Artigo de método

Imagem de células vivas do transporte endocítico usando nanocorpos funcionalizados em células cultivadas

DOI:

10.3791/69284

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17 de outubro de 2025

 ,  ,  , 
1Biozentrum, University of Basel

Neste artigo

Resumo

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O transporte endocítico e retrógrado de proteínas da membrana plasmática para a rede trans-Golgi é essencial para manter a homeostase da membrana e regular a sinalização. Aqui, descrevemos um método para obter imagens e quantificar o transporte endocítico de proteínas de carga transmembrana por microscopia de células vivas usando nanocorpos anti-GFP derivatizados em células HeLa.

Resumo

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A endocitose de receptores e outras proteínas transmembranares da superfície celular para os endossomos e além é crítica para a homeostase, fisiologia e função. Para investigar a captação endocítica e o tráfego retrógrado de proteínas, estabelecemos um kit de ferramentas versátil composto por nanocorpos funcionalizados para monitorar o transporte da superfície celular para a rede trans-Golgi (TGN) por meio de imagens fixas e de células vivas, microscopia eletrônica e eletroforese em gel combinada com autorradiografia. Desenvolvemos nanocorpos derivatizados direcionados à proteína fluorescente verde (GFP) ou mCherry - ligantes de proteínas monoméricas, não reticulantes e de alta afinidade - que podem ser adicionados a linhagens celulares que expressam proteínas de membrana de interesse com as etiquetas de fluorescência extracelular correspondentes. Ao se ligarem a repórteres transmembranares marcados com GFP ou mCherry, os nanocorpos são especificamente internalizados e trafegados em paralelo com as rotas de classificação endógenas dos repórteres. Esses nanocorpos foram funcionalizados com fluoróforos selecionados para rastrear o transporte retrógrado por microscopia de fluorescência e imagens ao vivo, com ascorbato peroxidase 2 (APEX2) para resolver a localização ultraestrutural por microscopia eletrônica e com motivos de sulfatação de tirosina para avaliar quantitativamente a cinética de chegada do TGN. Neste estudo metodológico, detalhamos o protocolo geral para expressão bacteriana e purificação de nanocorpos funcionalizados, bem como a geração de linhagens celulares GFP-repórter estáveis. Exemplificamos a utilidade dessa abordagem para imagens de células vivas, empregando um nanocorpo anti-GFP modificado por mCherry (VHH-mCherry) para analisar a captação endocítica do receptor de transferrina (TfR) e do receptor de manose-6-fosfato dependente de cátions (CDMPR).

Introdução

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A endocitose de receptores e outras proteínas transmembranares (MT) da membrana plasmática para vários compartimentos intracelulares é importante para a manutenção da homeostase da membrana 1,2. Após a internalização por endocitose dependente ou independente de clatrina, as cargas proteicas primeiro povoam os endossomos iniciais, de onde são classificadas ao longo do sistema endolisossomal, recicladas para a membrana plasmática ou enviadas retrógradamente para a rede trans-Golgi (TGN) 3 , 4 , 5 . A reciclagem dos endossomos e / ou da superfície celular para o TGN faz parte do ciclo funcional de vários receptores de carga transmembrana, como os receptores de manose-6-fosfato dependentes e independentes de cátions (CDMPR e CIMPR), fornecendo hidrolases lisossômicas recém-sintetizadas do TGN para endossomos tardios e lisossomos 6,7,8, Wntless (WLS) transporta ligantes Wnt para a superfície celular9, 10,11,12 ou TGN46 que escolta proteínas de carga secretora solúveis, incluindo fator pancreático regulado positivamente (PAUF) e outras cargas CARTS, do TGN 13,14,15,16. Enquanto todos esses receptores de carga comutam através do TGN para a coleta de novas proteínas clientes, o receptor de transferrina (TfR) que internaliza a transferrina ligada ao ferro é excluído do retorno de Golgi 17,18,19,20,21.

