Técnicas de sutura para reconstrução vascular em transplante hepático ortotópico de camundongo

Resumo

As reconstruções vasculares em receptores, incluindo a veia cava inferior supra-hepática (SHIVC), a veia porta e a veia cava inferior infra-hepática (IHIVC), são os principais procedimentos para o transplante hepático ortotópico de camundongo bem-sucedido. Fornecemos técnicas de sutura e dicas para reconstrução de SHIVC e IHIVC no modelo de transplante de fígado de camundongo.

Resumo

A pesquisa translacional usando modelos animais é essencial para abordar as questões clínicas em transplantes de órgãos. Embora o transplante hepático ortotópico (TH) de camundongos seja uma ferramenta útil para investigar os mecanismos de regeneração hepática, lesão de isquemia-reperfusão e respostas imunes após TH, os desafios técnicos nesse procedimento restringem sua viabilidade. Os principais aspectos para o sucesso do TH ortotópico em camundongos são a reconstrução vascular em receptores, incluindo a veia cava inferior supra-hepática (SHIVC), a veia porta (PV) e a veia cava inferior infra-hepática (IHIVC). Além das dificuldades técnicas na reconstrução desses vasos, a limitação temporal da fase anepática em até 20 min torna esse procedimento mais desafiador. Embora uma técnica de balonete possa ser usada para reconstrução de VP, uma técnica de sutura segura e rápida é necessária para reconstruir o SHIVC durante a fase anepática. Para a reconstrução do IHIVC, embora as técnicas de manguito e sutura sejam aplicáveis, a técnica de sutura leva a um tempo de operação mais curto na cirurgia do doador e na preparação da mesa traseira e pode manter um lúmen vascular maior do que a técnica do manguito. Fornecemos aqui diretrizes para reconstrução de SHIVC e IHIVC usando uma técnica de sutura para facilitar o LT ortotópico de camundongo.

Introdução

Com os avanços nas técnicas cirúrgicas, drogas imunossupressoras e medicina intensiva, o transplante de órgãos foi estabelecido como uma terapia padrão para doenças de órgãos em estágio terminal. O transplante de fígado (TH) é atualmente o único tratamento curativo para doença hepática terminal e certas malignidades hepáticas. A pesquisa translacional usando modelos animais é essencial para abordar questões clínicas em TH. Como vários animais geneticamente modificados estão disponíveis em modelos de camundongos, o LT ortotópico de camundongo é uma ferramenta importante para explorar insights mecanicistas sobre regeneração hepática, lesão de isquemia-reperfusão e respostas imunes após LT¹. No entanto, como os desafios técnicos neste procedimento restringem sua viabilidade, os grupos de pesquisa que trabalham neste modelo são limitados 2,3,4,5,6,7,8,9,10.

O LT ortotópico de camundongo foi descrito pela primeira vez por Qian et al. em 1991². O procedimento cirúrgico, desenvolvido pela aplicação de técnicas ortotópicas de TH nos ratos, compreende três etapas: cirurgia do doador, preparo do enxerto hepático na mesa traseira e operação do receptor⁶. As partes tecnicamente desafiadoras do LT de camundongo são a reconstrução biliar e vascular em receptores, incluindo a veia cava inferior supra-hepática (SHIVC), a veia porta (PV) e a veia cava inferior infra-hepática (IHIVC). Além das técnicas cirúrgicas, a fase anepática do pinçamento à liberação do fluxo PV deve ser de 20 minutos para o sucesso do LT ortotópico do camundongo ^2,6,11. Além disso, em nossa experiência, o tempo total de reperfusão desde o pinçamento do PV até a liberação do IHIVC deve ser de 30 minutos para alcançar a sobrevida a longo prazo no LT de camundongos. Isso é consistente com o relato anterior para LT de rato, descrevendo o tempo preferível de estado hemodinâmico sistêmico instável em aproximadamente 30 min¹². Assim, dificuldades técnicas e limitações de tempo no LT de camundongos tornam esse procedimento mais desafiador.

Embora a técnica do balonete possa ser usada para reconstrução de VP, uma técnica de sutura é necessária para reconstruir o SHIVC durante a fase anepática. Portanto, uma técnica de sutura segura e rápida é essencial para a anastomose da SHIVC. Embora as técnicas de manguito e sutura sejam aplicáveis para a reconstrução de IHIVC, a maioria dos estudos anteriores empregou uma técnica de manguito 5,6,7,11,13. No entanto, o uso da técnica de manguito na reconstrução do IHIVC leva a um maior tempo de operação nas operações doadoras e de mesa traseira. Além disso, a inserção de um manguito pode ser mais difícil do que a sutura para iniciantes devido à curta margem da veia cava inferior do receptor (VCI)¹³.

