Artigo de investigação

Microlesão da junção tendão-osso causada por exercício exaustivo agudo em ratos: alterações ultraestruturais e mecanismo

353 vistas

⸱

DOI:

10.3791/69184

⸱

14 de novembro de 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Rehabilitation, Sichuan college of traditional Chinese medicine, 2Department of Rehabilitation, Mian-yang Orthopedic hospital, 3Sports Medicine Center, West China Hospital, Sichuan University, 4Department of Orthopedics and Orthopedic Research Institute, West China Hospital, 5Department of Geriatric Medicine, Mian-yang hospital of traditional Chinese medicine, 6Department of Rehabilitation Medicine, Sichuan Provincial Orthopedic Hospital

Neste artigo

Resumo

Este estudo teve como objetivo explorar as alterações e mecanismos ultraestruturais na junção tendão-osso devido ao exercício exaustivo agudo. O exercício exaustivo agudo induz microlesão na junção tendão-osso, ativando transitoriamente o estresse do RE e suas vias de sinalização apoptótica mediadas. No entanto, essas microlesões e estresse no RE podem ser progressivamente restaurados após o exercício.

Resumo

Microlesões induzidas pelo exercício na junção tendão-osso (entese) podem levar à tendinopatia. Investigar as alterações ultraestruturais e os mecanismos dentro da êntese após o exercício exaustivo agudo pode melhorar nossa compreensão da tendinopatia e orientar os tratamentos clínicos. Neste estudo, trinta e seis ratos Sprague-Dawley machos foram aleatoriamente divididos em dois grupos: controle e exercício exaustivo. O grupo de exercícios exaustivos foi subdividido em cinco subgrupos com base no tempo pós-exercício: 0 h, 6 h, 12 h, 24 h e 48 h. A coloração de hematoxilina-eosina e a microscopia eletrônica foram empregadas para examinar as alterações na junção tendão-osso do calcâneo. A expressão das proteínas relacionadas ao estresse do retículo endoplasmático (ERS) GRP78, CHOP e Caspase-12 na junção tendão-osso foi quantificada usando imuno-histoquímica (IHQ). Após exercício exaustivo agudo, as junções tendão-osso de ratos submetidos a exercício exaustivo apresentaram alterações estruturais significativas. Os condrócitos e as fibras colágenas exibiram alterações ultraestruturais notáveis indicativas de ERS. Os níveis de proteína ERS aumentaram imediatamente após o exercício, atingindo o pico em 6 h. Esses níveis de proteína começaram a diminuir 12 h após o exercício e retornaram à linha de base em 48 h. Em conclusão, o exercício exaustivo agudo induz microdanos e estresse no retículo endoplasmático na junção tendão-osso em ratos, mas nenhum dano irreversível ocorre. O tratamento e o reparo oportunos dessas microlesões podem prevenir danos excessivos e o desenvolvimento de tendinopatia.

Introdução

A tendinopatia de Aquiles é uma condição clínica comum causada por lesões frequentes por uso excessivo do tornozelo. Este distúrbio é caracterizado por inchaço, dor e disfunção do tendão. É mais prevalente em indivíduos mais velhos e atletas, principalmente corredores e saltadores. A tendinopatia de Aquiles é categorizada em tendinopatia não insercional e insercional. A tendinopatia não insercional afeta o tendão 2 a 6 cm acima de sua inserção óssea, enquanto a tendinopatia insercional afeta a junção tendão-osso1. Além disso, a tendinopatia não insercional tende a ocorrer em pessoas com sobrepeso, idosos e menos ativos, enquanto a tendinopatia insercional tende a ocorrer em pessoas mais ativas1.

A junção tendão-osso, onde o tendão se insere no osso, envolve uma transição gradual do tecido tendinoso para o tecido ósseo, incluindo a fibrocartilagem não calcificada e a fibrocartilagem calcificada2. Essa mudança fornece uma transição de um tecido tendinoso macio e flexível para um osso duro. Em termos de engenharia, essa região serve como ponto de ancoragem, transmitindo força muscular para facilitar o movimento articular 3,4. Portanto, essa região é um local de concentração de estresse e é comumente submetida a lesões por uso excessivo no esporte.

