Os imunoensaios de fluorescência multiplex estão se tornando uma referência para testes sorológicos. Sua aplicação, no entanto, é limitada pela complexidade e pelos demorados processos de acoplamento de analitos de esferas. Este relatório apresenta um protocolo de acoplamento de esferas de microesferas multiplex semiautomatizado e reprodutível que é comparável ao método padrão, reduzindo consideravelmente o tempo de resultados.
Artigo de método
Um ensaio sorológico multiplex para a detecção de respostas de anticorpos a arbovírus
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os vírus transmitidos por artrópodes (arbovírus) são um grupo de patógenos transmitidos por mosquitos que são distribuídos globalmente. Desde o surto de 2016 do vírus Zika (ZIKV) nas Américas, que trouxe essas infecções à consciência pública, os arbovírus continuam a impor um fardo considerável à saúde pública. Seu surgimento em regiões anteriormente não endêmicas é motivo de preocupação com a saúde pública. A vigilância e o controle das arboviroses é uma prioridade atual da Organização Mundial da Saúde (OMS), que lançou um plano estratégico global para combater as arboviroses em 2024. A tecnologia multiplex® revolucionou o campo da vigilância sorológica, permitindo a medição simultânea de vários anticorpos, exigindo um volume mínimo de amostra. Com base na experiência no desenvolvimento de testes sorológicos multiplex, foi desenvolvido um ensaio multiplex baseado em esferas para a detecção de anticorpos contra antígenos de arbovírus. O ensaio compreende vários antígenos específicos para arbovírus comuns, incluindo os vírus da dengue (DENV), febre amarela (YFV), Zika e chikungunya (CHIKV). Um método semi-automatizado foi usado para ligar covalentemente antígenos a esferas de microesferas. Este novo protocolo é altamente eficaz, permitindo o acoplamento de até 96 antígenos em um único experimento, garantindo resultados reprodutíveis. Os dados de intensidade mediana de fluorescência (MFI) foram adquiridos usando um sistema de imagem de fluorescência fácil de usar. Quando aplicado a amostras de soro humano de países endêmicos, prevemos que este ensaio constituirá uma ferramenta poderosa para os esforços de sorovigilância.
Introdução
Os arbovírus são responsáveis coletivamente por milhares de mortes todos os anos. Esses vírus são transmitidos aos humanos por meio de artrópodes infectados, principalmente mosquitos e carrapatos. A gravidade das infecções por arbovírus é diversa e varia de infecção assintomática a doença grave que pode levar à morte. Em 2024, a Organização Mundial da Saúde (OMS) registrou mais de 10.000 mortes causadas apenas pelos quatro sorotipos do vírus da dengue (DENV)1. No mesmo ano, o vírus infectou mais de 14 milhões de pessoas, incluindo 50.000 casos graves1. Embora o DENV seja o arbovírus mais proeminente, o grupo inclui outros patógenos com risco de vida que foram responsáveis por vários surtos em todo o mundo. Uma recente revisão resumida das infecções por arbovírus na África descobriu que esses vírus, incluindo DENV, vírus da febre amarela (YFV), vírus chikungunya (CHIKV), vírus da febre hemorrágica da Crimeia-Congo (CCHFV), vírus da febre do Vale do Rift (RVFV), vírus do Nilo Ocidental (WNV) e vírus Zika (ZIKV), causaram pelo menos 29 surtos em todo o continente em 20232. Em 2022, um relatório publicado pelo Escritório Regional da OMS para África destacou as actuais limitações na vigilância de arbovírus em toda a região, enfatizando a necessidade urgente de desenvolver métodos para a vigilância e controlo de arbovírus3.
O diagnóstico clínico das infecções arbovirais é desafiador devido às semelhanças nos sintomas, como febre, artralgia e mal-estar geral, que são comuns a outros patógenos presentes em regiões endêmicas4. Além disso, devido à co-circulação e potencialmente co-infecção dos vírus, a distinção do patógeno etiológico é difícil5. A confirmação laboratorial é crucial para o diagnóstico diferencial. Existem vários métodos para a detecção de arborvírus em amostras humanas. Métodos diretos, incluindo testes de diagnóstico molecular, detecção de antígeno viral e isolamento viral, detectam a presença do patógeno, enquanto métodos indiretos, como diagnóstico sorológico, medem a resposta imune à infecção viral6.
Uma infinidade de métodos para a detecção de respostas de anticorpos a arbovírus foi desenvolvida. Estes incluem ensaios imunoenzimáticos (ELISAs), fixação de complemento, inibição da hemaglutinação e imunoensaios de microesferas 6,7. Este relatório apresenta um imunoensaio baseado em microesferas de fluorescência multiplex (FMIA) para a detecção de respostas de anticorpos a antígenos de arbovírus. Os ensaios baseados em microesferas8 são amplamente utilizados em sorologia e oferecem várias vantagens, principalmente a capacidade de detecção de vários analitos em uma única reação com volume mínimo de amostra. Microesferas opticamente codificadas (esferas de poliestireno magnético) revestidas com antígenos recombinantes de interesse são usadas em um imunoensaio sorológico indireto. As esferas acopladas são então incubadas com amostras e anticorpos específicos do antígeno são detectados usando um anticorpo secundário IgG anti-humano conjugado a um repórter de fluoróforo de ficoeritrina (PE). Vários analisadores estão disponíveis para a detecção de fluorescência emitida, que é relatada como MFI.
