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Artigo de método

Avaliação da Dinâmica de Fissão/Fusão Mitocondrial em Células Tubulares Proximais Renais

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DOI:

10.3791/69268

⸱

14 de novembro de 2025

 ,  ,  ,  , 
1Lewis Katz Medical School at Temple University

Neste artigo

Resumo

Este artigo descreve o uso de microscopia confocal e ImageJ para avaliar a dinâmica de fissão/fusão mitocondrial via fluorescência de fotocomutação Dendra2.

Resumo

As mitocôndrias são mais reconhecidas por seu papel na síntese de ATP e servem como principais reguladores do metabolismo celular. A dinâmica mitocondrial compreende o movimento intracelular e intercelular das mitocôndrias, bem como os processos de fissão/fusão. Esses eventos são fundamentais para manter a função mitocondrial, mantendo a homeostase celular, morfologia, bioenergética, controle de qualidade e respostas ao estresse. Por outro lado, a desregulação da dinâmica mitocondrial afeta a morfologia e a função celular. A medição precisa dos eventos de fissão/fusão das mitocôndrias pode ser indicativa da saúde celular. As metodologias atuais para medir a dinâmica das mitocôndrias empregam imagens avançadas, como microscopia de super-resolução, técnicas de fluorescência (Recuperação de fluorescência após fotobranqueamento (FRAP)) para conectividade e ferramentas optogenéticas para controle espaço-temporal. A análise quantitativa utiliza ferramentas computacionais para medir parâmetros como comprimento, número e ramificação, que indicam o equilíbrio de fissão/fusão. No entanto, esses métodos exigem habilidades e instrumentos sofisticados. Neste artigo, descrevemos o uso de microscopia confocal combinada com ferramentas gratuitas no ImageJ (Fiji) para estudar eventos de fissão/fusão usando a propriedade de fotocomutação da proteína dendra2, marcada com o citocromo c mitocondrial.

Introdução

A mitocôndria é uma organela dinâmica que desempenha um papel vital na produção de energia, morte celular e transdução de sinal1. A morfologia mitocondrial refere-se ao tamanho e à forma dos compartimentos mitocondriais, que são altamente responsivos às condições intracelulares e extracelulares e são cruciais para a manutenção da saúde celular2. A morfologia das mitocôndrias pode fornecer informações importantes sobre sua função, no entanto, alterações na forma mitocondrial podem afetar o metabolismo celular e a saúde geral3. Interrupções da morfologia mitocondrial estão associadas a várias doenças, incluindo distúrbios neurodegenerativos, câncer e doenças metabólicas4. A morfologia mitocondrial é regulada dinamicamente por eventos de fusão e fissão/fusão, que são cruciais para manter a homeostase celular e responder a vários requisitos metabólicos 5,6.

A dinâmica mitocondrial ajuda a organela a responder a diferentes estressores e requisitos metabólicos7. Envolve fissão/fusão contínua e movimento de mitocôndrias dentro das células ou entre células. As mitocôndrias se adaptam às demandas de energia celular por meio de mudanças na morfologia por meio de eventos de fissão / fusão8. Esses processos determinam a forma mitocondrial e influenciam as funções mitocondriais, como produção de energia, produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e controle de qualidade mitocondrial 7,9,10. Além disso, a fissão/fusão mitocondrial são mecanismos de contrapeso que mantêm uma rede mitocondrial funcional11. A fusão permite a troca de conteúdos mitocondriais, promovendo complementação e tamponamento contra danos locais, enquanto a fissão permite a segregação e remoção de mitocôndrias danificadas via mitofagia 7,12. Além disso, a fissão ajuda a segregar os componentes danificados das mitocôndrias, que são então removidos pela mitofagia, um processo seletivo de autofagia13. A fusão, por outro lado, permite a complementação do conteúdo mitocondrial, diluindo quaisquer componentes danificados14. Os principais atores na fissão / fusão mitocondrial são as mitofusinas (MFN1 / 2), essenciais para a fusão da membrana mitocondrial externa15,16, (OPA1): esta GTPase semelhante à dinamina é responsável pela fusão da membrana mitocondrial interna16. As proteínas de fissão envolvem a proteína 1 relacionada à dinamina (Drp1), proteína pró-fissão 13,17. Proteína de fissão mitocondrial 1 (Fis1), fator de fissão mitocondrial (Mff) e regulador de fissão mitocondrial1 como (MTFR1L). Várias técnicas, como o EM de super-resolução, têm sido usadas para estudar a ultraestrutura mitocondrial18. A hibridização in situ de fluorescência de molécula única (smFISH) combinada com microscopia de super-resolução STED e MINFLUX (nanoscopia) tem sido usada para visualizar mRNA mitocondrial individual e proteínas associadas18. As técnicas de microscopia de localização de molécula única (SMLM) rastreiam as mudanças no espaçamento da membrana19. A microscopia de super-resolução da microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM) permite o estudo dos complexos da membrana interna mitocondrial20. No entanto, o uso desse equipamento avançado não é facilmente acessível. A microscopia confocal é acessível e requer menos experiência. Além disso, o desenvolvimento de proteínas fluorescentes direcionadas às mitocôndrias avançou significativamente o estudo da dinâmica mitocondrial em células vivas21, pois estamos usando a proteína fluorescente verde fotoativável (GFP) para visualizar e quantificar a fusão mitocondrial22.