Fornecemos aqui diretrizes para a reconstrução bem-sucedida de SHIVC e IHIVC usando uma técnica de sutura em LT ortotópico de camundongo.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Experimentação Animal da Universidade de Kyoto e realizados de acordo com as Diretrizes de Proteção Animal da Universidade de Kyoto. As cirurgias em camundongos foram realizadas sob anestesia geral por inalação de isoflurano. O vaporizador foi ajustado para isoflurano a 3% com oxigênio de 1 L/min para induzir a anestesia. Após laparotomia, o isoflurano foi reduzido para 1% para manter a anestesia. As ferramentas microcirúrgicas utilizadas neste protocolo, incluindo aquelas usadas em nosso protocolo de reconstrução vascular publicado anteriormente¹³, estão listadas na Tabela de Materiais. Um microscópio foi necessário para realizar o LT ortotópico de camundongo¹³. Uma almofada de aquecimento foi usada para manter a temperatura corporal do camundongo¹³.

1. Animais

1. Use um mouse pesando 25-30 g.
   NOTA: Embora possam ser usados camundongos pesando 20-35 g, aproximadamente camundongos de 25 g são adequados para doadores e receptores. Como a idade e a esteatose hepática afetam os resultados do LT, camundongos apropriados devem ser selecionados para cada propósito dos experimentos.

2. Dissecção do IHIVC no fígado do doador

1. Isole o IHIVC do tecido circundante. Sele as veias lombares com um eletrocautério, se necessário.
2. Remova a gordura do IHIVC para expor a parede do vaso.
3. Dissecar a IHIVC acima da artéria e veia renal direita (Figura 1).
   NOTA: Se a técnica de sutura for usada para a reconstrução da IHIVC, a dissecção da veia renal direita na área doadora é desnecessária. A cirurgia do doador geralmente leva menos de 30 minutos ao aplicar a técnica de sutura para reconstrução do IHIVC.

3. Dissecção do SHIVC no fígado do doador

1. Após a perfusão da solução de armazenamento da VP, corte as paredes anterior e posterior da SHIVC (Figura 1).
   NOTA: O isolamento da parede posterior do SHIVC da cruz do diafragma é crucial para obter uma margem suficiente para a reconstrução.

4. Preparação da mesa traseira do enxerto de fígado

1. Prenda um manguito ao VP, conforme descrito anteriormente¹³.
2. Prenda um clamp clipe ao IHIVC.
3. Vire o fígado de cabeça para baixo e exponha o coto de SHIVC.
4. Coloque uma sutura de estada com náilon 10-0 em ambas as bordas do SHIVC e segure-as com grampos de buldogue.
   NOTA: A preparação da mesa traseira leva aproximadamente 10 minutos sem uma fixação de manguito no IHIVC.

5. Reconstrução do SHIVC no receptor

1. Circunde o SHIVC com seda 4-0 para retrair o fígado para baixo.
2. Reduza a concentração de isoflurano para 0,3-0,5% antes da fase anepática.
3. Prenda o IHIVC acima da veia renal direita usando um microserrefine.
4. Prenda o PV usando uma pinça Pean¹³.
5. Prenda o SHIVC com o diafragma usando um grampo bulldog enquanto retrai o fígado para baixo.
6. Corte a parede anterior do SHIVC e, em seguida, corte a parede posterior (Figura 1).
   NOTA: O isolamento da parede posterior da SHIVC da cruz do diafragma no receptor e doadores é crucial para obter uma margem suficiente para a reconstrução.
7. Depois de dissecar PV e IHIVC próximo ao fígado do receptor, remova o fígado do receptor (Figura 1).
8. Coloque o enxerto de fígado preparado na cavidade abdominal do receptor e coloque o fígado adequadamente.
9. Coloque e ligue uma sutura de estada na extremidade direita do SHIVC e segure-a com uma pinça de buldogue para puxar a sutura em direção ao lado ventral do receptor (Figura 2A).
   NOTA: O lado direito do SHIVC encontra-se profundamente na cavidade abdominal. Puxe o lado direito do SHIVC para que a parede posterior seja colocada na frente.
10. Coloque e ligue uma sutura de estada na extremidade esquerda do SHIVC.
11. Iniciar sutura contínua com método intraluminal na parede posterior da SHIVC do lado esquerdo (Figura 2A).
12. Ao atingir a extremidade direita da parede posterior do SHIVC, gire a mesa de operação 90° no sentido anti-horário.
    NOTA: Gire a mesa de operação 90° no sentido horário para cirurgiões canhotos. Alternativamente, os cirurgiões podem suturar a parede anterior da frente para trás sem rotação.
13. Continue a sutura com uma sutura excessiva na parede anterior do SHIVC do lado direito (Figura 2A).
    NOTA: São necessários aproximadamente seis a oito pontos para a parede posterior e oito a dez pontos para a parede anterior. A sutura na extremidade esquerda da parede anterior é importante para evitar sangramentos.
14. Após lavar o ar no SHIVC, ligue a sutura contínua com a sutura de permanência no lado esquerdo do SHIVC.
15. Gire a mesa de operação 90° no sentido horário para restaurar a posição do destinatário à posição original.
16. Após a reconstrução e reperfusão da VP, despinçar a SHIVC.
    NOTA: Demora de 10 a 15 minutos para a reconstrução do SHIVC. Como o tempo de pinçamento da VP pode afetar os resultados do LT, o tempo anepático (do clampeamento da VP ao despinçamento da VP) deve ser fixado por até 20 minutos com base na habilidade do cirurgião. Após a reperfusão da VP, o isoflurano é redefinido para 1% para manter a anestesia.