O princípio do ensaio é detalhado em Angeloni et al.8. Resumidamente, os antígenos de interesse estão quimicamente ligados a microesferas codificadas por cores. Para isso, os grânulos são inicialmente tratados com 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] Carbodiimida (EDC) e N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-NHS), que ativam o grupo carboxila na superfície dos grânulos, criando um composto reativo à amina. Este composto semiestável intermediário é então misturado com a proteína de interesse, por meio da qual as porções de amina da proteína são ligadas covalentemente às contas, gerando microesferas estáveis revestidas com a proteína de interesse na superfície. As esferas ligadas ao antígeno são incubadas com amostras, permitindo que os anticorpos se liguem a antígenos específicos. Os anticorpos ligados ao antígeno são detectados usando um anticorpo secundário antiimunoglobulina conjugado a um corante fluorescente. Usamos anticorpos secundários marcados com PE. As IMFs são medidas usando um gerador de imagens de luz (os detalhes do instrumento são fornecidos na Tabela de Materiais). O instrumento usa duas luzes LED, um LED vermelho e um LED verde, que excitam separadamente os corantes internos das contas e uma fluorescência repórter na superfície das contas9. Os filtros são então usados para classificar as esferas com base na cor e quantificar a fluorescência emitida pelos analitos.
Anteriormente, aplicamos a tecnologia para a detecção de respostas de anticorpos ao SARS-CoV-210 e doenças evitáveis por vacinação11 e mostramos que os ensaios multiplex constituem uma ferramenta inestimável para estudos de soroprevalência e vigilância. O objetivo deste projeto é estender o uso da FMIA à detecção de respostas de anticorpos a múltiplos antígenos pertencentes a arbovírus com o objetivo de aplicar o ensaio para rastrear amostras da região africana.
Ensaios multiplex de arbovírus usando tecnologia multiplex foram descritos em outros lugares usando diferentes alvos de antígenos, como proteína não estrutural 1 (NS1) 12 , 13 ou domínio de envelope III (EDIII) 14 . Um ensaio de 50 plex, que inclui 26 antígenos de arbovírus (incluindo NS1, EDIII, partículas semelhantes a vírus (VLPs) e vários outros antígenos para testar patógenos que estão cocirculando na região, é apresentado. O ensaio permitirá avaliar a intensidade de transmissão desses patógenos. Um resumo dos antígenos recombinantes usados para o desenvolvimento do ensaio é fornecido na Tabela 1. O protocolo apresentado neste relatório foi desenvolvido em complemento a um extenso estudo de desenvolvimento de método focado na otimização da detecção de arbovírus.
Normalmente, o acoplamento (ou fixação) de antígenos às esferas da microesfera é realizado em tubos individuais8 (acoplamento manual). Esse processo é demorado, complicado e propenso a erros de reprodutibilidade. Este artigo relata um protocolo utilizando um instrumento automatizado para realizar as etapas sucessivas envolvidas na ligação química de antígenos aos grânulos. Neste manuscrito, relatamos as etapas realizadas para a validação do novo protocolo. A validação do novo protocolo foi realizada comparando as respostas de IgG medidas com um FMIA 50-plex usando grânulos acoplados a antígenos preparados com o método manual ou o protocolo automatizado. A validação adicional do método foi realizada por meio da análise de amostras de soro humano de coortes africanas e francesas.
O protocolo automatizado de acoplamento de esferas é rápido, permitindo o acoplamento simultâneo de até 96 analitos em uma única execução. Mais importante, os resultados são comparáveis aos obtidos usando o protocolo manual estabelecido, com variação reduzida de lote para lote.
Protocolo
Obteve-se aprovação ética apropriada para o uso de amostras humanas. As amostras foram resíduos anonimizados de estudos anteriores. O protocolo para o uso de amostras ORPAL de "pool padrão" foi aprovado pelo Conselho Nacional de Ética do Suriname (CMWO (Commissie voor Mensgebonden Wetenschappelijk Onderzoek), Parecer Número VG 25-17). O uso de amostras de Madagascar foi aprovado como parte do projeto PvSTATEM pelo Comitê de Ética da Escola de Higiene e Medicina Tropical de Londres (28541) e pelo Comitê d'Éthique de la Recherche Biomédicale de Madagascar (135MSANP/SG/AMM/CERBM), enquanto o uso de amostras senegalesas foi aprovado como parte do projeto Dielmo e Ndiop em andamento pelo Comitê Nacional de Ética em Pesquisa em Saúde do Senegal (CNERS Sénégal). A aprovação para medir anticorpos para DTNs nessas amostras foi concedida pelo CNERS Sénégal (N 00000007 MSAS/CNERS/Sec). As amostras francesas não endêmicas foram derivadas de testes médicos de rotina em laboratórios hospitalares franceses e processadas de acordo com os regulamentos e diretrizes existentes da Comissão Nacional de Informática e Liberdades da França. Amostras de soro humano foram obtidas de indivíduos de regiões com alta prevalência de arbovírus e de uma população francesa ingênua. As amostras de soro foram inativadas pelo calor antes do uso por incubação a 56 ° C por 30 min. Se as amostras não estiverem inativadas, manipule-as sob um gabinete de segurança. A maioria dos antígenos recombinantes foi obtida comercialmente, exceto as proteínas recombinantes EDIII, que foram sintetizadas internamente. Um instrumento analisador baseado em imagem9 foi usado para aquisição de dados. Os reagentes e equipamentos utilizados são fornecidos na Tabela de Materiais.
