Artigo de método

Formulação de doses de traçadores de vitamina A para administração a sujeitos humanos usando a Técnica de Diluição de Isótopos de Retinol

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DOI:

10.3791/69240

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31 de março de 2026

 , 
1Human Nutrition and Exercise Research Centre, Newcastle University, 2Fera Science Ltd

Neste artigo

Resumo

A preparação da vitamina A estável marcada com isótopos, necessária para a técnica de diluição de isótopos de retinol, precisa estar em conformidade com os padrões de segurança alimentar. O protocolo mostra a preparação dosificada em óleo vegetal em concentrações adequadas para o sistema de administração escolhido e para a plataforma analítica aplicada.

Resumo

A técnica de diluição de isótopos de retinol (RID) depende da administração de traçadores de vitamina A marcados isotopicamente a sujeitos humanos. Aqui, apresentamos um método para orientar equipes de pesquisa sobre como preparar traçadores estáveis de isótopos da vitamina A tanto para estudos de pesquisa quanto para pesquisas populacionais. O artigo oferece uma visão geral da preparação, obtenção dos materiais, equipamentos necessários e procedimentos para garantir que os rastreadores sejam seguros para consumo humano. Traçadores estáveis de isótopos da vitamina A podem ser obtidos comercialmente e geralmente são marcados com deutério [2H] ou carbono-13 [13C], com pureza isomérica >95% e enriquecimento isotópico >99%. A preparação dos traçadores isótopos estáveis da vitamina A envolve a dissolução do traçador em óleo vegetal comestível por meio de sonicação e calor. Os traçadores precisam ser preparados em uma concentração que esteja bem dentro dos limites volumétricos do sistema de entrega. Por fim, o traçador é alicotado em frascos de vidro âmbar estéreis, e as concentrações do traçador são confirmadas espectrofotometricamente.

Introdução

Para possibilitar o monitoramento eficaz dos programas de intervenção que visam reduzir a deficiência de vitamina A, o método de diluição de isótopos de retinol (RID) foi aplicado com sucesso para fornecer informações sobre as reservas totais de vitamina A do corpo (TBS) em vários grupospopulacionais 1,2,3,4. Embora o retinolsérico 5, a proteína de ligação sérica do retinol (RBP) 6,7,8 e os testes de resposta à dose relativa modificada(MRDR) 9 sejam frequentemente usados para confirmar a deficiência de vitamina A, o RID é o único método que quantifica com precisão as reservas totais de vitamina A do corpo em todo o espectro — desde deficiência subclínica atétoxicidade 3,10. Ao administrar uma dose conhecida de vitamina A marcada e medir sua diluição no plasma após o equilíbrio, o método RID fornece estimativas precisas das reservas de TBS e vitamina Ahepática 11,12. Importante destacar que o método RID permanece confiável mesmo em populações com inflamação, tornando-o indispensável para avaliar a eficácia da intervenção e avaliar riscos de toxicidade em programas sobrepostos de suplementação efortificação 13,14.

Para realizar o método de DRI, a vitamina A marcada isotopicamente precisa ser administrada como uma dose oral de éster de retinila, que na maioria dos casos é acetato de retinil dissolvido em óleo vegetal comestível. A maioria dos laboratórios obtém vitamina A marcada com isótopos de fornecedorescomerciais 1,3,7,15,16,17,18,19,20,21,22. Quase todos os traçadores de isótopos de vitamina A comercialmente disponíveis são marcados usando isótopos estáveis de carbono-13 [13C] ou deutério [2H] (Tabela 1). A escolha da dose isótopica aplicada depende do instrumento analítico utilizado para determinar a concentração sérica ou plasmática de retinol marcado em massa. Enquanto a cromatografia gasosa-espectrometria de massas (GC-MS) e a cromatografia líquida-espectrometria de massa tandem (LC-MS/MS) podem analisar tanto [13C] quanto [2H]22,23,24,25,26,27, a espectrometria de massa de cromatografia gasosa-combustão e razão isotópica (GC-C-IRMS) só pode analisar traçadores de retinol marcados com [13C] 4,25,28. Os limites de detecção do instrumento analítico escolhido, do grupo-alvo (crianças ou adultos) e a duração da investigação determinarão o tamanho da dose a seraplicada 3,25,29. Até o momento, as doses de isótopos aplicadas variaram de 0,3 a 4,3 mg de retinol equivalente (ER; equivalente a 1 - 15 μmol RE) emcrianças de 3, 4, 30 e de 0,6 a 10,0 mg de RE (equivalente a 2 - 35 μmol de RE) emadultos entre 2, 3, 31, 31, com estudos mais recentes aplicando doses menores entre 0,3 e 0,6 mg de RE (1 - 3 μmol RE) para crianças e 0,6 - 2,0 mg de RE (2 - 7 μmol RE) em adultos. Embora tenham surgido temores de que uma alta massa de vitamina A na dose possa perturbar a cinética subjacente da vitamina A, uma análise recente usando modelagem compartimental confirmou que doses de isótopos de até 7 μmol de RE para crianças ou 14 μmol de RE para adultos não devem afetar a precisão das previsões doTBS 29. Aqui, vamos demonstrar como preparar um traçador marcado com isótopos para aplicação oral no método de DRI, levando em consideração preocupações com a segurança alimentar e obtendo concentrações de dose precisas. A preparação da dose de isótopos é vital para o método de DRT.