Para estudar a fissão e fusão mitocondrial, as células são estressadas ou expostas a drogas como a cisplatina, que se liga ao DNA e induz danos ao DNA, culminando na apoptose mediada por mitocôndrias23. Neste estudo, usamos mitocôndrias Dendra2 marcadas fotocomutáveis de camundongos mitocôndrias fotoativáveis para estudar os eventos de fissão e fusão em células tubulares renais tratadas com cisplatina, pois são ricas em mitocôndrias e têm alta capacidade de regeneração. No entanto, este protocolo pode ser usado em qualquer tipo de célula que tenha mitocôndrias Dendra2 marcadas com foto-comutáveis ( Figura 1A-C ).

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Protocolo

Todo o trabalho com animais foi realizado de acordo com os protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Temple University, Temple University (Animal Protocol-5183). Os camundongos Pham, que possuem mitocôndrias expressando a proteína Dendra2, foram comprados.

1. Preparação do meio de cultura celular

  1. Isole as células tubulares proximais renais de acordo com o protocolo após serem separadas das células endoteliais glomerulares usando esferas24 (Figura 1A). Bouchareb et al., desenvolveram um método para isolar e cultivar células endoteliais glomerulares (GECs) dos rins de camundongos transgênicos que expressam mitocôndrias fluorescentes (mito-Dendra2) usando esferas magnéticas. Após o isolamento do GEC, os túbulos que restam no pellet são isolados e cultivados.
  2. Cultura de células tubulares proximais renais em placa de 10 cm com 10 mL de DMF-12 suplementado com 5% de FBS (inativado pelo calor), penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 μg/mL). Cultive túbulos por 2-3 dias até que eles migrem para fora dos túbulos.
  3. Selecione células tubulares por morfologia após morrer de fome (com DMF-12 sem FBS) por 2 dias.
    NOTA: Para os experimentos, use um disco com 50-70% de células confluentes. Conte as células com um hemocitômetro antes da semeadura.
  4. Semeando células para experimentos: Semeie as células em placas de cultura com fundo de vidro a uma densidade de 1-5 × 105 células por poço, dependendo dos requisitos experimentais. Deixe as células aderirem e crescerem durante a noite antes da adição de cisplatina.
    NOTA: A cisplatina é um medicamento quimioterápico perigoso, é crucial seguir os protocolos de segurança para proteger o pessoal e o meio ambiente. Para isso, siga as instruções de cabine de segurança biológica classe II, equipamento de proteção individual (EPI), descontaminação, controle de derramamento e descarte de resíduos (resíduos de medicamentos perigosos-quimioterapia): use luvas duplas, óculos de proteção, descontamine a superfície de trabalho e mantenha o kit de derramamento próximo à estação de trabalho, rotule claramente o recipiente de resíduos. Para DMSO, use EPI, trabalhe em uma capela e siga os procedimentos de descontaminação e descarte de derramamento.

2. Indução de estresse usando cisplatina

  1. Preparação do meio cisplatina
    1. Prepare uma solução estoque de 50 mM de cisplatina dissolvendo em DMSO.
    2. Placa 1-5 x 106 células tubulares proximais na placa de cultura com fundo de vidro, adicione 2 mL de meio DMF-12.
      NOTA: Qualquer disco de cultura com fundo de vidro pode ser usado.
    3. Adicione cisplatina a uma concentração final de 2 μM à placa experimental, para ter 0,004% como concentração final de DMSO.
      NOTA: Prepare 2 μL de cisplatina 50 mM diluída em 1.998 μL de meio DMF-12 livre de FBS e adicione 80 μL à placa experimental.
    4. Incubar as células durante 24 h.