1. Determine as concentrações ideais de antígeno para acoplamento
NOTA: Para evitar o fotobranqueamento, minimize a exposição das esferas de microesferas à luz durante todo o procedimento. Antes do acoplamento em massa, otimize as concentrações de acoplamento para cada antígeno usando um protocolo de acoplamento manual. O protocolo foi adaptado de Angeloni et al.8. Os tampões e soluções são detalhados na Tabela Suplementar 1.
- Selecione as regiões do cordão a serem usadas para acoplamento. Vórtice completo por 20 s. Sonicar o tubo por um mínimo de 60 s.
- Transfira 200 μL (grânulos de 2,5 M) de grânulos para um tubo de 1,5 mL.
- Lave as esferas com 200 μL 100 mM de fosfato de sódio monobásico/0,125x Triton.
- Coloque o tubo em um separador de tubo magnético por 60 s. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem tocar nas contas.
- Adicione tampão de fosfato de sódio monobásico. Deixe no rack magnético por 60 s. Remova o sobrenadante.
- Ative os grânulos com um tampão contendo 80 μL de fosfato de sódio monobásico 100 mM, 0,125x Triton, 10 μL de sulfo-NHS e 10 μL de EDC.
- Adicione fosfato de sódio monobásico -sulfo-NHS-EDC aos tubos. Incube no escuro por 20 min em temperatura ambiente em um rolo.
- Lave as esferas em 250 μL PBS (1x) e 0,125x Triton. Repita a lavagem três vezes.
- Ligar os antigénios.
- Preparar as diferentes concentrações (diluições seriadas) de antigénios num volume total de 1 ml 1x PBS e 0,125x Triton. Testar pelo menos duas concentrações de antigénios.
- Adicione soluções de antígeno aos grânulos ativados. Incubar no escuro 2 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C num rolo.
- Lavagem de grânulos acoplados em 500 μL PBS-TBN e 0,125x Triton. Repita a lavagem três vezes.
- Ressuspenda os grânulos acoplados em 1 mL de PBS-TBN e 0,125x Triton.
NOTA: Armazene os grânulos acoplados a 4 °C por pelo menos 24 h antes de usar. Os grânulos acoplados mostraram variabilidade nas IMFs quando testados imediatamente após o acoplamento em comparação com o teste após 24 h. - Selecione uma concentração ideal para usar no acoplamento subsequente em grande escala. Use diferentes esferas acopladas para o imunoensaio em uma piscina padrão. Selecione a concentração mais baixa na qual uma curva padrão linear foi obtida.
NOTA: Um exemplo de linearidade da resposta de anticorpos a um pool padrão é fornecido na seção de resultados, Figura 1.
2. Acoplamento automatizado em grande escala do grânulo
- Prepare contas COOH Pro Magnetic.
- Calcule as contas necessárias: Usando 500 contas/amostra, 2,5 milhões de contas são suficientes para 5000 amostras.
- Prepare as regiões do cordão para usar no acoplamento conforme descrito anteriormente.
- Transfira o volume desejado de grânulos para os poços alocados. Para 2,5 milhões, foram usados 200 μL de grânulos (a concentração padrão de Luminex é de 1,25e7 grânulos / mL).
- Prepare os antígenos. Esta é uma etapa crítica para garantir quantidades precisas de antígenos.
- Calcule as quantidades do antígeno necessário, após a otimização. As concentrações utilizadas para cada antigénio são descritas no quadro 1.
- Em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, misture bem um volume adequado de antígenos de interesse com 1x PBS / 0,125x Triton para um total de 1 mL.
- Prepare as placas com reagentes. Prepare placas de poços de 96 de profundidade da seguinte maneira. Os volumes são por poço e calculados para acoplamento de 2,5 milhões de grânulos.
- Placa 1 (Pentes de ponta): pentes de ponta de carga.
- Placa 2 (Grânulos): Adicione 8 μL de 0,125x Triton e 200 μL das regiões de grânulos de interesse.
- Placa 3 (Wash1): Adicione 200 μL de fosfato de sódio monobásico 100 mM / 0,125x Triton.
- Placa 4 (Ativação): Adicionar 80 μL de fosfato de sódio monobásico 100 mM / 0,125x Triton + 10 μL sulfo-NHS + 10 μL EDC.