Protocolo

O Estudo 1 foi aprovado pelo Serviço Nacional de Ética em Pesquisa, Comitê do Nordeste de Sunderland (REC 09/H0904/20) antes do registro na Rede de Pesquisa Clínica do Reino Unido (UKCRN: 7413). O Estudo 2 foi aprovado pelo Conselho de Ética em Pesquisa da Universidade das Filipinas, Manila (ID IRB: UPMREB 2016-282-01), pelo Conselho de Revisão Institucional da UC, Davis (ID IRB: 903681-2) e registrado em ClinicalTrials.gov (ID: NCT03030339). O Estudo 2 fez parte do projeto GloVitAS financiado pela Fundação Bill e Melinda Gates (OPP1115464: Avaliação do risco de toxicidade por vitamina A devido à fortificação alimentar em larga escala e outras intervenções). Georg Lietz foi o investigador principal do projeto GloVitAS e supervisionou a implementação do estudo de campo. Uma visão geral do protocolo de estudo é apresentada na Figura 1.

1. Critérios de inclusão e exclusão

  1. Para o estudo 1, os critérios fornecidos foram: Critérios de inclusão: Incluir voluntários saudáveis, homens e mulheres, com faixa etária de 18 a 45 anos. Critérios de exclusão: Exclua voluntários com gravidez, tabagismo, pressão alta, diabetes, IMC >30, doenças hepáticas/rins/gastrointestinais, distúrbios metabólicos lipídicos e consumo de multivitamínicos (contendo vitaminas A, C, E) ou suplementos de β-caroteno 3 meses antes do início do estudo.
  2. Para o estudo 2, os critérios fornecidos foram: Critérios de inclusão: Incluir crianças de 12 a 18 meses que permaneceram na área de estudo durante todo o estudo. Critérios de exclusão: Excluir se as crianças não receberam suplementação de vitamina A em alta dose e viveram em áreas que não foram expostas a alimentos fortificados com vitamina A nos mercados locais.

2. Determinar a quantidade total de traçador de isótopos estáveis para RID

  1. Decida a quantidade de traçador de isótopos estáveis que cada sujeito deve receber, levando em conta a pureza isomérica. Recomenda-se o uso de isótopos estáveis da vitamina A com pureza >95% de pureza all-trans, já que a atividade biológica e as vias metabólicas diferem significativamente entre isômeros geométricos. Calcule o nível de dose com base nos equivalentes de retinol (RE). Um exemplo de como isso é calculado é dado na Tabela 2.
  2. Multiplique o nível de dose pelo número total de sujeitos. Número total base de participantes nos cálculos de potência para o tamanho da amostra necessário, mas aumenta com base na perda esperada (veja a Tabela 2 , por exemplo). Aumente a quantidade total de traçador necessário levando em conta perdas de pipeteamento de até 20%.
    NOTA: Como regra, a preparação do isótopo precisa incluir um excesso, pois não é possível recuperar todo o material do frasco. Perdas ocorrerão ainda mais devido à viscosidade do óleo que permanece na ponta externa da pipeta. Para obter volumes precisos da dose durante o entrega, o excesso de óleo na parte externa da ponta da pipeta precisa ser removido. Os operadores podem minimizar as perdas por pipeteamento se a ponta da pipeta não for mergulhada muito fundo no óleo.