A pesquisa clínica tem se concentrado principalmente na tendinopatia não insercional, com menos atenção dada à tendinopatia insercional na junção tendão-osso2. Pesquisas indicam que a carga de uso excessivo promove desorganização e fragmentação do colágeno, infiltração de tecido adiposo e neovascularização no tendão. Também leva à hiperplasia de fibrocondrócitos, ossificação endocondral e esporões ósseos nas regiões de fibrocartilagem não calcificada e calcificada5. No entanto, estudos recentes sugerem que os padrões de contração muscular podem desempenhar um papel mais significativo do que a quantidade de exercício na tendinopatia insercional 6,7. Portanto, mais pesquisas são necessárias para compreender o impacto do uso excessivo nas junções tendão-osso. Estudos anteriores exploraram os efeitos do uso excessivo, como pular ou correr a longo prazo, nessas junções. No entanto, poucos investigaram o impacto do exercício exaustivo agudo. Um estudo recente sugere que o exercício agudo induz estresse no retículo endoplasmático nos rins de ratos, indicando uma regulação positiva da sinalização de IL-6 e proteínas de choque térmico (HSPs) e uma diminuição no mRNA do complexo respiratório mitocondrial8. Não foi relatado se tais alterações ocorrem nas junções tendão-osso. Este estudo enfoca a junção tendão-osso (êntese) para elucidar as alterações e os mecanismos subjacentes induzidos pelo exercício exaustivo agudo. Os achados visam contribuir para o desenvolvimento de estratégias preventivas para a tendinopatia insercional.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com os padrões éticos para animais experimentais estabelecidos pelo Departamento de Ciência e Tecnologia do Instituto Superior de Medicina Tradicional Chinesa de Sichuan (Aprovação nº: 2023DS01). Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Desenho experimental e procedimento

  1. Animais
    Trinta e seis ratos CD-Sprague-Dawley machos com 12 semanas de idade foram alojados e alimentados ad libitum durante todo o período experimental. O ambiente foi mantido a uma temperatura de 20-25 °C e um nível de umidade de 50%-60%, com um ciclo claro/escuro de 12 horas.
  2. Design de grupo
    Após uma semana de alimentação adaptativa, os ratos foram aleatoriamente designados para um grupo controle (Con, n = 6) ou um grupo de exercícios exaustivos (EE, n = 30). Os ratos do grupo EE foram submetidos a treinamento de adaptação correndo a uma velocidade de 10 m/min por 15 min em uma esteira de subida com inclinação de 10 graus por três dias. Após o treinamento adaptativo, o grupo EE foi dividido em cinco subgrupos de tempo: 0 h, 6 h, 12 h, 24 h e 48 h após o exercício exaustivo.
  3. Procedimento de intervenção
    Os ratos do grupo controle não se exercitaram, enquanto os do grupo EE foram submetidos a corrida exaustiva em uma esteira de subida com inclinação de 10 graus (Figura 1A). Seguindo o protocolo de Bedford9, a carga de exercício foi dividida em três níveis: Nível 1 a 10 m/min por 15 min, Nível 2 a 15 m/min por 15 min e Nível 3 a 20 m/min até a exaustão (Figura 1B). A exaustão foi determinada quando um rato não conseguia mais correr e permanecia preso na pista três vezes em um período inferior a 1 min10, apesar da estimulação elétrica repetida de baixa intensidade (150 V, 0,5 mA em corrente alternada) e sonora (70 dB).

Os ratos foram sacrificados por meio de injeção intraperitoneal excessiva de pentobarbital sódico a 3% (200 mg/kg) nos horários especificados (0 h, 6 h, 12 h, 24 h e 48 h pós-exercício exaustivo). A pele e os tecidos subcutâneos do calcâneo foram cuidadosamente dissecados e o tendão de Aquiles foi cortado 2 cm acima do calcâneo com tesoura oftálmica. O calcâneo direito (incluindo o tendão de Aquiles anexado) foi preservado em paraformaldeído a 4% para exame histopatológico e teste imuno-histoquímico. Além disso, três amostras aleatórias do lado esquerdo foram armazenadas em solução de paraformaldeído a 2% e glutaraldeído a 2,5% para microscopia eletrônica para estudo de alterações ultraestruturais ( Figura 1C).