- Placa 5 (Wash2): Adicione 250 μL de 1x PBS / 0,125x Triton.
- Placa 6 (Acoplamento): Transferir 1 mL de solução de antígeno para o poço alocado.
- Placa 7 (Wash3): Adicione 500 μL de PBS-TBN/0,125x Triton.
- Placa 8 (placa final, contém grânulos acoplados): Adicione 1 mL de PBS-TBN + 0,125x Triton.
- Configure a execução do ciclo de acoplamento no processador automatizado.
- Siga as instruções do fabricante para ligar a máquina e configurar o protocolo. O software necessário pode ser baixado no PC15. Os parâmetros específicos da execução são detalhados na Tabela Suplementar 2.
- Carregue as placas no slot alocado na máquina. Selecione o protocolo. Inicie o ciclo. O tempo estimado para completar o programa é de 2:50 h.
- Fim do ciclo
- Siga as instruções do fabricante para desligar a máquina. Descarregue as placas conforme as instruções. Verifique visualmente se a placa 8 contém as contas (pellet marrom). Além disso, um relatório de execução é exportado dos instrumentos.
- Transfira os grânulos acoplados da placa 8 para tubos individuais de 1,5 mL para armazenamento. Armazene os grânulos acoplados a 4 °C até o uso.
- Conte as contas.
NOTA: Um contador de células foi usado. Para contagem manual usando um hemacitómetro, consulte o manual do livro de receitas Luminex8.- Contas completamente acopladas ao vórtice. Transferir 10 μL para uma câmara de contagem de células. Siga as instruções do fabricante para ler a contagem de esferas por mL.
- Verifique a agregação visualizando a imagem no contador de células. Consulte a Figura Suplementar 1 para obter uma imagem representativa de contas não agregadas.
- Se houver agregados, vórtice e sonicate completamente por pelo menos 5 min. Repetir contagem
NOTA: Após a contagem de grânulos, a eficiência do acoplamento foi avaliada realizando um imunoensaio de grânulos acoplados em um pool padrão para avaliar a linearidade da resposta do anticorpo.
Tabela 1: Painel de antígenos incluídos no 50-plex. O ensaio inclui vários antígenos para a detecção de infecções arbovirais e patógenos co-circulantes. São fornecidas quantidades de antígenos usados para o acoplamento de 1,25 milhão de grânulos. Clique aqui para baixar esta tabela.
3. Imunoensaio multiplex
NOTA: As etapas detalhadas do protocolo para medição de MFI são fornecidas no respectivo manual9. Para minimizar a exposição das esferas à luz e o risco de fotobranqueamento, todas as soluções e amostras são preparadas antes de retirar as esferas da geladeira.
- Configure o layout da placa. Placas de 96 poços foram usadas e incluíram diluições em série de uma piscina padrão, bem como um branco (somente tampão) na primeira linha.
- Diluir as amostras e o padrão em tampão PBT em uma placa separada não vinculativa. Uma diluição de 1:200 (concentração final de 1:400) foi utilizada para as amostras. Para a curva padrão, foram utilizadas diluições de 1:50 do pool de soro padrão (resultando em uma concentração final de 1:100) e dez diluições seriadas de 2 vezes.
- Determine a quantidade de grânulos acoplados a serem usados em um volume total de 50 μL / poço. Foram utilizadas 500 esferas de cada cordão por poço e ajustadas ao volume com tampão PBT.
- Vortex completamente a mistura de grânulos acoplados por 30 s. Sonicar por pelo menos 60 s.
- Calcule o volume de cada grânulo acoplado a ser adicionado à pré-mistura multiplex para garantir grânulos iguais para cada analito. Os volumes de grânulos foram calculados da seguinte forma: Volume de grânulos por poço = número de grânulos por poço/contagem de grânulos.
NOTA: Um example para o cálculo de grânulos e volumes de buffer necessários para a pré-mistura é ilustrado na Tabela Suplementar 3. - Transferir volumes adequados de antígenos de esferas para um tubo de centrífuga.
- Ajuste o volume com PBT.
- Misture bem a pré-mistura.
- Distribua 50 μL da pré-mistura para a microplaca de imagem (por exemplo, ps, placas de fundo f).
- Adicione 50 μL das amostras diluídas aos grânulos.
- Misture em uma coqueteleira por 30 min em temperatura ambiente, 700 rpm.
- Lave as placas três vezes da seguinte forma (lavagem manual).
- Coloque a placa em um rack magnético por 60 s em temperatura ambiente. Segure a placa firmemente na grelha e descarte o sobrenadante.
- Adicione 100 μL de tampão PBT. Deixe no rack magnético por 60 s. Repita as lavagens
NOTA: Alternativamente, uma arruela de placas16 pode ser usada. A lavadora foi ajustada da seguinte forma: 1 ciclo de imersão, seguido por 3 ciclos (aspiração, dispensação e imersão) e um aspirado de ciclo final.
- Rejeitar o sobrenadante e adicionar 50 μL de anticorpo secundário diluído.