3. Determinar a quantidade de óleo vegetal necessária para dissolver o traçador de isótopos estável

  1. Decida qual óleo vegetal usar e o volume da dose por sujeito (Tabela 2). Determine a quantidade de óleo adicionado pelo sistema de administração usado durante a dosagem dos sujeitos.
    NOTA: Usamos óleo de girassol devido ao alto teor de vitamina E, que ajuda na estabilidade da preparação de vitaminaA 32,33. No entanto, outros óleos vegetais foram empregados por outros grupos para satisfazer as normas alimentares locais. Como o RID depende da entrega precisa de traçadores estáveis marcados com isótopos, recomenda-se o uso de uma pipeta de deslocamento positivo para aplicação de dose preparada em óleo comestível. A maioria dos estudos mais recentes utilizou volumes de até 250 μL, especialmente se a dose for administrada a crianças 1,7,23.
  2. Calcule a concentração de dose do traçador de isótopos estáveis no óleo vegetal [mg/mL]. Determine o volume total de óleo vegetal necessário. Calcule o peso do óleo necessário, com base no volume calculado e na densidade relativa do óleo vegetal (veja a Tabela 2 para um exemplo).
    NOTA: Para precisão, recomenda-se pesar o óleo para preparação estável do traçador isotópico. Uma vez calculado o volume total de óleo necessário, o traçador estável marcado como isótopo pode ser solicitado. É importante solicitar que o traçador de isótopos seja enviado em um frasco de volume suficiente que permita à equipe de pesquisa pesar o óleo vegetal diretamente para dentro do frasco que contém o traçador marcado com isótopos.

4. Preparação de traçador estável marcado com isótopos em áreas dedicadas ao preparo de alimentos

  1. Abra cuidadosamente a tampa da garrafa âmbar contendo a quantidade total pré-determinada do traçador de isótopos estáveis e coloque-a em uma balança analítica, que então é reduzida a zero.
  2. Adicione o óleo gota a gota até atingir o peso desejado (com precisão de ± 0,1 g) usando uma seringa estéril de 10 mL.
    NOTA: Como alguns cristais de acetato de retinila podem ficar presos dentro da tampa da garrafa âmbar, a garrafa precisa ser aberta com muito cuidado. Após adicionar o óleo vegetal à garrafa âmbar, a tampa é cuidadosamente colocada de volta na garrafa, que é então sacudida manualmente para resuspender quaisquer cristais de acetato de retinila que restem dentro da tampa.
  3. Coloque a garrafa em um banho-maria sónico com potência ultrassônica: 14 W/L e frequência de operação: 44 kHz. Encha com água acima do nível de óleo na garrafa, mas abaixo do nível da tampa, para evitar que a água entre acidentalmente na preparação.
  4. Sonice a garrafa por 15 minutos antes de misturar cuidadosamente à mão, seguida de sonicar por mais 15 minutos. Deve-se ter cuidado para que a temperatura do banho-maria sonicante não ultrapasse 50 °C.
    NOTA: Usando óleo de girassol para preparação, descobrimos que a isomerização em retinoides cis não ocorre quando a dose é exposta a 50 °C por 30 minutos (veja a Figura 2). No entanto, as preparações devem ser analisadas por HPLC para avaliar a extensão da isomerização térmica.
  5. Coloque a garrafa em um banho-maria aquecida a 50 °C por 30 minutos para dissolver completamente os microcristais.
  6. Pegue uma amostra de 20 μL de óleo para verificar a presença de microcristais sob um microscópio óptico com ampliação de 200x em laboratório. Se houver microcristais presentes, repita o procedimento de sonicação e aquecimento.
  7. Uma vez alcançada a dissolução completa, aliquota a preparação total do óleo em frascos de vidro âmbar estéreis de 2 a 4 mL. Use pipetas de deslocamento positivo para este procedimento para evitar contaminação cruzada.
    NOTA: O volume de traçador de isótopos estável adicionado aos frascos de vidro âmbar pode ser guiado pela taxa diária de recrutamento, por exemplo, se 5 sujeitos forem recrutados por dia e o volume de dose for de 150 μL, o frasco precisa conter volume suficiente para suportar 5 doses mais perdas por pipeteamento: 5 x 150 μL x 1,2 = 900 μL.
  8. Determinar a concentração estável de isótopos em triplicado. Reserve 200 μL de óleo vegetal puro (usado para preparação de um blank espectrofotométrico) e 200 a 350 μL da dose estável do isótopo em frascos âmbar separados de 2 mL durante a preparação do traçador marcado com isótopos estáveis.
    1. Se a concentração de dose for ≤ 0,5 mg de EM, reserve 350 μL do isótopo estável em um frasco âmbar separado de 2 mL. Para concentrações de dose > 0,5 mg de ER, reserve 200 μL da dose estável do isótopo em um frasco âmbar separado de 2 mL.
  9. Cobrir os frascos com um gás inerte (Ar) para atrasar a oxidação potencial do traçador marcado com isótopos, fechem-se firmemente e armazene em uma criobox rotulada com concentração de isótopos, volume de dose (determinada posteriormente), data de preparação e nome do projeto. Guarde a cryobox em um freezer de alimentos a -20 °C até o envio. Nessas condições, a dose de traçador permanece estável por pelo menos 2 anos.

