Artigo de método

Um modelo de camundongo neonatal de enterocolite necrosante e isolamento da lâmina própria para perfil de células imunes

DOI:

10.3791/69233

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19 de setembro de 2025

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1Division of Neonatal-Perinatal Medicine, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Division of Pediatric Gastroenterology, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo descreve um modelo de camundongo neonatal de enterocolite necrosante (NEC) e subsequente isolamento de células imunes da lâmina própria do intestino delgado murino neonatal.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A enterocolite necrosante (ECN) é uma doença inflamatória grave do intestino neonatal, afetando principalmente prematuros. A NEC é caracterizada por lesão epitelial, disbiose microbiana e uma resposta imune desregulada, muitas vezes resultando em necrose intestinal e inflamação sistêmica. Modelos murinos experimentais que recapitulam os principais aspectos da doença humana têm sido essenciais para avançar nossa compreensão dos mecanismos que impulsionam a doença e informam o desenvolvimento terapêutico. Este protocolo descreve um modelo de camundongo neonatal bem estabelecido de enterocolite necrosante (NEC) utilizando alimentação com fórmula, hipóxia intermitente, administração oral de lipopolissacarídeo (LPS) e bactérias entéricas cultivadas de uma criança com NEC. Essa combinação induz de forma confiável características histológicas, transcricionais e imunológicas consistentes com NEC em bebês humanos e tem sido fundamental em várias descobertas importantes no campo. Além disso, este protocolo descreve o isolamento de células imunes da lâmina própria do intestino delgado de camundongos neonatais. O isolamento de células da lâmina própria permite o perfil detalhado das células imunes por meio de citometria de fluxo, facilitando a análise de populações de células inatas e adaptativas no intestino.

Introdução

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A enterocolite necrosante (ECN) é uma doença inflamatória grave do intestino que afeta quase exclusivamente neonatos prematuros. Aproximadamente 7%-8% dos recém-nascidos de muito baixo peso (<1500 g) serão afetados pela ECN, e as taxas de mortalidade associadas à doença podem se aproximar de 50% em neonatos que necessitam de intervenção cirúrgica1. A patogênese da ECN permanece incompletamente compreendida; no entanto, as evidências atuais sugerem que a ECN surge da confluência de múltiplos fatores, incluindo uma barreira intestinal imatura, sinalização imunológica desregulada e um microbioma disbiótico 2,3,4. A convergência desses fatores pode iniciar e exacerbar respostas inflamatórias no intestino, principalmente por meio da ativação do receptor toll-like 4 (TLR4), resultando em dano epitelial e vários tipos de morte celular, incluindo apoptose e necrose 5,6. O objetivo deste protocolo é apresentar um modelo de camundongo reprodutível e fisiologicamente relevante de NEC que recapitula a inflamação intestinal e a pneumatose intestinal (gás dentro da parede intestinal) observadas em neonatos humanos, permitindo a investigação mecanicista da patogênese da doença. Além disso, este protocolo descreve o isolamento de células imunes da lâmina própria do intestino delgado de camundongos neonatais, permitindo que os pesquisadores realizem o perfil de células imunes por meio de citometria de fluxo.

Em comparação com modelos animais maiores, como ratos ou leitões neonatais 7,8, os modelos de camundongos neonatais oferecem várias vantagens distintas, incluindo menor custo, maior acesso a animais transgênicos e a capacidade de realizar experimentos em coortes maiores. Os modelos murinos de NEC utilizam principalmente uma combinação de alimentação com fórmula, estresse pelo frio e hipóxia para simular a complexa fisiopatologia da NEC observada em pacientes humanos 7,8,9. No entanto, muitos modelos murinos de ECN são limitados por sua dependência de grandes estressores microbianos ou alterações artificiais da microbiota, o que pode comprometer sua relevância clínica. Em contraste, o modelo descrito neste protocolo supera essas limitações integrando vários fatores-chave implicados na patogênese da ECN em bebês humanos10,11. Especificamente, este modelo combina estresse hipóxico, que tem sido implicado na interrupção da integridade da barreira intestinal 3,12, com administração oral de fórmula infantil suplementada com lipopolissacarídeo (LPS), um ligante TLR4 bem caracterizado que induz inflamação intestinal, bem como microbioma disbiótico clinicamente relevante com bactérias entéricas cultivadas de um paciente com NEC totalis, a forma mais grave da doença, caracterizada por pan-necrose do intestino10,13. Ao integrar esses estressores clinicamente relevantes e específicos da doença, nosso modelo reflete com precisão as características clínicas e moleculares da NEC. Além disso, para fornecer aos investigadores uma estrutura para interrogar os mecanismos imunomediados subjacentes à patogênese da NEC, este protocolo descreve o isolamento de células da lâmina própria do intestino delgado murino neonatal para análise de citometria de fluxo. Como o principal local da atividade imune da mucosa intestinal, a lâmina própria contém um repertório dinâmico de células imunes residentes e infiltrantes que desempenham um papel central na inflamação associada à ECN14. A citometria de fluxo fornece uma plataforma robusta e escalável para caracterizar essas populações de células imunes com alta resolução, permitindo a análise detalhada dos fenótipos celulares, quantificação das respostas imunes e identificação de assinaturas imunológicas implicadas na patogênese da ECN15.