- Siga as instruções do fornecedor para preparar uma solução de estoque do anticorpo secundário. Uma solução de diluição 1/120 de anticorpo secundário foi usada. Os volumes de anticorpos secundários foram calculados da seguinte forma: volume de anticorpos secundários = volume total/fator de diluição.
- Misture o anticorpo secundário com um volume adequado de tampão PBT. Misture bem. Adicione 50 μL de anticorpo secundário diluído às esferas lavadas.
- Incubar num shaker durante 15 min à temperatura ambiente, 700 rpm.
- Execute três lavagens conforme descrito anteriormente.
- Ressuspenda os grânulos em tampão PBT de 150 μL.
- Incube em um shaker por 5 min em temperatura ambiente, 700 rpm. Siga as instruções do fabricante para configurar os instrumentos9.
NOTA: O software xPONENT17 fornecido com o instrumento imager foi usado. As configurações para a leitura de fluorescência foram definidas da seguinte forma: o volume de coleta foi ajustado para 50 μL, com uma medida mínima de 50 grânulos, sem aquecedor XY, e o tipo de análise como nenhum.
4. Análise dos dados
- Executar validação
- Verifique se a contagem mínima de contas foi atingida. Recomenda-se pelo menos 35 esferas por poço para obter um MFI8 estatisticamente válido.
- Verifique se os valores de IFM da amostra de controlo em branco e negativo são mínimos.
- Verifique os valores de MFI para padrões plotando uma curva padrão. Estes são mais elevados do que a amostra de controlo em branco e/ou negativa.
- Análise de dados de amostra
- Exporte os dados como arquivos CSV e analise externamente usando o software R.
Resultados
Para ilustrar o processo seguido para validação do protocolo, selecionamos três antígenos que representam três famílias de arbovírus: Flavivírus (proteína DENV1 NS1), Alfavírus (proteína CHIKV VLP) e Bunyavírus (RVFV NP). Os antígenos foram testados em um pool padrão de uma população pré-exposta (ORPAL), soros populacionais franceses (não expostos) e duas coortes da África (Senegal e Madagascar).
Linearidade de diluição da resposta de anticorpos
A concentração de antígenos a serem usados para acoplamento de esferas foi determinada usando diluições seriadas do pool ORPAL. A concentração ótima foi selecionada como a menor concentração na qual uma curva padrão linear foi obtida (dados não mostrados). A Figura 1 mostra a linearidade dos antígenos de arbovírus selecionados na concentração ideal para cada antígeno. Para o controle de qualidade do acoplamento, cada lote de grânulos acoplados foi testado quanto à linearidade de diluição no pool padrão ORPAL usando a concentração pré-selecionada.
Comparabilidade com o ensaio de acoplamento manual padrão
Para avaliar a comparabilidade dos dados obtidos usando o novo protocolo automatizado com o acoplamento manual bem estabelecido, comparamos curvas padrão geradas a partir dos resultados obtidos com acoplamento manual versus automatizado. A Figura 2 mostra a linearidade paralela para ambos os ensaios. Os valores de MFI variam de acordo com o antígeno.
Variação de lote de acoplamento de talão
A variação do lote de acoplamento, à medida que a reprodutibilidade dos testes do mesmo lote de acoplamento foi avaliada, foi avaliada por meio do gráfico de Levey-Jennings18. Os antígenos representativos e os grânulos acoplados à BSA de controle foram usados e testados no pool padrão ORPAL. A Figura 3 mostra MFIs de 19 placas diferentes, testadas em dias diferentes para cada antígeno. As IMFs resultantes estão dentro da faixa da média ± 3 DP para os três antígenos e o controle.
Efeito da multiplexação no MFI
Para avaliar melhor o desempenho do ensaio, testamos se a multiplexação de vários antígenos afetava a resposta de anticorpos medida. A resposta foi comparada a um único antígeno (ou talão de plexo único) usando o pool padrão ORPAL. A Figura 4 mostra uma forte correlação (R = 0,99, p < 2,2e-16) entre os resultados obtidos quando as IMFs foram medidas em antígenos únicos ou a partir de uma pré-mistura contendo 50 antígenos.
Respostas de anticorpos de amostras de soro humano em populações africanas
Para avaliar a aplicabilidade do ensaio a amostras de diversas coortes, comparamos as respostas de anticorpos em amostras de soro humano de populações africanas, que têm alta probabilidade de exposição a arbovírus, com as de uma coorte francesa que presumivelmente tem menor exposição a esses vírus. No total, 1.596 amostras foram testadas para Madagascar, 1.428 para o Senegal e 84 da coorte francesa. A Figura 5 apresenta gráficos de densidade para as diferentes coortes. Para a coorte do Senegal, observa-se uma clara distribuição bimodal de dados para as respostas ao CHIKV VLP, sugerindo duas respostas distintas ao CHIKV na população. Uma cauda bimodal sutil também é observada para DENV1 NS1 e RVFV NP na coorte do Senegal, enquanto não há diferença entre as coortes francesa e de Madagascar.