5. Determinação da concentração estável de traçadores de isótopos em laboratório

  1. Dilua o traçador de isótopos estável em 3 frascos volumétricos com n-hexano. Preencha os frascos volumétricos com n-hexano até 1 cm abaixo da linha de calibração antes de adicionar a dose traçadora.
    1. Determine a diluição do traçador de isótopos estável pela dose do traçador. Se a concentração de dose do traçador de isótopos estáveis for ≤ 0,5 mg de ER, dilua 100 μL da dose do isótopo estável em um frasco volumétrico de 50 mL com n-hexano. Se a concentração da dose estiver entre 0,5 - 2 mg de ER, então 50 μL da dose estável do isótopo em um frasco volumétrico de 50 mL com n-hexano. Se a concentração de dose for >2 mg de IR, então 50 μL da dose estável do isótopo em um frasco volumétrico de 100 mL com n-hexano.
    2. Dispense diretamente 50 ou 100 μL de óleo no hexano e o frasco seja feito para 50 ou 100 mL de volume com hexano adicional usando uma pipeta Pasteur de vidro. Inverta o frasco 10 vezes para misturar o óleo com o hexano.
      ATENÇÃO: O hexano deve ser manuseado em um armário de fumaça, usando o EPI adequado. O hexano residual é coletado em um recipiente dedicado para descarte especializado por um empreiteiro aprovado.
  2. Prepare o frasco espectrofotométrico pipeteando o mesmo volume de óleo vegetal do traçador de isótopos estável (50 ou 100 μL) e dispensando-o em hexano. Certifique-se de que a diluição aplicada (50 ou 100 mL) seja a mesma do traçador de isótopos estáveis. Inverta o frasco 10 vezes para misturar o óleo com o hexano.
    NOTA: Para pipetear seja traçador de isótopos estáveis ou óleo puro, é usada uma pipeta de deslocamento positivo de 100 μL. Para garantir que volumes precisos sejam pipetados, é fundamental que a ponta seja limpa para baixo usando papel sem fiapos para remover o resíduo de traçantes/óleo do lado de fora da ponta. Cuidado deve ser tomado ao limpar a ponta da pipeta de substituição direta para que o papel não entre em contato com a abertura da ponta, pois o óleo será retirado de dentro da ponta.
  3. Meça as concentrações estáveis de traçadores de isótopos em uma cubeta de quartzo usando um espectrofotômetro ajustado para um comprimento de onda de 325 nm, usando o óleo vegetal do hexano como branco espectrofotométrico (veja a Tabela 3 para um exemplo).
    1. Comece as medições usando o óleo vegetal em hexano como o blank espectrofotométrico. Limpe a cuveta UV de quartzo entre cada medição, enxaguando 3 vezes com n-hexano. Depois que todas as amostras forem medidas, limpe cuidadosamente a cubeta usando n-hexano puro.
  4. Determine a concentração do traçador de isótopos estável usando as leituras médias de UA e aplique o coeficiente de extinção molar específico do isótopo usando a lei de Beer-Lambert. A partir disso, calcule o volume do traçador de isótopos estáveis preparado necessário por dose (veja exemplo nos resultados representativos abaixo e na Tabela 3).