O modelo NEC murino descrito neste protocolo complementa os modelos in vitro , permitindo o estudo das interações hospedeiro-microbioma, respostas imunes e sinalização inflamatória dentro do ambiente complexo do intestino neonatal. Ele reproduz aspectos-chave da patogênese da NEC que não podem ser modelados in vitro, tornando-se uma ferramenta valiosa para elucidar os mecanismos da doença e avaliar estratégias terapêuticas. Embora as diferenças específicas da espécie continuem sendo uma limitação, este modelo oferece uma plataforma robusta e acessível para avançar nossa compreensão da NEC e acelerar o desenvolvimento de intervenções direcionadas.

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Protocolo

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Todos os métodos foram realizados de acordo com as diretrizes éticas fornecidas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill School of Medicine. Os camundongos foram criados, mantidos e alojados de acordo com os procedimentos descritos no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório sob uma proposta de estudo aprovada pelo IACUC (protocolo nº 24-114) da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill School of Medicine. Camundongos C57BL/6J foram utilizados para todos os experimentos descritos neste estudo. Os filhotes foram iniciados no modelo no dia 4 pós-natal, pesando entre 1,8-2,3 g; animais fora dessa faixa de peso foram excluídos. As coortes experimentais tiveram uma distribuição sexual equilibrada, com machos e fêmeas compreendendo aproximadamente 50% dos animais tratados. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Modelo murino do NEC

NOTA: O estoque bacteriano entérico é produzido pela obtenção do conteúdo entérico de uma criança que teve a forma mais grave de ECN, NEC totalis 13,16. O conteúdo entérico é cultivado durante a noite a 1 x g por 16 h a 37 ° C, centrifugado a 3000 x g por 10 min a 4 ° C e ressuspenso em glicerol a 50%. Alíquotas de 20 μL são pipetadas em criogenias e armazenadas a -80 °C para armazenamento de longo prazo. Os tempos de cultura selecionados neste protocolo foram escolhidos para eficiência do fluxo de trabalho. Esses pontos de tempo podem ser ajustados conforme necessário para acomodar programações de laboratório individuais sem afetar o modelo geral. Além disso, esse protocolo foi otimizado para uma capacidade máxima de 40 mouses, mas pode ser ampliado conforme necessário.