3. Exames de imagem

  1. Usando o microscópio confocal
    1. Configure lasers para 405 nm (fotoconversão Dendra2), 488 nm (excitação Dendra2 não convertida) e 561 nm (Dendra2 fotoconvertido, Alexa 594).
    2. Ligue os lasers e aguarde a estabilização (~10 min)
  2. Estudando eventos de fissão e fusão
    1. Configure lasers para 405 nm (fotoconversão Dendra2), 488 nm (excitação Dendra2 não convertida) e 561 nm (Dendra2 fotoconvertido, Alexa 594).
    2. Coloque o disco de cultura na câmara de incubação.
    3. Adicione água ao redor da câmara e ajuste a temperatura para 37 °C. O fornecimento de CO2 deve ser mantido.
    4. Deixe a câmara de incubação equilibrar. A mudança de temperatura irá estressar as células.
    5. Visualize as células usando maior ampliação e resolução para imagens mitocondriais.
    6. Abra o menu suspenso no canto superior esquerdo e selecione as opções FRAP (Figura 2A-D).
    7. Defina a região de interesse (ROI) usando o software LAS X, onde o fotobranqueamento será realizado.
      NOTA: A região de interesse pode ser desenhada em qualquer tamanho, o que não afeta os resultados, pois as mitocôndrias individuais são analisadas.
    8. Adquira uma série de imagens pré-branqueamento em baixa intensidade de laser para estabelecer a intensidade de fluorescência da linha de base. Setlasersto405nmcomprimento de onda para fotocomutação (0,00), 48 nm (0,20) e 56 nm (0,20), garantindo que as células estejam focadas.
      NOTA: Os valores entre parênteses após os comprimentos de onda do laser indicam intensidades de laser que podem ser definidas para qualquer valor, pois isso não afeta o fotobranqueamento.
    9. Para fotobranquear as células, aplique um pulso de laser de alta intensidade para branquear no ROI. Defina os lasers FRAP para 405 nm (4.00), 488 nm (0.00) e 561 nm (0.00). Defina o pré-branqueamento para 5.140 s para 59 iterações e o pós-branqueamento para o tempo desejado (Figura 2B) (a intensidade do laser pré-branqueamento e pós-branqueamento é mencionada entre parênteses).
    10. Para imagens pós-branqueamento, continue a adquirir imagens em baixa intensidade de laser para observar a recuperação da fluorescência por 10 min. Mantenha os lasers FRAP em 405 nm (0.00), 488 nm (0.50) e 561 nm (0.50).
      NOTA: O tempo de branqueamento pode diferir dependendo dos tipos de células, em nossas mãos, tempos de branqueamento semelhantes foram usados para mitocôndrias em células tubulares e células intersticiais de válvula (VIC). Uma vez concluído o FRAP, as imagens ou imagens de células vivas (Figura 3 e Vídeo Suplementar 1) podem ser feitas, além de adquirir as imagens pós-clareamento.

4. Análise de imagem

NOTA: Como as mitocôndrias são marcadas com a proteína Dendra2, ao serem submetidas ao fotobranqueamento, uma mudança conformacional irreversível na proteína dendra2 leva a um aumento na fluorescência vermelha detectada através do laser de 561 nm. Quando as mitocôndrias vermelhas se fundem com as mitocôndrias verdes não branqueadas, a combinação dá uma cor amarela. Aproveitando esse fenômeno, os eventos dinâmicos de fissão / fusão podem ser medidos.

  1. Traçando o perfil das mitocôndrias vermelhas e verdes fundidas
    1. Instale o plug-in do criador de perfil RGB para criar o perfil do sinal vermelho e verde na seleção.
      NOTA: Siga as instruções no site para adicionar o plug-in à seção Fiji.
    2. Abra ImageJ (Figura 4A).
    3. No menu Arquivo , localize e abra o arquivo a ser analisado (Figura 4B).
    4. Selecione a composição do modo de cor, marque a opção de escala automática e abra o vídeo para analisar (Figura 4C).
    5. Selecione uma área retangular para analisar (Figura 4D).
    6. Passe o mouse perto da área do retângulo selecionada, clique com o botão direito do mouse e selecione duplicar (Figura 4E).
    7. Selecione a opção duplicar hiperpilha , que duplica todas as pilhas de imagens (Figura 4F).
    8. Para converter a pilha duplicada para o formato RGB, selecione a imagem e selecione a opção RGB no menu suspenso da imagem (Figura 4G-H).
    9. A imagem RGB é duplicada, selecionando apenas um quadro (Figura 4I).
    10. Se as mitocôndrias na imagem forem curvas, desenhe uma linha ao longo de seu comprimento. Em seguida, vá para o menu Editar , escolha Seleção e clique em Endireitar (Figura 5A).
    11. Escolha um título para a imagem e defina a largura da linha para 20 pixels (Figura 5B).
    12. Depois de endireitar as mitocôndrias, desenhe uma linha ao longo das mitocôndrias de interesse para garantir que esteja alinhada com uma linha reta (Figura 5C).
    13. Abra o plug-in RGB Profiler (Figura 5D).
    14. Uma vez ativado, o plug-in gerará um gráfico mostrando as intensidades de fluorescência vermelha e verde ao longo da linha desenhada. A altura de cada pico é diretamente proporcional à intensidade de fluorescência (Figura 5E).
      NOTA: A morfologia mitocondrial também pode ser calculada usando o plug-in do analisador de mitocôndrias25. Selecione as regiões usadas para exposição, analise o limite nas regiões selecionadas e, em seguida, meça a morfologia das mitocôndrias e a análise 2D. O perímetro da área e outros parâmetros podem ser selecionados.

