Shrinky Dink-Hanging Drops: Uma maneira simples para formar e Cultura corpos embrióides

Resumo

Vamos mostrar um método simples e rápido para carregar números pré-definidos de células em poços microfabricated e mantê-los para o desenvolvimento do corpo embrióides.

Resumo

Corpos embrióides (EB) são agregados de células-tronco embrionárias. A forma mais comum de criar esses agregados é o método de gota em suspensão, uma abordagem laboriosa de pipetagem um número arbitrário de células em placas bem. As interações entre as células-tronco forçado a estreita proximidade um do outro promove a geração dos EBs. Porque a mídia em cada um dos poços tem que ser trocado manualmente todos os dias, esta abordagem é manualmente intensivo.

Além disso, porque os parâmetros ambientais, incluindo a célula-célula, as interações célula-soluble fator, pH, ea disponibilidade de oxigênio podem ser funções de tamanho EB, populações de células obtidas a partir tradicionais gotas de suspensão pode variar drasticamente, mesmo quando cultivadas em condições idênticas. Estudos recentes têm mostrado que na verdade o número inicial de células que formam o agregado pode ter efeitos significativos sobre a diferenciação de células-tronco. Nós desenvolvemos um método de cultura simples, rápida e escalável para carregar números pré-definidos de células em poços microfabricated e mantê-los para o desenvolvimento do corpo embrióides. Finalmente, essas células são facilmente acessíveis para posterior análise e experimentação. Este método é passível de qualquer laboratório e não exige equipamentos dedicados. Nós demonstrar este método, criando corpos embrióides usando uma linha de células vermelhas fluorescentes mouse (129S6B6-F1).

Protocolo

1. Fazendo Shrinky Dink-Mold

1. Imprimir o padrão desejado na Shrinky dink folhas usando uma impressora boa definição.
2. Asse folha Shrinky dink-a 163 ° C por cerca de 10 minutos, ou até totalmente encolhido e tendo adquirido uma forma regular.
3. Depois Shrinky dink-molde ter arrefecido, submerge-o em um banho de isopropanol até que a superfície total é mal cobria.
4. Cuidadosamente, spray alguns acetona sobre o molde e agitar recipiente algumas vezes. Adicione mais isopropanol para lavar o excesso de acetona e repita este passo algumas vezes até Shrinky molde parece limpo.
5. Molde mergulhe em água destilada por 10 minutos para lavar qualquer solvente orgânico restantes.
6. Ar limpo Shrinky molde. Re-aquecer por aproximadamente 5 minutos a 163 ° C. Isso vai de tinta compacta e evaporar qualquer solvente restante.

2. Fazendo PDMS micropoços

1. Prepare uma mistura de agente de 10:01 PDMS / cura e agita-se vigorosamente durante alguns minutos.
2. Molde lugar Shrinky dink em uma pequena placa de Petri. Despeje a mistura PDMS até atingir cerca de 1 / 2 cm sobre a superfície do molde.
3. Prato colocar sob sino de vácuo para eliminar todas as bolhas da mistura PDMS.
4. Prato coloque no forno a 70 ° C, durante a noite.
5. Cortadas PDMS sólidos de molde e vinculá-lo a uma lâmina de vidro apenas pela aplicação de pressão.
6. Descartar primeiro micropoços-chip, uma vez que tem resíduos de tinta incrustada entre PDMS.
7. Repita este procedimento para produzir um chip de segundo que é a tinta-livre e tem uma forma mais definida.
8. Limpa micropoços-chip utilizando solução de etanol 70%. Colocá-lo sob fonte de luz UV durante 10 minutos para esterilizá-lo.

3. Células Trapping em micropoços

1. Contagem de células e diluí-los em meios de cultura para a concentração desejada (dependendo do número de células iniciais em poços que gostaria). Por exemplo, para obter cerca de 10-15 células por poço (média = 11, DP = 5,4, taxa de carregamento = 93%), foi utilizada uma concentração de 8 × 10 ⁴ células / ml. Para uma concentração de 17 × 10 ⁴ células / ml, poderíamos obter de forma confiável entre 25 e 35 células por poço (média = 27,17857 DP = 7,7, taxa de carregamento = 100%).
2. Cuidadosamente coloque chip de micropoços em um tubo de centrífuga de 50 ml contendo um solidificou base de PDMS.
3. Adicionar cerca de 2JDP ml da solução celular.
4. Centrifugar durante 5 minutos a 760 rpm e 4 ° C.
5. Pipeta com excesso de solução e lavar cuidadosamente com PBS micropoços solução de 1X.
6. Coloque em um prato de micropoços Petry pequeno, sendo cuidado ao tirar o chip para fora do tubo de centrifugação.
7. Lavar o excesso de células usando um X solução PBS.
8. Lugar de chips micropoços sob um microscópio invertido para verificar o número pretendido de células por poço.
9. Incubar micropoços contendo células em condições normais.
   
   

4. Incubação de células

1. Seguir o protocolo EB normal no laboratório.
2. Mudar o meio devagar do lado da câmara; evitar a perturbação do celular na microplaca.

Discussão

Nós desenvolvemos um método de cultura simples, rápida e escalável para carregar números pré-definidos de células em poços microfabricated (moldados a partir Shrinky-Dinks) e mantê-los para o desenvolvimento do corpo embrióides. Finalmente, essas células são facilmente acessíveis para posterior análise e experimentação. Este método é passível de qualquer laboratório e não exige equipamentos dedicados, porque evitaria a necessidade de fotolitografia. Podemos variar o tamanho dos poços, bem como a concentração de células / poços para alterar ...

Materiais

Para a mídia MESC (McCloskey laboratório protocol): (para media total de preparo: 50ml; 100ml) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml KSR 15%: 7.5ml; 15ml 1x Penn-Strep: 0,5 ml; 1ml 2mM de L-glutamina: 0,5 ml; NEAA 1ml: 0,5 ml; 1ml LIF: 100ul; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50uL; 100ul diluído BME:. 50uL; 100ul (Adicionar 35ul da BME estéril filtrado a 5 ml de PBS e filtro de seringa esterilizar Descarte após 2 semanas. concentração final na solução é 0,1 mM)