Para investigar o tráfego endocítico e retrógrado, estabelecemos anteriormente um kit de ferramentas baseado em nanocorpos projetado para rotular e rastrear proteínas de carga da superfície celular para os compartimentos intracelulares17. Os nanocorpos constituem uma nova classe de ligantes de proteínas derivadas de anticorpos homodiméricos de cadeia pesada (hcAbs) encontrados naturalmente em camelídeos e peixes cartilaginosos22,23. Eles representam o domínio variável de cadeia pesada (VHH) de hcAbs e oferecem inúmeras vantagens sobre os anticorpos convencionais (por exemplo, IgGs): são monoméricos, pequenos (~ 15 kDa), altamente solúveis, não possuem ligações dissulfeto, podem ser expressos por bactérias e são passíveis de seleção para ligação de alta afinidade24. Para aumentar a versatilidade e a ampla aplicabilidade deste kit de ferramentas de nanocorpos, empregamos nanocorpos anti-GFP funcionalizados para marcar e rastrear proteínas marcadas com tags GFP em seus domínios extracelulares ou luminais. Por meio da conjugação recombinante de nanocorpos com sequências de mCherry, ascorbato peroxidase 2 (APEX2) ou sulfação de tirosina, o tráfego retrógrado de proteínas de carga transmembrana genuínas pode ser analisado por microscopia de fluorescência fixa e de células vivas, microscopia eletrônica ou ensaios bioquímicos usando autorradiografia. Dado que a sulfação da tirosina, catalisada pelas tirosilproteínas sulfotransferases TPST1 e TPST2, é uma modificação pós-traducional confinada ao trans-Golgi / TGN, essa estratégia permite a avaliação direta da dinâmica e cinética de transporte da superfície celular para o compartimento de Golgi25 , 26 , 27 . Mais recentemente, expandimos esse repertório de ligantes de proteínas funcionalizadas para incluir nanocorpos anti-mCherry derivatizados. Esses reagentes provaram ser fundamentais na dissecação de vias de transporte dependentes de máquinas de MPRs, particularmente do CDMPR 17,28, para o TGN por meio de análises bioquímicas.

Enquanto o estudo anterior se concentrou principalmente na aplicação de nanocorpos modificados com sequências de sulfatação de tirosina para avaliar bioquimicamente a chegada de TGN por autorradiografia19, este artigo de métodos descreve a geração de nanocorpos funcionalizados e marcados com fluorescência (VHH-mCherry) e linhagens celulares repórteres para imagens de células vivas do tráfego endocítico. Em combinação com uma proteína repórter fluorescente residente em Golgi adicional, este protocolo pode ser adaptado para servir como um fluxo de trabalho robusto para analisar quantitativamente imagens de células vivas do transporte de endossomo para TGN de proteínas de carga selecionadas.

Antes de aplicar este protocolo, os pesquisadores devem garantir que a proteína-alvo seja expressa como uma construção de fusão marcada com GFP, normalmente gerada por abordagens de clonagem molecular padrão. Nanocorpos funcionalizados podem ser prontamente produzidos em bactérias com rendimentos suficientes para experimentos de marcação de superfície, com concentrações de trabalho na faixa nanomolar baixa sendo adequadas para a maioria dos ensaios de imagem de células vivas. Os usuários também devem considerar que a cinética de transporte pode variar entre as proteínas de carga, exigindo ajuste da duração da marcação ou frequência de imagem para visualização ideal do tráfego endocítico ou endossomo para TGN.

Protocolo

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1. Transformação bacteriana com VHH-mCherry

NOTA: Este protocolo foi otimizado para a expressão, purificação e análise de nanocorpos anti-GFP funcionalizados, conforme descrito anteriormente17. As etapas a seguir são adaptadas para VHH-mCherry e são consistentes com o relatório metodológico anterior19.