  1. Preparando cultura bacteriana
    1. No dia experimental 0 às 15:00, adicione uma alíquota de 20 μL de bactérias entéricas cultivadas de uma criança com NEC totalis a um tubo de cultura de 15 mL contendo 2 mL de caldo Luria-Bertani (LB). Incubar a cultura bacteriana com a tampa do tubo na posição ventilada num agitador orbital a 37 °C, 1 x g, durante a noite durante 16 h, e incubar um tubo de cultura contendo apenas 2 ml de caldo LB simultaneamente como controlo para avaliar qualquer contaminação por LB.
      1. Confirme visualmente a cultura noturna comparando a turbidez entre a cultura bacteriana e o controle claro, somente LB; Proceder apenas se a cultura bacteriana parecer turva e o controlo permanecer límpido.
    2. No dia experimental 1, às 07:00, alíquota de 125 μL da cultura inoculada durante a noite em um frasco de cultura de células T75 com tampa ventilada contendo 25 mL de caldo LB. Preparar quatro frascos T75 no total e incubá-los na posição vertical num agitador orbital a 37°C, 1 x g, durante 2 h para expandir a cultura bacteriana.
      NOTA: As culturas noturnas são preparadas nos dias experimentais 0, 1 e 2 do modelo NEC.
  2. Alocando filhotes em grupos experimentais
    1. No dia experimental 1 às 07:00, pesar os filhotes do dia 4 pós-natal.
      NOTA: A faixa de peso ideal é entre 1,8-2,3 g, e os valores discrepantes devem ser removidos do experimento.
    2. Agrupe os camundongos experimentais em coortes alimentadas com fórmula e alimentadas com barragens e calcule o peso médio dos camundongos alimentados com fórmula. Separe os camundongos alimentados com fórmula designada da mãe e coloque-os em uma nova gaiola alojada em uma incubadora infantil pré-aquecida a 37 ° C. Mantenha os filhotes alimentados com a mãe na gaiola original com a mãe.
      NOTA: Os camundongos neonatais são particularmente sensíveis às mudanças na temperatura ambiente. Para manter uma regulação consistente da temperatura após a separação da mãe, os filhotes alimentados com fórmula são mantidos em uma incubadora infantil com temperatura controlada ajustada a 37 °C. Essa abordagem é consistente com os protocolos de ECN estabelecidos que preservam a temperatura fisiológica sem o uso de intervenções térmicas adicionais 11,17,18,19.
    3. Repita nos dias experimentais 2 e 3, pesando os camundongos alimentados com fórmula e calculando o peso médio antes do horário de alimentação das 07:00 diariamente.
  3. Medição da densidade óptica (DO) da cultura bacteriana
    1. Após 2 h de incubação a 37 °C e 1 x g, remover os quatro frascos T75 com cultura expandida do agitador orbital nos dias experimentais 1, 2 e 3. Combinar o conteúdo dos quatro balões T75, misturar bem e pipetar 1 ml da cultura bacteriana para uma cubeta.
      1. Prepare uma solução em branco adicionando 1 mL de caldo LB estéril a uma cubeta. Medir a densidade óptica da cultura bacteriana a 600 nm (OD600 nm) com um espectrofotómetro.
        NOTA: O ODalvo 600nm é 0,6 ± 0,02. Se o diâmetro externode 600 nm da cultura bacteriana for inferior ao valor-alvo, continuar a incubação conforme descrito no passo 1.3.1. até que o OD600nm alvo de 0,6 ± 0,02 seja alcançado. Se o OD600nm for superior a 0,6, dilua a cultura bacteriana com caldo LB estéril.
    2. Transfira 80 mL da cultura bacteriana para dois tubos de centrifugação de 50 mL e centrifugue a 3000 x g por 10 min a 4 ° C. Confirme a cultura bem-sucedida verificando se há um pellet visível no fundo de cada tubo.
  4. Preparação da fórmula
    1. Comece a preparação da fórmula às 09:00 nos dias experimentais 1, 2 e 3. Combine 16 mL de fórmula infantil e 8 mL de leite de cachorro na proporção de 2:1 em um tubo de centrífuga estéril de 50 mL.