Figura 1: Linearidade da resposta de anticorpos testada no pool padrão ORPAL. Antígenos de arbovírus selecionados são mostrados como exemplo. As intensidades medianas de fluorescência (MFI) são mostradas no eixo y (escala logarítmica) e a diluição serial do pool padrão no eixo x. Todos os antígenos no painel foram pré-testados no pool padrão antes do teste em massa nas amostras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Linearidade paralela da resposta de anticorpos por métodos de acoplamento. Log de IFM (eixo y) de antígenos representativos (faceta) testados em diluições seriais do pool padrão ORPAL (eixo x). As cores representam diferentes métodos de acoplamento: automação (vermelho, verde, azul) e manual (roxo). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Variação de placa para placa. Levey_Jennings gráficos para o cordão acoplado BSA (controle), DENV1 NS1, CHIKV VLP e RVFV são mostrados para o pool padrão ORPAL em uma concentração de 1:400. Os resultados representam 19 placas executadas em dias diferentes. As IMFs são apresentadas no eixo y, o número de testes está no eixo x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Correlação da resposta do anticorpo ao ensaio mono e multiplex. O pool padrão foi diluído a uma concentração final de 1:400 e testado em uma pré-mistura contendo os antígenos 50-plex em paralelo com esferas revestidas com antígeno único. A correlação de Pearson foi utilizada para análise. Três antígenos representativos são mostrados como exemplo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Aplicação do ensaio na coorte endêmica e não endêmica de amostras. O ensaio foi testado em amostras de Madagascar (verde), Senegal (azul) e França (vermelho). As amostras foram diluídas na concentração final de 1:400. O eixo X representa as IFM normalizadas (nMFI), calculadas como um rácio entre a IFM da amostra e a IFM do conjunto padrão na mesma concentração (1:400). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Exemplo de imagem representativa da agregação de contas. O painel (A) mostra contas não agregadas e o painel (B) mostra agregados de contas. Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela Suplementar 1: Tabela de buffers. Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela suplementar 2: Configurações do protocolo de acoplamento de contas KingFisher Apex. Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela Suplementar 3: Exemplo para cálculo de volumes de grânulos para pré-mistura. Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussão
O uso da FMIA mudou o cenário dos testes sorológicos. A força dos ensaios reside na capacidade de avaliar as respostas de anticorpos a vários antígenos em uma reação, reduzindo o tempo para os resultados e diminuindo o custo dos testes. Isso é particularmente importante na vigilância sorológica. O uso rotineiro de ensaios FMIA é, no entanto, dificultado pela etapa de acoplamento manual de esferas trabalhosa e demorada, que requer o manuseio de antígenos únicos por reação. Este relatório apresenta um método automatizado para acoplamento químico de antígenos a grânulos. A automação permite o acoplamento simultâneo de até 96 antígenos em uma única execução, reduzindo consideravelmente o tempo necessário para o acoplamento de antígenos de alto rendimento.
A Figura 1 mostra que os antígenos foram ligados com sucesso às contas. Os resultados também mostram um forte paralelismo entre o novo protocolo automatizado e o protocolo manual bem estabelecido (Figura 2), indicando acurácia não inferior na detecção de respostas de IgG aos antígenos avaliados. Os resultados da variação do lote de acoplamento placa a placa (Figura 3) e do talão (Figura 2) mostram a comparabilidade dos dados ao usar o método automatizado para acoplamento. A alta correlação entre MFIs multiplex e singleplex (Figura 4) mostra que a multiplexação de um grande número de antígenos não afeta a resposta do anticorpo ao conjunto de antígenos individuais usados neste ensaio.
Para validação do ensaio, foram testadas amostras de coortes endêmicas e não endêmicas (Figura 5). Embora os estudos de soroprevalência de arboviroses ainda sejam escassos na África, os dados disponíveis 19,20,21,22 sugerem um quadro diferenciado com soroprevalências variáveis de IgG entre e dentro de cada país. Notavelmente, os dados existentes sugerem prevalências mais altas dos três vírus (chikungunya, dengue e Vale do Rift) no Senegal em comparação com Madagascar, por exemplo,19. Essas prevalências são consistentes com a observação deste relatório, que mostrou uma resposta clara e distinta aos diferentes antígenos no Senegal quando comparados às outras coortes. Isso apóia a capacidade do ensaio de distinguir perfis de anticorpos no contexto de soroprevalência relativamente alta. Os dados observados para a coorte de Madagascar podem ser explicados pela baixa prevalência relatada dos vírus no local de coleta da amostra22, enquanto a comparabilidade dos dados com a coorte não endêmica pode ser parcialmente explicada pelo pequeno tamanho da amostra da coorte francesa. Além disso, a variabilidade relatada entre as regiões pode explicar as diferenças observadas nos conjuntos de dados. É necessário um estudo extenso para avaliar a soroprevalência de IgG; no entanto, os dados apresentados neste relatório mostram que o ensaio desenvolvido é específico para detectar respostas de IgG aos antígenos de arbovírus avaliados, distinguindo dados de regiões endêmicas, bem como respostas diferenciadas e distintas dentro da mesma população.