  1. Descongele bactérias quimiocompetentes (50-100 μL) adequadas para a expressão de proteínas (por exemplo, células de Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3)) colocando-as no gelo.
    NOTA: Prepare células bacterianas quimiocompetentes seguindo os protocolos laboratoriais padrão. Células BL21 (DE3) comercialmente disponíveis do NEB podem ser empregadas para isso.
  2. Adicione 50 ng de um plasmídeo que codifica a construção VHH-mCherry funcionalizada (Addgene # 109421). Para garantir a biotinilação eficiente e específica do local do repórter do nanocorpo durante a expressão bacteriana, co-transforme com um excesso de três vezes (150 ng) de um plasmídeo que codifica a biotina ligase bacteriana BirA (Addgene # 109424). Mova suavemente o tubo 4x-5x para misturar células e DNA de plasmídeo.
    NOTA: A cotransformação com o plasmídeo codificador de BirA não é necessária se a biotinilação pelo peptídeo aceptor de biotina (BAP) não for necessária.
  3. Incube a mistura no gelo por 30 min. Evite agitação durante esta etapa.
  4. Choque térmico das células bacterianas, colocando-as durante exactamente 20 s a 42 °C num banho-maria ou num bloco de aquecimento.
  5. Adicionar 1 ml de meio de caldo Luria (LB) à temperatura ambiente (RT) e incubar as bactérias transformadas num termoshaker (250-500 rpm) durante 1 h a 37 °C para permitir a expressão fenotípica de genes de resistência a antibióticos.
    NOTA: Para preparar 1 L LB de meio, adicione 5 g de extrato de levedura, 10 g de triptona, 10 g de NaCl e complete o volume com água e esterilize em autoclavagem.
  6. Pulverize as bactérias por centrifugação a 11.000 x g por 1 min e ressuspenda o pellet em 100 μL de meio LB fresco. Misture bem pipetando.
  7. Coloque as bactérias suspensas em placas LB pré-aquecidas contendo os antibióticos apropriados (por exemplo, com 50 μg / mL de canamicina; se co-transformado com BirA, inclua também 50 μg / mL de carbenicilina, consulte a etapa 1.2).
  8. Incubar as placas LB suplementadas com antibióticos de cabeça para baixo a 37 °C durante 13-15 h.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. As placas com colônias crescidas podem ser armazenadas a 4 °C e seladas com filme permeável para evitar a secagem.

2. Cultura líquida bacteriana e indução da expressão de VHH-mCherry

  1. Selecionar uma única colónia bacteriana da placa de transformação e inoculá-la num Erlenmeyer contendo 20 ml de meio LB suplementado com antibióticos. Incubar a cultura numa estufa agitada durante 13-15 h a 37 °C (ver também o passo 1.7 relativo aos antibióticos de seleção).
  2. No dia seguinte, diluir a cultura bacteriana de 20 mL durante a noite em um frasco fresco contendo 1 L de meio LB com os antibióticos de seleção correspondentes.
  3. Continuar a incubar a 37 °C até que a cultura atinja uma densidade óptica a 600 nm (OD600) de 0,6-0,7.
    NOTA: Deixe a cultura arrefecer até à RT ou a 16 °C antes da indução da expressão da proteína.
  4. Induza a expressão de VHH-mCherry (e BirA, se co-expresso) adicionando 1 mL de 1 M isopropil-β-D-tiogalactopiranoside (IPTG) para atingir uma concentração final de 1 mM do indutor (diluição 1:1000). Se a cotransformação com o plasmídeo de expressão BirA foi realizada, também suplementar a cultura com 10 mL de uma solução estoque de D-biotina 20 mM, produzindo uma concentração final de 200 μM de D-biotina no meio de crescimento. Isso facilita a biotinilação in vivo do epítopo aceptor de biotina (BAP) presente na construção VHH-mCherry.
    NOTA: Preparar a reserva de D-biotina em ddH2O e solubilizá-la por adição gradual de 500 mM NaH2PO4.
  5. Incubar a cultura de 1 L induzida por IPTG por 13-15 h a 16 °C para promover o dobramento e o rendimento ideais de proteínas.
    NOTA: As condições de expressão para construções de nanocorpos recém-projetadas com outras tags fluorescentes podem exigir otimização empírica pelo investigador.
  6. Transferir a cultura para um frasco de centrifugação de 1 L e colher as células por centrifugação a 5.000 x g a 4 °C durante 45 min. Rejeitar o sobrenadante nos biorresíduos líquidos adequados e prosseguir com as etapas de purificação.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado neste ponto, armazenando o pellet bacteriano a -80 °C. O pellet VHH-mCherry normalmente aparece rosa, indicando dobramento adequado da proteína de fusão fluorescente.