    2. Remover o sobrenadante dos dois tubos de centrifugação de 50 ml que contêm cultura bacteriana peletizada (passo 1.3.2).
    3. Ressuspenda completamente cada um dos dois pellets em 2 mL da mistura de fórmula e transfira a ressuspensão para a mistura de fórmula para fazer 24 mL da fórmula NEC.
      NOTA: A concentração bacteriana final na fórmula NEC deve estar entre 4 e 5 x 109 UFC/mL.
    4. Rotule seis tubos de centrífuga de 50 mL para cada um dos seis pontos de tempo de alimentação (10:00, 13:00, 16:00, 19:00, 22:00, 07:00).
    5. Pipete 4 mL da fórmula NEC em cada tubo marcado.
    6. Prepare seis alíquotas descartáveis de LPS (5 mg / mL) e armazene em microtubos de baixa ligação a -20 ° C. Adicione LPS (ver NOTA para concentração) à fórmula NEC imediatamente antes de alimentar em cada ponto de tempo.
      NOTA: A quantidade de LPS adicionada à fórmula NEC é baseada no peso corporal médio dos filhotes alimentados com fórmula calculado às 07:00 de cada dia, usando uma dosagem de 5 μg de LPS por grama do peso corporal dos filhotes. A concentração final de LPS varia com o peso corporal. Por exemplo, com um volume de alimentação de 80 μL e um peso médio de coorte de filhotes de 2 gramas, a concentração de LPS na fórmula seria de 0,125 mg/mL.
  5. Alimentação
    NOTA: No dia experimental 1, os camundongos a serem colocados no modelo NEC são colocados em jejum por 3 h após a separação de sua mãe. A primeira alimentação de fórmula NEC é às 10:00 e continua a cada 3 h até as 22:00. Nos dias experimentais 2 e 3, os camundongos são alimentados às 07:00, 10:00, 13:00, 16:00, 19:00 e 22:00. Os camundongos não são alimentados no dia experimental 4.
    1. Imediatamente antes de alimentar os camundongos, descongele e vortex uma alíquota de LPS por 15 s. Adicione a quantidade apropriada de LPS com base no peso médio dos camundongos ao tubo preparado de 4 mL da fórmula NEC (consulte a etapa 1.4.6 para cálculo) e misture bem por pipetagem.
    2. Encha uma seringa de 1 mL com fórmula NEC e conecte uma linha de cateter central de inserção periférica neonatal (PICC). Certifique-se de que não há bolhas ou ar na seringa ou na linha PICC.
    3. Administre a fórmula NEC aos filhotes por gavagem oral com a linha PICC.
      1. Contenha suavemente cada filhote pela pele solta na base do pescoço e segure o mouse na posição vertical. Usando uma pinça, guie a extremidade distal da linha PICC para a orofaringe e esôfago, posicionando a ponta da linha PICC dentro do estômago.
        NOTA: A distância de inserção da linha PICC é igual à distância do canto da boca até o topo da mancha de leite no estômago. O ponto de inserção ideal deve então ser claramente marcado na linha PICC usando um marcador permanente.
      2. Se for sentida resistência significativa durante a inserção da linha PICC, remova a linha PICC, reposicione e tente novamente a inserção com cuidado.
      3. Dispense 8 μL de fórmula NEC lentamente no estômago, monitorando o filhote de perto durante toda a alimentação em busca de sinais de aspiração. Observe o aparecimento de uma mancha branca de leite para confirmar o parto gástrico bem-sucedido.
      4. Remova a linha PICC. Observe o filhote em busca de dificuldade para respirar ou êmese. Se o filhote regurgitar a fórmula, seque a boca e o nariz com um lenço umedecido de laboratório com baixo teor de fiapos.
    4. Repita este processo em todos os momentos de alimentação.
    5. Duas vezes ao dia, sujeite os filhotes à hipóxia por 10 minutos imediatamente após os horários de alimentação das 13:00 e 19:00.