2. Histologia da junção tendão-osso

As amostras foram fixadas em paraformaldeído a 4% por 48 h e descalcificadas com EDTA a 15% por 4 semanas em temperatura ambiente (20-25 °C), com a solução trocada diariamente. O processo de descalcificação foi concluído quando o osso poderia ser facilmente perfurado por uma agulha sem aplicar nenhuma força. Após a descalcificação, as amostras foram submetidas à desidratação por meio de um processo automatizado envolvendo uma série graduada de etanol e xileno, seguida de três lavagens com PBS. As amostras foram incluídas em parafina sagital e seccionadas a 5 μm. A coloração com hematoxilina-eosina foi realizada de acordo com os procedimentos padrão, e as imagens foram capturadas com um sistema de microcâmera digital triocular Panthera com aumento de 20× e 40×.

3. Varredura de microscopia eletrônica

As amostras restantes foram prefixadas com paraformaldeído a 2% e glutaraldeído a 2,5% por 48 h, depois desidratadas em uma série de soluções de acetona, infiltradas em analisador de cura epóxi e incluídas sagitalmente. Os cortes semifinos foram corados com azul de metileno para identificar a região de junção tendão-osso. Seções ultrafinas, com aproximadamente 60-90 nm de espessura, foram cortadas com uma faca de diamante. Essas seções foram coradas com acetato de uranila por 10-15 min, seguidas de citrato de chumbo por 1-2 min. Os cortes foram examinados em microscópio eletrônico de transmissão com aumentos de 6000×,12000× e 25000×.

4. Ensaio imuno-histoquímico

A junção tendão-osso foi rotineiramente descalcificada e seccionada conforme descrito anteriormente. Após incubação com solução de recuperação de antígeno tampão citrato por 10 min, as amostras foram tratadas com 3% de H2O2 por 10 min para bloquear a atividade da peroxidase endógena, seguido de bloqueio com soro de cabra normal por 20 min a 25 °C. CHOP (1:100) e Caspase-12 (1:100). Posteriormente, as amostras foram incubadas com anticorpos secundários por 2 h a 25 °C. O desenvolvimento da cor foi obtido usando DAB por 8 min a 25 ° C, resultando em um sinal positivo marrom-amarelo. Os núcleos foram corados novamente com Hematoxilina por 3 min. O software Image-Pro Plus 6.0 foi usado para analisar a densidade média. Três regiões de interesse da região de junção tendão-osso (tendão, fibrocartilagem e fibrocartilagem mineralizada) foram selecionadas para análise, e o valor médio foi calculado.

5. Análise estatística

O GraphPad Prism 8 foi usado para analisar os dados e gerar gráficos. Todos os dados são expressos como média ± desvio padrão. As comparações entre os diferentes grupos foram feitas usando ANOVA de uma via, e o teste de Diferença Mínima Significativa (LSD) foi usado para comparações pareadas. Um valor de P de < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Conforme mostrado na Figura 2A, no grupo controle, os condrócitos e fibrócitos de colágeno na junção tendão-osso estão dispostos regularmente, e há uma linha azul suave entre a fibrocartilagem e a fibrocartilagem mineralizada, conhecida como marca de maré (setas amarelas). Nos grupos de exercícios exaustivos, ocorreram alterações ultraestruturais na junção tendão-osso. As alterações envolvem aumento de condrócitos (círculos v...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