3. Purificação baseada em IMAC de VHH-mCherry

  1. Se necessário, descongele o grânulo bacteriano congelado no gelo (consulte também a etapa 2.6).
  2. Adicione 30 mL de tampão de ligação gelado (20 mM de imidazol em 1x PBS) ao pellet de células bacterianas e ressuspenda completamente pipetando para cima e para baixo. Transfira a suspensão para um tubo de centrífuga de 50 mL rotulado.
  3. Suplementar as células ressuspensas com 200 μg / mL de lisozima, 20 μg / mL de DNase I, 1 mM de MgCl2 e 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF). Incubar a mistura durante 10 min em RT, seguida de 1 h a 4 °C num rotador de ponta a ponta.
    NOTA: PMSF é tóxico. Prepare e manuseie soluções de estoque em um exaustor químico usando luvas, jaleco e proteção para os olhos; descarte os resíduos contendo PMSF em recipientes de resíduos orgânicos halogenados. Para os experimentos, uma solução estoque 0,1 M foi usada e posteriormente diluída.
  4. Interrompa mecanicamente as células bacterianas usando um sonicador de ponta inserido diretamente na suspensão. Aplique três pulsos de sonicação constantes de 1 min, permitindo um intervalo de resfriamento de 1 min entre cada pulso com as configurações especificadas do sonicador (tamanho da ponta da sonda: 6 mm, ponta sólida; Amplitude 40%; Ciclo de trabalho (modo de pulso): 1 s ON/1 s OFF)
  5. Clarificar o lisado por centrifugação a 15.000 x g a 4 °C durante 45 min para sedimentar restos de células bacterianas e bactérias intactas.
    NOTA: O lisado pode ser transferido para uma garrafa de centrífuga ou aliquotado em tubos de 5 mL para centrifugação de bancada.
  6. Transfira cuidadosamente o sobrenadante resultante para um novo tubo de 50 ml e elimine o pellet para os resíduos biológicos apropriados.
  7. Manter o lisado limpo em gelo enquanto se prepara para a cromatografia de afinidade de metais imobilizados (IMAC). Para isolamento de nanocorpos marcados com histidina, utilize colunas de purificação His-tag pré-embaladas e de uso único, otimizadas para operação de fluxo por gravidade.
  8. Fixe as colunas de Ni-NTA (ácido nitrilotriacético) num suporte metálico ou num suporte de coluna adequado.
    1. Drene o tampão de armazenamento das colunas e equilibre com 10 mL de tampão de ligação (20 mM de imidazol em 1x PBS).
    2. Permitir que o tampão passe por gravidade; descartar o fluxo como biorresíduos.
  9. Aplique gradualmente o lisado bacteriano eliminado (~ 30 mL) na coluna. Deixe-o fluir por gravidade e descarte o fluxo.
  10. Lave a coluna com dois volumes consecutivos de 10 mL de tampão de ligação (20 mM de imidazol em 1x PBS).
  11. Eluir os nanocorpos ligados com 2 mL de tampão de eluição (500 mM de imidazol em 1x PBS) em um tubo de microcentrífuga de 2 mL.
  12. Execute uma troca de buffer.
    1. Equilibre uma coluna de dessalinização colocada em um adaptador de tubo de 50 mL enxaguando 5x com 5 mL de 1x PBS.
    2. Deixe o tampão entrar totalmente na resina embalada; descarte o fluxo. Após a lavagem final do PBS, centrifugue a coluna a 1.000 x g por 2 min.
    3. Descarte o fluxo. Coloque a coluna com o adaptador em um novo tubo de 50 mL. Carregue 2 mL de nanocorpo funcionalizado eluído (da etapa 3.11) na coluna de dessalinização balanceada com PBS e gire a 1.000 x g por 2 min e colete o eluato.
      NOTA: A diálise pode ser usada alternativamente para troca de tampão.
  13. Quantificar a concentração da proteína VHH-mCherry purificada utilizando um ácido bicinconínico (BCA) ou o ensaio de Bradford, de acordo com os protocolos do fabricante.
    NOTA: Para uma absorção eficiente de nanocorpos em aplicações de imagem de células vivas, recomenda-se uma concentração final de estoque de 5-10 mg / mL.