      1. Após duas mamadas por dia, coloque os filhotes em uma câmara de hipóxia conectada a um tanque de gás contendo 95% de nitrogênio e 5% de oxigênio. Abra a válvula do tanque e monitore os níveis de oxigênio dentro da câmara de hipóxia selada usando um monitor portátil. Quando a câmara de hipóxia atingir 5%± 0,5% de oxigênio, mantenha os filhotes nesse nível de oxigênio por 10 min.
        NOTA: A taxa de fluxo deve ser otimizada para diminuir de 20% para 5% de oxigênio a uma taxa constante e controlada durante um período de 2 minutos.
    6. Observe os filhotes de camundongos entre as mamadas em busca de sinais de dificuldade respiratória, descoloração pálida ou apneia. Se esses sinais estiverem presentes, remova o filhote afetado da câmara de hipóxia, observe cuidadosamente a recuperação e, se necessário, sacrifique os filhotes de acordo com a política da IACUC.
    7. Continue a alimentação por sonda oral e a exposição à hipóxia em pontos de tempo programados durante as 72 horas de duração total do modelo NEC.
      NOTA: Se o dia experimental 1 começar na segunda-feira às 10:00, o ponto final de 72 h ocorrerá às 10:00 na quinta-feira. Isso é designado como dia 4 do modelo. Os camundongos não são alimentados às 07:00 no dia 4 do modelo e são sacrificados neste ponto final das 10:00 para coleta de tecido.
  6. Eutanásia de animais e coleta de tecidos
    1. Na manhã do dia 4 do modelo, pese e registre o sexo de cada filhote e, em seguida, faça a eutanásia de acordo com as diretrizes da IACUC.
    2. Após a eutanásia, colete o sangue de cada filhote em um tubo separador de soro contendo um ativador de coágulo e gel.
    3. Centrifugue a 16.000 x g por 20 min a 4 °C para separar o soro. Pipete o soro para tubos de 1,7 ml rotulados e conserve a -80 °C.
    4. Faça uma incisão na linha média de 1-2 cm através da parede abdominal e do peritônio para expor o trato gastrointestinal. Inspecione o intestino exposto em busca de características marcantes da ECN, incluindo distensão, eritema, acúmulo de gás dentro da parede intestinal (pneumatose intestinal) e bolhas de ar visíveis.
    5. Identifique e ressece o duodeno através do reto distal. Coloque o tecido em uma placa de Petri no gelo. Use solução salina tamponada com fosfato (PBS) gelada para enxaguar o intestino.
    6. Identifique o ceco e corte proximalmente para separar o ceco e o cólon do intestino delgado. Separe as peças começando no íleo distal e trabalhando em direção ao jejuno. Coloque um pedaço de 1 cm em um tubo contendo tampão de lise de RNA e grânulos de óxido de zircônio de 1,5 mm no gelo para análise transcricional.
      1. Lave um pedaço de 1,5 cm com uma seringa contendo PBS acoplada a uma agulha de ponta romba de 24 G e, em seguida, coloque-o em um tubo de microcentrífuga contendo 1 mL de paraformaldeído a 4% (PFA). Congele um pedaço de intestino de 1 cm e armazene a -80 ° C para análise de proteína. Congele um pedaço de intestino de 1 cm e armazene a -80 ° C para quaisquer ensaios adicionais.
    7. Processe o tecido coletado no tampão de lise de RNA em um batedor de esferas (5,50 m/s, 1,0 min., ciclo = 1,0, pausa de permanência: 10 s, 4 °C) para homogeneizar o tecido e, em seguida, armazene a -80 °C.
  7. Fixação tecidual
    1. Coloque os pedaços de tecido coletados em 4% de PFA em um balancim a 4 ° C para fixar por 24 h. Após 24 h, remova 4% de PFA de cada tubo e substitua por 1 mL de PBS para lavar o tecido. Retorne os tubos ao balancim a 4 °C por 15 min. Repita a lavagem PBS uma vez.
      1. Remova o PBS e adicione 1 mL de etanol a 50% a cada tubo e retorne os tubos ao balancim a 4 ° C por 15 min. Remova o etanol a 50% e adicione 1 mL de etanol a 70% e armazene a 4 ° C até que o tecido possa ser processado em blocos histológicos de parafina.
        NOTA: Segmentos intestinais adicionais ou amostras de fezes podem ser coletados conforme necessário para análise posterior.