5. Analise eventos de fusão

  1. Estabeleça a linha de base pré-fusão: Antes da fusão mitocondrial, confirme se a fluorescência vermelha (561 nm) está localizada em uma mitocôndria e a fluorescência verde (488 nm) em uma adjacente. O gráfico de intensidade correspondente deve exibir dois picos distintos, um vermelho e um verde, com sobreposição mínima.
  2. Confirme o evento pós-fusão: Após a fusão, o sinal vermelho (representando o conteúdo da matriz Dendra2) deve se espalhar para a mitocôndria verde adjacente, indicando mistura de conteúdo. O gráfico de intensidade agora mostrará picos vermelhos e verdes sobrepostos, confirmando um evento de fusão.
  3. A avaliação dos eventos de fusão pode ser determinada selecionando cuidadosamente as mitocôndrias saudáveis e as mitocôndrias fotobranqueadas para fusão na imagem de células vivas. Uma mudança na proporção de vermelho / verde ao longo do tempo indicaria o evento de fusão.

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Resultados

As células epiteliais tubulares primárias foram isoladas do rim de camundongo por digestão enzimática e cultivadas em DMF-12 suplementado com 5% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina a 37 °C sob 5% de CO2. Ao atingir 80% de confluência, as células foram tripsinizadas (0,25% de tripsina-EDTA) e semeadas a uma densidade de 5 × 104 células por poço em placas de cultura de fundo de vidro, pré-revestidas com colágeno.

O meio de cultura conti...

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Discussão

A fissão/fusão mitocondrial são processos dinâmicos cruciais que mantêm a homeostase mitocondrial e a viabilidade celular26. A avaliação adequada desses processos requer técnicas avançadas de imagem para visualizar e quantificar a morfologia, dinâmica e função mitocondrial27,28. Várias técnicas têm sido usadas para medir a fissão/fusão mitocondrial. Algumas das ferramentas sofisticadas incluem a nanoscopia...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por bolsas de pesquisa do National Institute of Health número 5R01DK135470-03, ISAC-NIH grant 5U24DK128851-03 e bolsa de pós-doutorado da American Heart Association.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Cultura Celularnbsp;
DMEM/F12 Meio basal  (Gibco/Cat. Nº 11320033 ) Cultura celular tubular proximal  
Soro Fetal Bovino (FBS) 5-10% de suplementação  (Biowest/Cat. Nº S181B) e nbsp;Enriquecimento do meio cultural  
Penicilina-Estreptomicina 100X (Gibco/Cat. Nº 15140122)  Proteção antibiótica & nbsp;
Colágeno IV & nbsp;revestimento  (Sigma-C5533-5M) Revestimento de placas Ibidi  
Tripsina-EDTA 0,25% solução  (Gibco/Cat. Nº 25200056) Destacamento de celas 
Salina Tamponada com Fosfato (PBS) (Gibco/Cat. Nº 10010023 ) Lavagem de células 
Tratamentos 
Cisplatina 2 & micro; M concentração de trabalho  (Selleck Chemicals/Cat. Nº S1166) e nbsp;Indução de estresse   
Dimetil Sulfóxido (DMSO) Controle de Veículos & NBSP;(Fisher Scientific/Cat. Nº D1391) e nbsp;Controle de solventes de cisplatina  
Imagem 
Médio Vermelho Livre de Fenol  Imagem ao vivo  (Gibco/Cat. Nº 21041025) Fluorescência de fundo reduzida 
Biologia Molecular  
TRIzol®  Extração de RNA  (Gibco/Cat. Nº 15596018) Isolamento total de RNA  
SYBR Green Master Mix  qPCR química (Thermo Scientific/Cat. Nº K0221) Expressão gênica da dinâmica mitocondrial (DNM1L, FIS1, MFN1, MFN2, OPA1) e nbsp;
Ferramentas Fluorescentes  
Dendra2 Etiqueta matricial mitocondrial  Laboratório Jacson (PhAMexcisado) Repórter fotocomutável (conversão 405nm, imagem 488/561nm) & nbsp;
Microscópios 
Microscópio Confocal  Leica DMi8 Imagem de células vivas e FRAP lasers de 405nm/488nm/561nm 
Imagem J https://imagej.net/software/fiji/downloads 
RGB Profiler Plugin https://imagej.net/ij/plugins/rgb-profiler.html. Análise de eventos de fusão (sobreposição de sinais vermelho/verde) 

Referências

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