A junção tendão-osso, também conhecida como ênteses ou locais de inserção, permite a inserção de tendões no osso e é um local de concentração de tensão onde ligamentos e tendões se ligam ao osso4. Como ponto de ancoragem, facilita o movimento do tornozelo, transmite a força de contração muscular da panturrilha para os ligamentos e tendões do pé e participa do movimento do tornozelo e do pé2. A junção tendão-osso compreende quatro regiões co...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de expressar sua sincera gratidão pelo apoio recebido da Fundação de Ciências Naturais (Grant No. 23ZRYB03), Projeto da Equipe de Pesquisa e Inovação (TD-2022-04), Grupo de Inovação em Ciência e Educação em Medicina Clínica e da Faculdade de Medicina Tradicional Chinesa de Sichuan, bem como o projeto de pesquisa de 2025 (25MSZX329) financiado pela Administração Provincial de Medicina Tradicional Chinesa de Sichuan.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução de 2% de paraformaldeído-2,5% de glutaraldeídoMKBio, ChinaMM1515, Varredura de microscopia eletrônica
Anti-Caspase12AnticorpoHangzhou Huaan Biotechnology Co., Ltd.HA500144Ensaio imunohistoquímico
Anticorpo Anti-CHOPHangzhou Huaan Biotechnology Co., Ltd.ET1703-05Ensaio imunohistoquímico
Anticorpo Anti-GRP78Hangzhou Huaan Biotechnology Co., Ltd.ER1706-50Ensaio imunohistoquímico
BiomicroscopiaMotic Industrial Group Co., Ltd.CHINABA210DigitalBiomicroscopia para histologia da junção tendão-osso Ensaio imunohistoquímico
Ratos CD-Sprague-DawleyBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.SCXK2021-0007 CD
Solução de recuperação de antígeno tampão de citratoZSGB-Bio, ChinaZLI-9065, Ensaio imunohistoquímico
DAB   ZSGB-Bio, ChinaZLI-9018 Ensaio imunohistoquímico
EDTASinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.10009717Coloração por hematoxilina-eosina  
Epox 812Sinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.XW00000020Varredura de microscopia eletrônica
Etanol Sinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.10009218Coloração por hematoxilina-eosina  
GraphPad Prism 8 GraphPad Software, Inc.  GraphPad Prism 8 Análise estatística
H2O2 Sinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.011092708Ensaio imunohistoquímico
Image-Pro Plus 6.0Media Cybernetics Co., Ltd. EUAImage-Pro Plus 6.0Ensaio imunohistoquímico
Paraformaldeído Sinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.20230408Coloração por hematoxilina-eosina   Ensaio imunohistoquímico
PBSZSGB-Bio, ChinaZLI-9062Varredura de microscopia eletrônica
Microscópio eletrônico de transmissãoLABORATÓRIO DE ÓPTICA ELETRÔNICA DO JAPÃO CO., LTDJEM-1400Flash, JapãoVarredura de microscopia eletrônica
Esteira para ratos e RatoBioMed Easy Technologies Co., Ltd  CHINASA101Realizei exercícios exaustivos na esteira
xilenoSinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.10023418Coloração por hematoxilina-eosina  