2. Isolamento de células imunes da lâmina própria

NOTA: Este protocolo é otimizado para o isolamento de células da lâmina própria de camundongos neonatais com aproximadamente uma semana de idade. Se forem necessárias amostras de referência para a citometria de fluxo espectral, podem ser utilizados desmame (semanas pós-natais 3-4). Para amostras de desmame, dobrar todos os volumes de reagentes especificados no protocolo.

  1. Preparação de reagentes
    1. Prepare 1x solução salina balanceada de Hank sem Ca2+ e Mg2+ (HBSS W/O) contendo 10mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES) e armazene em temperatura ambiente.
    2. Preparar o tampão de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) dissolvendo albumina de soro bovino (BSA) a 5% em PBS + ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 5 mM e conservar a 4 °C.
    3. Um dia antes de realizar o isolamento das células da lâmina própria, prepare a solução de pré-digestão adicionando 5mM de EDTA, 5% de soro fetal bovino (FBS) e 1 mM de ditiotreitol (DTT) ao HBSS W/O.
    4. Prepare a solução de digestão imediatamente antes de realizar o isolamento da célula da lâmina própria, suplementando o meio Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI) com 10% de FBS e mg / mL de colagenase IV.
      NOTA: HBSS W/O pode ser preparado com antecedência e armazenado em temperatura ambiente. O tampão FACS deve ser preparado com antecedência e armazenado a 4 °C. As soluções de pré-digestão e digestão devem ser preparadas frescas imediatamente antes de se efectuar o isolamento da lâmina própria e mantidas em gelo.
  2. Coleta e preparação do tecido intestinal para a digestão
    1. Localize o ceco e faça o transecto proximalmente para remover o ceco e o cólon. Extirpar 2-3 cm do intestino delgado distal (íleo) e colocá-lo em HBSS sem sentido gelado numa placa de Petri (retomando do passo 1.6.5).
    2. Usando uma agulha de ponta romba de 24 G presa a uma seringa, lave o lúmen intestinal completamente com HBSS sem fio gelado enquanto estabiliza o tecido com uma pinça. Confirme visualmente se o lúmen intestinal está livre de fezes após a lavagem.
    3. Remova cuidadosamente qualquer tecido conjuntivo remanescente do segmento intestinal usando uma pinça fina ou tesoura.
    4. Corte o intestino longitudinalmente para abrir e, em seguida, corte transversalmente em segmentos de 1-1. cm.
  3. Dissociação da lâmina própria
    1. Transfira os segmentos intestinais para um tubo de centrífuga de 1 mL contendo 1 mL de solução de pré-digestão que foi resfriada em gelo.
    2. Incubar a amostra a 37 °C durante 20 min com rotação contínua para facilitar a dissociação dos tecidos.
    3. Gire suavemente o tubo e, em seguida, despeje o conteúdo através de um filtro de células de 10 μm colocado sobre um tubo de centrífuga de 5 mL.
      NOTA: O filtrado coletado através do filtro de 10 μm contém linfócitos intraepiteliais (IELs) e pode ser usado para análise a jusante, se desejado.
    4. Transfira fragmentos de tecido para um novo tubo de centrífuga de 15 mL contendo 10 mL de solução de digestão pré-aquecida a 37 ° C. Em seguida, incubar a amostra durante 40 min a 37 °C com rotação contínua.
    5. Transfira toda a amostra para um tubo de dissociação de tecido automatizado e execute o programa de dissociação que consiste em quatro ciclos de rotação de 15 s cada, alternando entre as direções no sentido horário e anti-horário.
      NOTA: Uma alternativa a um dissociador de tecido automatizado é triturar manualmente o tecido intestinal usando as pontas foscas de duas lâminas de microscópio. Se estiver usando este método, aplique uma pressão suave e uniforme para evitar estresse mecânico excessivo, pois isso pode reduzir significativamente a viabilidade celular.
    6. Agitar suavemente a suspensão celular e, em seguida, centrifugar as amostras no tubo de dissociação tecidual a 300 × g durante 5 min a 4 °C.
    7. Aspire cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet e, em seguida, ressuspenda as células em mL de tampão FACS gelado.
    8. Coloque um filtro de células de 10 μm em um tubo de centrífuga de 5 mL. Transfira a suspensão de células ressuspensas através do filtro e, em seguida, lave o filtro com um mL adicional de tampão FACS gelado.
    9. Conte as células e avalie a viabilidade usando azul de tripano ou um corante de viabilidade. Centrifugar o volume necessário para a citometria de fluxo a 30 × g durante 5 min a 4 °C. Use células imediatamente para aplicações a jusante para preservar a viabilidade e a expressão do marcador.

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Resultados

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O modelo murino neonatal de ECN descrito neste protocolo replica as principais características da doença. A análise de sobrevida de Kaplan-Meier (Figura 1A) revelou uma redução significativa na sobrevida no grupo de tratamento com NEC em comparação com os controles alimentados com barragens (9/21 vs. 8/8; p = 0,0063). A inspeção macroscópica dos intestinos dos camundongos submetidos ao modelo (Figura 1B) demonstrou cara...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo integra um modelo murino neonatal fisiologicamente relevante de NEC com isolamento de células imunes de lâmina própria, fornecendo uma plataforma abrangente para investigar as respostas imunes da mucosa durante a inflamação intestinal. Ao combinar exposições clinicamente relevantes, como microbioma entérico de casos de NEC humanos, estresse hipóxico e alimentação com fórmula, este modelo recapitula a patogênese complexa e multifatorial observada na doença humana