Os principais desafios técnicos incluíram a obtenção de soluções homogêneas de antígenos, apesar de seu uso em quantidades muito pequenas, garantindo a representação equimolar das regiões do grânulo na pré-mistura e minimizando a agregação do grânulo. Para superar a dificuldade de obter uma solução homogênea na placa de 96 poços, foi implementada uma etapa em que todas as soluções antigênicas foram completamente pré-misturadas em um tubo de 1,5 mL antes de serem distribuídas na placa. Além disso, foi adicionado um degrau para contar os grânulos acoplados e ajustar os volumes para garantir que um número igual de regiões do grânulo seja adicionado à pré-mistura. Uma etapa de sonicação também foi incluída para facilitar a mistura de grânulos e minimizar a agregação na pré-mistura.
Neste estudo limitado, a estabilidade dos grânulos acoplados e seu impacto no desempenho do ensaio não foram avaliados, pois todas as amostras foram testadas dentro de um mês após o acoplamento do cordão. Esta avaliação ultrapassou o âmbito do presente relatório e será avaliada em estudos futuros. Apesar dessas limitações, este relatório apresenta um método rápido e confiável para detectar respostas de anticorpos a uma variedade de patógenos, incluindo arbovírus. A vigilância sorológica de infecções por arbovírus é crucial para o controle das doenças, e a disponibilidade de um método rápido e reprodutível para detectar respostas de anticorpos a esses vírus representa um avanço significativo nos esforços globais para avaliar heterogeneidades na transmissão e direcionar intervenções para mitigar a carga dessas infecções. Além disso, embora o foco deste relatório seja os arbovírus, este protocolo é amplamente aplicável a uma ampla gama de antígenos e representa um avanço significativo no campo.
Divulgações
Os autores declaram não ter conflito de interesses.
Agradecimentos
Os autores agradecem sinceramente aos participantes do estudo e aos agentes comunitários de saúde em cada um dos locais de estudo. Também agradecemos a todos os funcionários de laboratório e de campo por seus esforços dedicados na coleta de amostras, aquisição de dados e análises laboratoriais. Este trabalho foi apoiado pela concessão Reconstruindo a intensidade de transmissão de arbovírus em toda a África e o impacto das intervenções em um clima em mudança (xSTAR) do Wellcome Trust [228185/Z/23/Z]. Para fins de acesso aberto, os autores aplicaram uma licença pública de direitos autorais CC BY a qualquer versão do Manuscrito Aceito pelo Autor decorrente desta submissão. Agradecemos também aos seguintes pela permissão para usar amostras: Rob Van Der Pluijm (Infectious Diseases Epidemiology and Analytics, Institut Pasteur, Paris) e Maylis Douine e Alice Sanna (Centre d'Investigation Clinique Antilles-Guyane, Centre Hospitalier de Cayenne, Cayenne).
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos microcentrífugas de 1,5 mL | - | Consumáveis gerais de laboratório | |
| Unidades de filtro de 1000 mL 0,2 um | Thermo fisher Scientific | 567-0020 | |
| reservatórios de 25 mL | Termociência | 95128095 | |
| Tubos 50 mLFalcon | - | Consumáveis gerais de laboratório | |
| 96 placas de poço profundo - KingFisher DW | Termociência | 10373480 | |
| Lavadora automática de placas (opcional) | TECAN | Arruela microplacas HydroFlex Plus | |
| FHA da coqueluche B | Antígeno nativo | BP-FHA-50 | |
| Equilíbrio | - | Equipamentos gerais de laboratório | |
| Centrífuga de bancada | - | Equipamentos gerais de laboratório | |
| Esferas de COOH Magnéticas BioPlex Pro | Luminex | MC10xxx (x=região das contas) | |
| Albumina Sérica Bovina, BSA | Sigma | A7906 | |
| Branson Ultrassônico Bransonic Limpador Ultrassônico Modelo B200 | Fisher científica | 15-337-22 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | |
| CCHF GP | Antígeno nativo | REC31639-100 | |
| Contador celular/Hemacitômetro | Biorad/Merck | TC20 /Z359629 | |
| CHIKV E2 | Antígeno nativo | REC31617-100 | |
| CHIKV VLP | Antígeno nativo | CHIKV-VLP-100 | |
| Placas Imuno-Estéreis Transparentes de Fundo Plano, Não Estéreis de 96 Poços | Termociência | 3455 | |