Resultados

Cálculo do tamanho total da dose do traçador de isótopos
Para um estudo com amostra de 100 participantes, a quantidade total de [13C10]acetato de retinil foi calculada para identificar a quantidade de [13C10]acetato de retinil que precisava ser sintetizada (Tabela 2). A quantidade é baseada em cálculos de potência para o tamanho necessário das amostras (n = 100), atrito esperado (n=15; 15% de atrito), perdas por pipeteamento (20%) e concentração de acetato de retinil [13C 10] por dose (0,4 mg de ER; com base na sensibilidade do espectrômetro de massa aplicado, na duração do experimento e na faixa etária dos sujeitos). A quantidade total obtida de RE necessária (55,2 mg de RE) é então convertida no peso necessário para [13C10] acetato de retinil (63 mg).

Para calcular o volume de óleo de girassol necessário para dissolver [13C10]acetato de retinila na concentração desejada, primeiro definimos o volume de entrega da dose para 150 μL/dose (0,15 mL/dose). Em seguida, calcula-se a concentração de [13C10]acetato de retinil em 1 mL de óleo de girassol (Tabela 2). Dividir o peso necessário para [13C10]acetato de retinil (63 mg) pela dose necessária fornece o volume total de óleo de girassol necessário. Por fim, o peso do óleo de girassol é determinado usando a densidade relativa do óleo de girassol.

A concentração precisa de dose-alvo de [13C10] acetato de retinila no óleo foi confirmada medindo as concentrações estáveis dos traçadores de isótopos usando um espectrofotômetro baseado na lei de Beer-Lambert (Tabela 3). Considerando a diluição do traçador de isótopos estável durante a medição (fator de diluição de 500), obtém uma concentração de 2,58 μmol/μL [13C10] acetato de retinil no óleo. O volume final do traçador de isótopos estáveis preparados necessário para uma dose de 0,4 mg de RE foi, portanto, determinado em 155 μL (Tabela 3).

Verificação da possível isomerização da dose traçadora
A pureza isomérica da dose rastreadora obtida foi determinada verificando a isomerização cis usando Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (HPLC); Figura 2). Para isso, uma amostra da solução traçante diluída do passo 5.1.2 foi seca sob gás nitrogênio e o resíduo foi redissolvido em etanol 100% para injeção. A análise HPLC de 3 amostras repetidas foi realizada usando o método de Liu et al.34 para verificar qualquer isomerização cis-ismérida (ver Figura 2). A pureza da dose do traçador deve ser monitorada durante todo o estudo para garantir que a dose não esteja se degradando.

Efeito das concentrações da dose do traçador sobre frações da dose ao longo do tempo
A aplicação de diferentes níveis de dose levará a uma fração variável da dose ingerida ao longo do tempo, o que pode afetar a capacidade da plataforma analítica de detectar [13C10]retinol em todos os participantes nos momentos necessários. A aplicação de uma dose de 1 mg ou 0,4 mg de [13C10] acetato de retinil em óleo em adultos (Figura 3A) ou crianças (Figura 3B) indicou uma fração maior da dose após a administração de 1 mg em comparação com 0,4 mg de [13C10] acetato de retinil e confirmou a capacidade do LC-MS/MS aplicado de detectar [13C10Retinol em participantes até 28 dias após a dosagem. Isso corrobora que a informação sobre a fração de dose em diferentes momentos de tempo é fundamental para decidir se o nível de dose aplicado é alto o suficiente para obter um sinal acima do nível de detecção para a plataforma analítica aplicada, e que essa informação deve ser obtida idealmente durante um estudo piloto com amostras representativas.