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Divulgações

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Os autores declaram não haver conflito de interesse relacionado a este manuscrito.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este manuscrito foi apoiado por R01DK124614, R01HD105301, DP1DK140012, Chan Zuckerberg Initiative Grant número 2022-316749, Yang Biomedical Scholar Award e o Departamento de Pediatria da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1 mL Syringe-Tuberculin Slip TipBecton Dickinson309659Syringe for formula feeding
1.5 mL semi-micro Disposable CuvettesBRAND GMBH + CO KG759085D
1.7 ml Microtubes ClearAxygen - Corning Inc.MCT-175-CNonpryogenic & Rnase-/Dnase-free
5% Oxygen, Balance Nitrogen Certified Reference Material, Size 200 High Pressure Steel Cylinger, CGA 580AirgasX02NI95C2003186
Anti-Mo CD16/CD32 Purified Clone: 93eBioscience Inc. 14-0161-85
Anti-Mouse CD16/CD32 Purified Clone: 93eBioscience Inc. 14-0161-86
APC anti-mouse Ly-6C Clone: HK1.4 Isotype: Rat IgGcBioLegend128015
autoMACS Rinsing SolutionMiltenyi Biotec130-091-222
BB515 Rat Anti-CD11b Clone: M1/70BD Biosciences564455
BB700 Rat Anti-Mouse CD4 Clone: RM4-5BD Biosciences566408
BD Microtainer SSTBecton Dickinson365867Serum Tube
BIOTIX Rainin LTS Compatible Racked Filter Tips, p1200Fisher Scientific12-111-365
BIOTIX Rainin LTS Compatible Racked Filter Tips, p20Fisher Scientific12-111-366
BIOTIX Rainin LTS Compatible Racked Filter Tips, p200Fisher Scientific12-111-362
Brilliant Stain BufferBD Biosciences563795
BUV615 Rat Anti-Mouse Ly-6G Clone: 1A8BD Biosciences751263
BV650 Rat Anti-Mouse I-A/I-E Clone: M5/114.15.2BD Biosciences563415
C57BL/6J Neonatal MiceThe Jackson Laboratory000664
CD45-VioGreen mouseMiltenyi Biotec 130-102-412
CD64 Antibody, anti-mouse, PE-Vio 770, REAfinity Clone REA286Miltenyi Biotec 130-119-659
CFX Opus Real-Time PC Systems Bio-Rad12011319
Collagenase Type 4Worthington Biochemical Corporation LS004188
DL-dithiothreitol SigmaD9779-5g
eBioscience FOXP3/Transcription Factor Staining Buffer SetLife Technologies Corp. 00-5523-00
EDTA (0.5M), pH 8.0Quality Biological Inc351-027-721
Esbilac Puppy Milk ReplacerPet-Ag, Inc.99502-1Puppy Milk
Fisherbrand Disposable CuvettesFisher Scientific14-955-127
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 10mLFisher Scientific13-678-11E
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 25mLFisher Scientific13-678-11
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 50mLFisher Scientific13-678-11F
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 5mLFisher Scientific13-678-11D
Genie Temp-Shaker 300USA Scientific, Inc.SI-G1600
gentleMACS Dissociator (protocol; m_intestine-01)Miltenyi Biotec 130-093-235
gentleMACS  C TubesMiltenyi Biotec 130096334
Ghost Dye Red 780 Viability DyeTonbo Biosciences13-0865-T100
Glycerol ReagentPlusSigma-AldrichG7757-500ML
GraphPad Prims Software, Version 10.0GraphPadN/A
Greiner Bio-One Round Bottom Polypropylene Culture Tube with Two-Position Vent StopperFisher Scientific07-000-212
Handi+ Oxygen analyzerMaxtecN/A
Hanks' Balanced Salt SolutionGibco141650-095
HEPES BufferMediatech, Inc. 25-060-CI
Hypoxia ChamberBillups-Rothenburg, Inc.N/A
ImageJSchneider et al., 2012N/A
Integra Miltex MeisterHand Iris Scissors, 10.2cmFisher Scientific12-460-655
Integra Miltex MeisterHand Iris Scissors, 9cmFisher Scientific12-460-598
Integra Miltex™ Swiss Jeweler-Style ForcepsFisher Scientific12-460-110
Isolette Infant IncubatorAir-Shields VickersC100-200-2 Series 02Incubator for mice
Kimtech Science Kimwipes Delicate Task WipesKimberly-Clark34120
LPSSigma-AldrichL3129-10mg
Luria Broth Broth, Miller Molecular Genetics PowderFisher ScientificBP1426-500
MACS BSA Stock SolutionMiltenyi Biotec 130-091-376
MACSmix Tube RotatorMiltenyi Biotec 130-090-753
Microcentrifuge TubesThermo Scientific34511.5 ml, clear, graduated, sterile
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermoFisher ScientificND-ONEC-W
Ohaus scout portable balanceFisher Scientific30253024
ParaformaldehydeThermo ScientificJ

Referências

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