| Partículas CMV | Antígeno nativo | CMV-HP-100 | |
| Contagem de lâminas, câmara dupla para contador de células & nbsp; | Biorad | L003662 A | |
| CP23 | Antígeno nativo | Produtor de produção | |
| CT694 | Antígeno nativo | Produtor de produção | |
| CtxB | |||
| DENV1 EDIII + SNAP | Produção interna | - | |
| DENV1 NS1 | Antígeno nativo | DENV1-NS1-100 | |
| DENV1 VLP | Antígeno nativo | DENVX4-VLP-100 | |
| DENV2 EDIII + SNAP | Produção interna | - | |
| DENV2 NS1 | Antígeno nativo | DENV2-NS1-100 | |
| DENV2 VLP | Antígeno nativo | DENVX4-VLP-100 | |
| DENV3 EDIII + SNAP | Produção interna | - | |
| DENV3 NS1 | Antígeno nativo | DENV3-NS1-100 | |
| DENV3 VLP | Antígeno nativo | DENVX4-VLP-100 | |
| DENV4 EDIII + SNAP | Produção interna | - | |
| DENV4 NS1 | Antígeno nativo | DENV4-NS1-100 | |
| DENV4 VLP | Antígeno nativo | DENVX4-VLP-100 | |
| difteria Tox | Antígeno nativo | DIP-TNL-100 | |
| EBV-GP125 | Antígeno nativo | REC31601-100 | |
| EDC | Sigma | 03449 | |
| Etanol 100% | - | Laboratório geral & nbsp; | |
| Vedação de alumínio não estéril | - | Geral | |
| Instrumento de Imagem por Fluorescência - Sistema MAGPIX | Luminex | MAGPIX-XPON4.1-CEIVD | |
| Ímã portátil para placas - Separador magnético de 96 poços | Luminex | CN-0269-01 | |
| hev-ORF2 | Antígeno nativo | REC31653-100 | |
| Inaba OSP | Boston_MGH | - | |
| Pente de ponta Kingfisher DeepWell de 96 poços | Termociência | 17170069 | |
| Leishmania K28 | Clinisciences | MBS3040095 | |
| Kit de Calibração Luminex MAGPIX | Luminex | MPX-CAL-K25 | |
| Kit de Verificação Luminex MAGPIX | Luminex | MPX-PVER-K25 | |
| Separador de tubos magnéticos | Invitrogen | DynaMag | |
| MAGPIX Drive Fluid Plus | Luminex | 40-50030 | |
| NP de sarampo | Antígeno nativo | REC31796 | |
| Agitador de microplaca | Randox | ||
| MICROPLACA, POÇO 96, PS, FUNDO EM F (POÇO DA CHAMINÉ) | Greiner-Bio | 655096 | |
| MiliQ H20 | - | Laboratório geral & nbsp; | |
| Pipetas multicanal 10, 300 | SARTORIUS | ||
| NIE | Antígeno nativo | Produtor de produção | |
| Ogawa OSP | Boston_MGH | - | |
| ONNV E2 | Clinisciences | IT-022-006Ep | |
| Instrumento de processador de partículas | Termociência | Thermo Scientific KingFisher Flex | |
| PBS 10x PH~7.0 | EUROMEDEX | ET330 | |
| Anticorpo secundário IgG Fc antihumano conjugado com PE | Pesquisa com a Jackson Immuno | 709-116-098 | |
| PfAMA1 | Produção interna | - | |
| PfMSP1 | Antígeno nativo | REC32013-100 | |
| PGP3 | Antígeno nativo | Produtor de produção | |
| Pontas de pipeta (fornecedor) 10 & micro; L, 200 & micro; L, 1000 & micro; L | - | Consumáveis gerais de laboratório | |
| Pm MSP1 | Clinisciences | CUST-PRT-31102024-1B | |
| Po MSP1 | Clinisciences | CUST-PRT-31102024-1A | |
| PvMSP1 | Antígeno nativo | REC31724-100 | |
| R software R4.4.1 | - | - | |
| Parque Nacional RVFV | Antígeno nativo | REC31640-100 | |
| Pipetas de canal único 10p, 20p, 200p, 1000p | Eppendorf | ||
| SNAP | Produção interna | - | |
| S-NHS | Sigma | 56485 | |
| Azida de sódio | Sigma | S2002 | |
| Solução de hipoclorito de sódio (água sanitária) | - | Água sanitária doméstica geral | |
| Toxina do tétano | Antígeno nativo | REC31801-100 | |
| Software Thermo Scientific BindIx versão 1.1 | ThermoFisher Scientific | - | |
| TRITON | Termo Científica | A16046 | |
| Rolo de tubo | IKA | Rolo 6D -100219627 | |
| Pré-adolescente-20 | Sigma | P7949 | |
| USUV EDIII + SNAP | Produção interna | - | |
| USUV NS1 | Antígeno nativo | USUV-NS1-100 | |
| Vortex | - | Equipamentos gerais de laboratório | |
| VSP3 | Antígeno nativo | Produtor de produção | |
| VSP5 | Antígeno nativo | Produtor de produção | |
| WNV EDIII + SNAP | Produção interna | - | |
| WNV NS1 | Antígeno nativo | WNV-NS1-100 | |
| Software xPONENT | Luminex | 89-30000-00-759 Rev A Mai-19 | |
| YFV EDIII + SNAP | Produção interna | - | |
| YFV NS1 | Antígeno nativo | YFV-NS1-100 | |
| ZIKV EDIII + SNAP | Produção interna | - | |
| ZIKV NS1 | Antígeno nativo | ZIKV-NS1-100 | |
| ZIKV VLP | Antígeno nativo | ZIKV-VLP-100 |
Referências
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