anti-beta;-actina (monoclonal de camundongo)Tecnologia de sinalização celular4970SControle de carregamento de Western blot
Leitor de imagem automatizadoDispositivos MolecularesImageXpress MicroQuantificação de poço de reabsorção
Kit de ensaio de proteína BCAPierce/Thermo Fisher23225Determinação da concentração de proteínas
Alvejante (hipoclorito de sódio a 10%)Sigma-Aldrich425044Remoção de células de placas de reabsorção
BSA (Albumina de Soro Bovino)Sigma-AldrichRolamento A7906Tampão de bloqueio para imunofluorescência
Camundongos C57BL/6 (machos, 5-8 semanas de idade)Laboratórios Charles River27Isolamento in vitro do BMM e estudos in vivo
Reagente de teste de oxalato de cálcioSigma-AldrichC0350Teste de conclusão de descalcificação
Reagente CCK-8 (Kit de Contagem de Células-8)Dojindo Tecnologias MolecularesCK04Avaliação da viabilidade celular
Filtro de células (70 μ m)Falcão BD352350Filtração de células da medula óssea
Centrífuga (refrigerada)Eppendorf5424RPreparação de células e amostras
ClorofórmioSigma-AldrichC2432Separação de fases de extração de RNA
Câmara CO2Euthanex CorpEX-075Eutanásia animal
CTAm softwareBrukerVersão 1.20Análise de imagem de micro-TC
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindo)Sigma-AldrichD9542Contracoloração nuclear
Dimetilformamida (DMF)Sigma-AldrichD4551Solvente de coloração TRAP
DMSO (dimetilsulfóxido)Sigma-AldrichD2650Preparação do controle do veículo
Substrato de Western Blotting ECLPierce/Thermo Fisher32106Detecção de proteínas em western blot
EDTA (10%, pH 7,4)Sigma-AldrichE6758Solução de descalcificação
Eosina YSigma-AldrichE4009H& E coloração histológica
Sal rápido de violeta vermelha LBSigma-AldrichRolamento F3381Cromogênio de coloração TRAP
Soro fetal bovino (FBS)Gibco / Thermo Fisher16140-071Suplemento para cultura celular
Citômetro de fluxoBD BiociênciasFACSCaliburCaracterização do BMM
Microscópio de fluorescênciaOlimpoIX73Imagem de imunofluorescência
Software G*PowerUniversidade Heinrich HeineVersão 3.1Análise de poder estatístico
Lamínulas de vidro (22 &vezes; 22 mm)Fisher Científico12-541-BMicroscopia de imunofluorescência
Prisma do GraphPadGraphPad SoftwareVersão 9.0Cálculo e representação gráfica do IC50
HematoxilinaSigma-AldrichH3136H& E coloração histológica
HemocitômetroHausser Científico3200Contagem de células
Kit de transcrição reversa de cDNA de alta capacidadeBiossistemas Aplicados4368814Síntese de cDNA a partir de RNA
IgG anti-camundongo conjugada com HRPTecnologia de sinalização celular7076SAnticorpo secundário de Western blot
IgG anti-coelho conjugada com HRPTecnologia de sinalização celular7074SAnticorpo secundário de Western blot
Placas de 96 poços revestidas com hidroxiapatitaCorning BioCoat354651Ensaio funcional de reabsorção óssea
ImagemJNIHVersão 1.53eAnálise e quantificação de imagens
Incubadora (CO2)Thermo Fisher51033058Manutenção de cultura de células
Sistema de imagem infravermelhaBio-RadChemiDoc MPDetecção de Western blot
Microscópio invertidoOlimpoCKX41Monitoramento de cultura celular, contagem de TRAP
IsopropanolSigma-AldrichI9516Precipitação de RNA
LPS (lipopolissacarídeo de E. coli)Sigma-AldrichL4391Reabsorção óssea inflamatória in vivo
LY900009 (inibidor da &gama;-secretase)Produtos Químicos SelleckS7999Composto de teste - inibidor de osteoclastos
M-CSF (Fator Estimulador de Colônias de Macrófagos)R& D Sistemas416-ML-010Sobrevivência de macrófagos e diferenciação de osteoclastos
Scanner Micro-CTBrukerSkyScan 1272Análise da microarquitetura óssea
Leitor de microplacasBioTekSinergia H1Medições de absorbância (CCK-8)
MicrótomoLeicaRM2255Secção histológica
Naftol fosfato AS-MXSigma-AldrichN5000Substrato de coloração TRAP
Agulhas (25G, 27G)BD305122, 305109Lavagem da medula óssea, injeções
Software NReconBrukerVersão 1.7Reconstrução de imagem de micro-TC
ParafinaSigma-AldrichPág. 3683Incorporação de tecidos
Paraformaldeído (4%)Sigma-AldrichPág. 6148Fixação de células e tecidos
PBS (solução salina tamponada com fosfato)Gibco / Thermo Fisher14190-144Lavagem de células e preparação de tampão
Pentobarbital sódicoSigma-AldrichPág. 3761Anestesia e eutanásia de animais
Coquetel de inibidores de fosfataseRoche4906837001Preservação da fosforilação
PowerUp SYBR Green Master MixBiossistemas AplicadosA25742PCR quantitativo em tempo real
Coquetel de inibidores de proteaseRoche11697498001Prevenção da degradação de proteínas
Membrana de PVDF (0,45 μ m)Bio-Rad1620177Transferência de proteína Western blot
RANKL (Ativador de Receptor de NF-κ Ligante B)R& D Sistemas462-TEC-010Indução de diferenciação de osteoclastos
Sistema de PCR em tempo realBiossistemas Aplicados7500 RápidoAnálise quantitativa da expressão gênica
Rodamina-faloidinaInvitrogen/Thermo FisherR415Visualização de F-actina
Tampão RIPATecnologia de sinalização celular9806SExtração de proteínas
Água livre de RNaseAmbion / Thermo FisherAM9937Dissolução de RNA e PCR
Géis SDS-PAGE (10%)Bio-Rad4561036Separação de proteínas de Western blot
Leite em pó desnatadoBio-Rad1706404Bloqueio de Western blot
Tampão acetato de sódio (0,1 M, pH 5,0)Sigma-AldrichS2889Tampão de coloração TRAP
Tartarato de sódio (50 mM)Sigma-AldrichS4297Especificidade da coloração TRAP
EspectrofotômetroThermo FisherNanoDrop 2000Medição da concentração de RNA/proteína
SPSSCorporação IBMVersão 28.0Análise estatística
Seringas (1 mL, 10 mL)BD309659, 309604Lavagem da medula óssea, injeções
Balões de cultura de células T75Corning430641Cultura primária de BMM
TBST (solução salina tamponada com Tris com 0,1% de Tween-20)Bio-Rad1706531Tampão de lavagem Western blot
Buffer de transferênciaBio-Rad1704270Transferência de proteína Western blot
Tritão X-100Sigma-AldrichT8787Permeabilização celular
Reagente de TRIzolInvitrogen/Thermo Fisher15596026Extração total de RNA
Azul de tripano (0,4%)Sigma-AldrichT8154Avaliação da viabilidade celular
Tripsina-EDTA (0,25%)Gibco / Thermo Fisher25200-056Colheita e descolamento celular
Sistema de transferência de Western blotBio-RadTrans-Blot TurboTransferência de proteínas para a membrana
XilenoSigma-AldrichX3750Processamento e limpeza de tecidos
α-MEM (Meio Essencial Mínimo Alfa)Gibco / Thermo Fisher12561-056Meio de cultura celular

Referências

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