6. Reconstrução do IHIVC no receptor

1. Coloque e ligue suturas de estada com náilon 10-0 em ambas as extremidades do IHIVC.
2. Segure as suturas de permanência com grampos de buldogue para puxar para os dois lados, de modo que o coto IHIVC fique largo e reto.
3. Inicie a sutura contínua com um método intraluminal no lado esquerdo da parede posterior (Figura 2B).
4. Depois de chegar ao lado direito, continue suturando repetidamente na parede anterior do lado direito do receptor (Figura 2B).
   NOTA: A rotação da mesa de operação não é necessária para a reconstrução do IHIVC. Aproximadamente seis a oito pontos para cada parede posterior e anterior são suficientes.
5. Lave o ar no IHIVC.
6. Solte os clipes IHIVC do lado do enxerto e, em seguida, do lado receptor.
   NOTA: A ligadura da sutura contínua com a sutura de permanência no lado esquerdo do IHIVC é desnecessária. Demora de 8 a 10 minutos para a reconstrução do IHIVC. O tempo total de reperfusão desde o pinçamento da VP até a liberação da IHIVC deve ser de 30 min.

Resultados

Um receptor de camundongo se recuperou da anestesia em 30 minutos quando a reconstrução vascular bem-sucedida foi realizada usando um enxerto hepático normal sem um tempo isquêmico frio prolongado. Uma taxa de sucesso de >90% pode ser considerada qualificada para este procedimento. Examinamos as curvas de aprendizado em um cirurgião para taxas de recuperação pós-LT (recuperação da anestesia), tempo anepático (do pinçamento à liberação do fluxo da VP) e tempo total de reperfusão (do clampeamento da VP à liberação do fl...

Discussão

Este artigo documentou as técnicas detalhadas para a reconstrução do SHIVC e IHIVC com uma técnica de sutura em LT ortotópico de camundongo. A reconstrução vascular, especialmente a anastomose SHIVC, que requer uma técnica de sutura durante a fase anepática, é uma habilidade crucial para o sucesso do LT em camundongos. Além da técnica de sutura segura e protegida, a sutura rápida é necessária para manter a fase anepática dentro de 20 min para resultados reprodutíveis no LT ortotópico de ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10-0 Micro sutura	Corporação de Instrumentos Cirúrgicos AROS	T4A10N07
Cateter intravenoso de 16 G	TERUMO	SR-FF2032	Manguito IHIVC
Cateter intravenoso de 20 G	TERUMO	SR-FF1651	Manguito fotovoltaico
8-0 trança de seda	Natsume Seisakusho	CR9-80B2	8-0 seda
Solução de Armazenamento a Frio Belzer UW	Astellas		fluido de preservação de órgãos
Braçadeira de buldogue	B BRAUN	FB329R	Braçadeira de buldogue
Grampos de buldogue	Natsume Seisakusho	C-42-S-2	Para fixação SHIVC
Camundongos C57BL/6	Bio Serviço Oriental
Fórceps	Ferramentas de Belas Ciências	11231-30
Solução para inalação de isoflurano	Viatris		Anestésico
Pontas Micro Rombas 0.1 mm x 0.06 mm	Ferramentas de Belas Ciências	11253-20	Micropinças retas
Micro tesoura	Muranaka Instrumentos Médicos	451-609-13
Micro serrefine	Ferramentas de Belas Ciências	18055-03	Para fixação IHIVC
Micro serrefine	Ferramentas de Belas Ciências	18055-04	Para fixação fotovoltaica
Aplicador de grampo Micro Serrefine com trava	Ferramentas de Belas Ciências	18056-14	Aplicador de clipe de vaso
Micro Serrefines	Ferramentas de Belas Ciências	18055-4	Clipe de vaso
Micro sutura fetal	Aesculap	FD281R
Aplicador de grampo Micro-serrefine	Ferramentas de Belas Ciências	18056-14
Porta-agulhas	Aesculap	FD231R
Lâminas sobressalentes nº 11	Máquina de barbear FEATHER	11	Lâminas
Tesoura oftálmica, cabo redondo	B BRAUN	FD103R	Microtesoura
Recipiente de plástico retangular	Daiso		10 cm de comprimento, 15 cm de largura e 6 cm de altura
Dicas SuperGrip	Ferramentas de Belas Ciências	00649-11	Micropinças curvas
SZX7	Olimpo	SZX7	Microscópio
Tesoura Vannas	Instrumentos de precisão mundiais	501232
Clipe vascular	Corporação Médica BEAR	TKF-1-30	Para pinçamento IHIVC no enxerto de fígado