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Figura 1: Fluxograma para preparação das doses de traçadores de vitamina A. Etapas principais para realizar a preparação da dose estável de isótopos, incluindo a determinação das quantidades necessárias, concentração da dose rastreadora obtida e confirmação da pureza da dose. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 2: Cromatograma HPLC da dose traçadora para investigar a isomerização do acetato de retinila. A potencial isomerização do [13C10] acetato de retinil após (A) sonicação e (B) aquecimento a 50 °C por 30 minutos cada foi avaliada usando análise HPLC da dose de isótopos após cada etapa. A análise foi realizada em um HPLC com detecção de matriz de diodos usando o método de Liu et al.34. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 3: Médias observadas da fração plasmática de retinol da dose ao longo do tempo após a ingestão de [13C10] acetato de retinila. Fração da dose de (A) 45 adultos do Reino Unido16 e (B) 112 criançasfilipinas 1 que recebeu 1 mg ou 0,4 mg de [13C10] acetato de retinila, respectivamente. Fração da dose = {concentração plasmática [13C]retinol (μmol/L) X volume plasmático estimado (L) / [13C]dose (μmol). Dados exibidos como média geométrica ± SEM. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Isótopo estávelFornecedor/Fabricante
[D4]-acetato de retinilBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Laboratório de Isótopos de Cambridge
[D6]-acetato de retinilBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Laboratório de Isótopos de Cambridge
[D8]-acetato de retinilBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Laboratório de Isótopos de Cambridge
[13C3]-acetato de retinilBuchem BV/ReseaChem GmbH
[13C4]-acetato de retinilBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Laboratório de Isótopos de Cambridge
[13C 8]-acetato de retinilBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Laboratório de Isótopos de Cambridge
[13C10]-acetato de retinilBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Laboratório de Isótopos de Cambridge

Tabela 1: Traçadores estáveis de isótopos de vitamina A comercialmente disponíveis. Lista de traçadores de acetato de retinila rotulados com 13C e 2H de diferentes fornecedores.

Parâmetros
Tamanho da amostra [n]:100
Atrito [n] (%):15 (15%)
Perdas por pipetagem:20%
MW [13C10]acetato de retinila:338,5 μg/μmol
MW [13C10]retinol:296,46 μg/μmol
Tamanho da dose:0,4 mg de RE de [13C10]acetato de retinil por voluntário
Cálculo
Quantidade total de RE necessária:= tamanho da dose em mg RE x tamanho da amostra x atrito x perdas por pipeteamento
= 0,4 mg RE x 100 x 1,15 x 1,2
= 55,2 mg RE
Quantidade total de [13C10] acetato de retinil necessária:= mg RE x MW [13C10]acetato de retinil / MW [13C10] retinol
= 55,2 mg RE x 338,5 μg/μmol / 296,46 μg/μmol
= 63,0 mg [13C10] acetato de retinil
Concentração de dose de [13C10] acetato de retinil no óleo:[13C10]acetato de retinil [mg/ml] =
(mg RE x MW [13C10] acetato de retinil / MW [13C10] retinol) / 0,15 ml
= (0,4 mg RE x 338,5 μg/μmol / 296,46 μg/μmol) / 0,15 ml
= 3,04 mg/ml
Volume total de óleo de girassol necessário:= Total de [13C10] peso / concentração de dose de acetato de retinil no óleo
= 63,0 mg / 3,04 mg/ml
= 20,7 ml de óleo
Peso necessário de óleo de girassol:= Volume total de óleo de girassol x densidade relativa de óleo de girassol
= 20,7 ml x 0,92 g/ml
= 19,0 g de óleo de girassol

Tabela 2: Exemplo de cálculos de tamanho de dose de traçadores de isótopos estáveis. Indicação de parâmetros e cálculos para determinar a dose do traçador e as quantidades de óleo vegetal.

Parâmetros
Coeficiente de extinção molar (E1%1cm) de [13C10]acetato de retinila em hexano:52718 L mol-1 cm-1 x 1 cm
Fator de diluição:500 (100μL de preparação de óleo em 50mL de hexano)
Absorção média medida:0.917
MW [13C10]retinol:296,46 μg/μmol
Cálculo
Concentração (mol/L) de [13C10]acetato de retinil no hexano:Concentração (mol/L) = Absorção / E1%1cm x Comprimento da cubeta (1cm)
= 0,917 / 52718 L mol-1 cm-1 x 1 cm = 1,739 x 10-5 mol/L
Conversão da concentração em μmol/μL:Concentração (mol/L) = Concentração (μmol/μL)
1,739 x 10-5 mol/L equivale a 1,739 x 10-5 μmol/μL
Corrigindo para diluição:1,739 x 10-5 μmol/μL x 500 = 8,697 x 10-3 μmol/μL em óleo
Peso por μL (μg/μL):= [13C10] acetato de retinil μmol/μL em óleo x MW [13C10]retinol
= 8,697 x 10-3 μmol/μL x 296,45 μg/μmol = 2,58 μg/μL
Volume por dose:= Volume (μL/ 400 μg dose) = 400μg / 2,58 μg/μL = 155 μL

Tabela 3: Determinação da concentração de dose-traçador de isótopos estáveis. Parâmetros e cálculos necessários para determinar concentrações de dosagem do traçador e volumes necessários para a dosagem oral.