Referências

  1. Li, H. Y., Hua, Y. H. Achilles tendinopathy: Current concepts about the basic science and clinical treatments. Biomed Res Int. 2016, 6492597(2016).
  2. Tits, A., et al. Local anisotropy in mineralized fibrocartilage and subchondral bone beneath the tendon-bone interface. Sci Rep. 11 (1), 16534(2021).
  3. Doschak, M. R., Zernicke, R. F. Structure, function and adaptation of bone-tendon and bone-ligament complexes. J Musculoskelet Neuronal Interact. 5 (1), 35-40 (2025).
  4. Benjamin, M., et al. Where tendons and ligaments meet bone: attachment sites ('entheses') in relation to exercise and/or mechanical load. J Anat. 208 (4), 471-490 (2006).
  5. Warden, S. J. Animal models for the study of tendinopathy. Br J Sports Med. 41 (4), 232-240 (2007).
  6. Ozone, K., et al. Structural and pathological changes in the enthesis are influenced by the muscle contraction type during exercise. J Orthop Res. 40 (9), 2076-2088 (2022).
  7. Ozone, K., et al. Eccentric contraction-dominant exercise leads to molecular biological changes in enthesis and enthesopathy-like morphological changes. J Orthop Res. 41 (3), 511-523 (2023).
  8. da Silva, A. S. R., et al. Interleukin-6 modulates endoplasmic reticulum stress signaling and mitochondrial protein complexes in the kidney following acute exhaustive exercise. Cell Stress Chaperones. 30 (5), 100111(2025).
  9. Wang, Y., et al. Effect of one-time high load exercise on skeletal muscle injury in rats of different genders: oxidative stress and mitochondrial responses. Acta Cir Bras. 37 (8), e370805(2022).
  10. Świątkiewicz, M., et al. Increases in brain 1 H-MR glutamine and glutamate signals following acute exhaustive endurance exercise in the rat. Front Physiol. 8, 19(2017).
  11. Sun, Y., et al. Reconstruction of large chronic rotator cuff tear can benefit from the bone-tendon composite autograft to restore the native bone-tendon interface. J Orthop Translat. 24, 175-182 (2020).
  12. Gögele, C., Hahn, J., Schulze-Tanzil, G. anatomical tissue engineering of the anterior cruciate ligament entheses. Int J Mol Sci. 24 (11), 9745(2023).
  13. Sartori, J., et al. Three-dimensional imaging of the fibrous microstructure of Achilles tendon entheses in Mus musculus. J Anat. 233 (3), 370-380 (2018).
  14. Wang, L., et al. VEGF and BFGF expression and histological characteristics of the bone-tendon junction during acute injury healing. J Sports Sci Med. 13 (1), 15-21 (2014).
  15. Benjamin, M., Rufai, A., Ralphs, J. R. The mechanism of formation of bony spurs (enthesophytes) in the Achilles tendon. Arthritis Rheum. 43 (3), 576-583 (2000).
  16. Luo, J., et al. Animal model for tendinopathy. J Orthop Translat. 42, 43-56 (2023).
  17. Cook, J. L., et al. Revisiting the continuum model of tendon pathology: What is its merit in clinical practice and research. Br J Sports Med. 50 (19), 1187-1191 (2016).
  18. Yu, C., et al. Exercise effects on the biomechanical properties of the Achilles tendon: A narrative review. Biology (Basel). 11 (2), 172-184 (2022).
  19. Lu, H., et al. Treadmill running initiation times and bone-tendon interface repair in a murine rotator cuff repair model. J Orthop Res. 39 (9), 2017-2027 (2021).
  20. Schwarz, D. S., Blower, M. D. The endoplasmic reticulum: Structure, function and response to cellular signaling. Cell Mol Life Sci. 73 (1), 79-94 (2016).
  21. Oakes, S. A., Papa, F. R. The role of endoplasmic reticulum stress in human pathology. Annu Rev Pathol. 10, 173-194 (2015).
  22. Celik, C., Lee, S. Y. T., Yap, W. S., Thibault, G. Endoplasmic reticulum stress and lipids in health and diseases. Prog Lipid Res. 89, 101198(2023).
  23. Almanza, A., et al. Endoplasmic reticulum stress signaling - from basic mechanisms to clinical applications. FEBS J. 286 (2), 241-278 (2019).
  24. Huang, J., et al. Endoplasmic reticulum stress associates with the development of intervertebral disc degeneration. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 1094394(2023).
  25. Murata, N., et al. Insulin reduces endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis by decreasing mitochondrial hyperpolarization and caspase-12 in INS-1 pancreatic β-cells. Physiol Rep. 12 (12), e16106(2024).
  26. Chen, Y., et al. Single-cell integration analysis of heterotopic ossification and fibrocartilage developmental lineage: Endoplasmic Reticulum Stress Effector Xbp1 transcriptionally regulates the notch signaling pathway to mediate fibrocartilage differentiation. Oxid Med Cell Longev. 2021, 7663366(2021).
  27. Yao, Z., et al. Hydroxycamptothecin inhibits peritendinous adhesion via the endoplasmic reticulum stress-dependent apoptosis. Front Pharmacol. 10, 967(2019).
  28. Yao, Z., et al. Hydroxycamptothecin prevents fibrotic pathways in fibroblasts in vitro. IUBMB Life. 71 (5), 653-662 (2019).
  29. Li, J., et al. Extracellular vesicles from hydroxycamptothecin primed umbilical cord stem cells enhance anti-adhesion potential for treatment of tendon injury. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 500(2020).
  30. Liu, Y. C., et al. Alda-1, an activator of ALDH2, ameliorates Achilles tendinopathy in cellular and mouse models. Biochem Pharmacol. 175, 113919(2020).
  31. Liu, C., et al. Tendon microstructural disruption promotes tendon-derived stem cells to express chondrogenic genes by activating endoplasmic reticulum stress. J Orthop Res. 41 (2), 290-299 (2023).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Estresse do Ret culo Endoplasm ticoModelo de RatoColora o por Hematoxilina e EosinaMicroscopia Eletr nicaImunohistoqu micaUltraestrutura dos Condr citosAltera es nas Fibras de Col geno

Artigos relacionados