Discussão

Traçadores isótopos estáveis usados em estudos em humanos são geralmente considerados seguros, sem efeitos biológicos ou fisiológicos adversos relatados nas concentraçõesaplicadas 25,35. No entanto, como o traçador de isótopos estável precisa ser administrado por via oral, é essencial que a dose do traçador esteja em conformidade com os padrões de segurança alimentar. Isso pode ser alcançado exigindo que fornecedores e fabricantes de vitamina A marcada com isótopos estáveis realizem testes de segurança alimentar nos isótoposfornecidos 7,20,24. Da mesma forma, é fundamental que o preparo e armazenamento dos isótopos sejam realizados apenas em áreas dedicadas ao preparo de alimentos. Além disso, todo o equipamento usado para preparar isótopos estáveis deve ser dedicado apenas à preparação de isótopos e mantido em áreas para preparo de alimentos.

Isótopos marcados com acetato de retinila foram previamente dissolvidos usando etanol, depois secos sob gás nitrogênio antes de serem dissolvidos em óleovegetal 36. Aqui, apresentamos um método que permite a dissolução do traçador marcado como isótopo em óleo vegetal usando uma combinação de sonicação e calor. Embora esse método seja mais fácil de realizar em uma área de preparação de alimentos, é preciso ter cuidado ao aplicar calor para dissolver o traçador em óleo vegetal. O all-trans-retinol é isomerizado para 13-cis-retinol durante o tratamento térmico, que acelera com temperaturasmais altas 37. A isomerização do retinol aumenta ainda mais com a exposição à luz32. Além disso, a estabilidade do retinol é influenciada pela propriedade de oxidação lipídica do óleovegetal 32,38. Como o teor de α-tocoferol no óleo vegetal tem um impacto positivo na retenção de vitaminaA 32, e o óleo de girassol tem um dos maiores teores de α-tocoferol33, optamos por usar óleo de girassol na preparação das doses traçadoras. A decisão de aplicar até 50°C para dissolver o traçador baseou-se na aplicação de calor para dissolver cristais de retinol em produtos cosméticos sem perda significativa39. Embora não tenhamos observado degradação significativa do acetato de retinil sob o protocolo descrito, é vital verificar a isomerização cis da dose do traçador logo após o tratamento térmico (Figura 2). Recomendamos ainda que a estabilidade da dose do traçador seja monitorada durante todo o estudo para confirmar a concentração aplicada da dose.

O rastreador deve ser preparado em uma concentração bem dentro dos limites volumétricos do sistema de administração usado para administrar a dose desejada. Como o RID depende da entrega precisa de traçadores estáveis marcados com isótopos, recomenda-se o uso de uma pipeta de deslocamento positivo para aplicação da dose. Embora tamanhos de dose de até 1 mL tenham sido aplicados no passado a adultos16, 20, 40, é mais fácil aplicar volumes entre 100 e 250 μL, pois esses volumes demonstraram ser bem tolerados por bebês ecrianças 1. Alternativamente, as doses também podem ser administradas na formade cápsula 17, mas é essencial selecionar cápsulas especificamente projetadas para prevenir vazamento de óleo e garantir a aceitação dentro da população estudada. Por fim, os níveis de dose aplicada dependem do grupo etário dapopulação-alvo 29, da capacidade da plataforma analítica aplicada de detectar níveisbaixos 3 e do total de reservas corporais da população-alvo, com fração plasmática menor em reservas corporais totaismaiores 1.

Como indicado no exemplo acima, [13C10]acetato de retinila a uma concentração de 2,58 μg/μL em óleo de girassol fornecerá uma dose de 0,4 mg de traçador de RE em 155 μL de óleo de girassol, que pode ser administrado com precisão usando uma pipeta de deslocamento positivo de 250 μL. Para obter concentrações dentro dos limites volumétricos do sistema de entrega, é fundamental que o óleo vegetal escolhido para solubilizar o traçador seja ponderado corretamente usando uma balança analítica (precisa a 0,1 g) no frasco contendo o traçador de isótopos estável. Por exemplo, se um total de 63 mg [13C10] acetato de retinila for preparado a uma concentração de 3,04 mg/mL em óleo de girassol, e a densidade específica do óleo de girassol for 0,92 g/mL a 25 ◦C, então 19,0 g (20,7 mL x 0,92 g/mL) de óleo precisam ser pesados no frasco contendo o traçador. Embora a concentração final do traçador isotópico estável seja confirmada usando uma leitura de espectrofotômetro, a pesagem precisa do traçador isotópico e do óleo aplicado garantirá que as concentrações obtidas estejam próximas do volume de entrega escolhido para cada dose.

É recomendável aliquotar as preparações de óleo com base na necessidade diária prevista para garantir que todas as doses do frasco sejam usadas dentro de 2 semanas após a abertura do frasco. É melhor manter as preparações de óleo em bolsas de gelo no campo durante o uso e recongelá-las o quanto antes após a dosagem. Embora as preparações de óleo não sejam afetadas por ciclos repetidos de congelamento e descongelamento, elas precisam sempre ser protegidas da luz e congeladas quando não estiverem em uso.

Em resumo, este protocolo detalha a preparação precisa e o controle de qualidade das doses traçadoras para o método DID, garantindo dosagem precisa, estabilidade e segurança. O método calcula os requisitos de traçadores, otimiza a solubilização em óleo vegetal e verifica pureza e concentração usando espectrofotometria e HPLC. Diretrizes rigorosas de manuseio e armazenamento garantem integridade confiável do traçador para avaliações precisas baseadas em isótopos.

Divulgações

Os autores não têm nada a declarar.

Agradecimentos

O apoio a esse trabalho foi fornecido pela Fundação Bill & Melinda Gates (Número do Projeto: OPP1115464) e pela Agência Internacional de Energia Atômica (AIEA) em Viena (Projeto Número E4.30.30).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Frascos de vidro âmbar de 2ml para aliquotação de dosesFisher11573690Dependendo do tamanho da amostra do estudo e da quantidade de voluntários que recebem doses diárias, pode ser mais eficiente usar frascos âmbar maiores, por exemplo, de 4ml,
Frascos volumétricos de 100mlFisher11323644Frasco volumétrico certificado Pyrex Borosilicato Classe A
Frascos volumétricos de 50mlFisher11313644Frasco volumétrico certificado Pyrex Borosilicato Classe A
Balança analítica  Fisher13592970
Pistões capilares (pontas de pipeta) CP100 10x96 TIPACKGilsonFD148314
Pistões capilares CP1000ST 2x91GilsonF148180
Pistões capilares CP250ST 6x96GilsonF148714
Caixa criogênica de papelãoStarlabA9623-8181
Hellma cuvette UV quartzSLSCEL1600
Hexano 95% N-Hexano para HPLC Certificado HPLCFisherH/0406/17
Tampas para frascos de vidro âmbar de 2mlFisher11573542
Microman E M1000E Pipeta (deslocamento positivo)GilsonFD10006
Microman E M100E Pipeta (deslocamento positivo)GilsonFD10004
Microman E M250E Pipeta (deslocamento positivo)GilsonFD10005
MicroscópioNikonEclipse E400
Lâminas de vidro para microscópio  Sigma41122601
Banho-maria sónicoVWRUSC100T
EspectrofotômetroThermo Fisher ScientificA51119600C
Traçador estável marcado com acetato de retinila marcado por isótoposBuchem BVN/AUma variedade de isótopos estáveis pode ser usada para o método de DRI. Uma lista de diferentes isótopos comercialmente disponíveis é apresentada na Tabela 1.  
Banho-maria não agitadoSLSSLS1176
Óleo vegetalQualquer supermercadoN/AÉ importante usar óleo vegetal fresco com vida útil suficiente para preparar doses de isótopos.
Pipeta pasteur de vidro desconectado Volac 150mmSLSPIP4150

Referências

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