4. Validação da expressão e pureza de VHH-mCherry (coloração de Coomassie)

  1. Prepare um gel de dodecil sulfato-poliacrilamida a 10% de sódio (SDS-PAGE) de acordo com os protocolos laboratoriais estabelecidos.
    NOTA: Como alternativa, os géis gradientes pré-moldados disponíveis comercialmente da Bio-Rad podem ser empregados para conveniência e reprodutibilidade.
  2. Alíquota de 20 μg de VHH-mCherry purificado em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e desnaturar por ebulição em tampão de amostra a 95 °C por 5 min.
  3. Carregue a amostra de nanocorpo desnaturado no gel de poliacrilamida SDS e realize eletroforese seguindo os procedimentos padrão de PAGE até que o corante de rastreamento (por exemplo, azul de bromofenol) atinja o fundo do gel de resolução.
  4. Prossiga com a coloração de Coomassie e a descoloração do gel.
    1. Remova cuidadosamente o gel do e mergulhe-o na solução de coloração Coomassie (5% de um estoque de Coomassie Brilliant Blue de 10 g/L em ácido acético a 10% e metanol a 45% em ddH2O) por 20-30 min em RT em uma plataforma de agitação suave. Certifique-se de que o gel esteja totalmente submerso na solução de coloração.
    2. Destain o gel usando uma solução de descoloração (ácido acético 7,5% e metanol 15% em ddH2O), realizando 2-3 lavagens sequenciais de 1 h cada em RT. Para uma redução ideal do fundo, deixe o gel por 13-15 h em solução de descoloração fresca.
      NOTA: O excesso de corante pode ser absorvido de forma eficaz colocando toalhas de papel domésticas ao redor do gel durante o processo de descoloração. As soluções de coloração/descoloração contêm metanol inflamável e ácido acético irritante. Use em um exaustor, use luvas e óculos de proteção e colete as soluções gastas em recipientes designados para resíduos de líquidos inflamáveis.
  5. Visualize o gel usando um sistema de documentação de gel ou câmera de sua escolha.
    NOTA: Para confirmação adicional da expressão de nanocorpos, pode ser realizado immunoblotting usando anticorpos específicos de epítopos (ver também Figura 1C).

5. Geração de linhagens celulares HeLa repórter marcadas com GFP usando transdução retroviral

NOTA: Várias linhagens celulares HeLa α Kyoto repórter GFP (aqui simplesmente chamadas de HeLa ou HeLa α) foram geradas anteriormente17. Com o objetivo de demonstrar o ensaio de imagem de células vivas, CDMPR ou TfR marcados com GFP, como proteínas de carga representativas, são empregados. Enquanto as proteínas TM com topologia tipo I são marcadas com GFP no terminal N extremo, as proteínas TM com topologia tipo II requerem fusão GFP C-terminal.

  1. Os genes que codificam para EGFP-CDMPR (Addgene # 182642) ou TfR-EGFP (# 243763) foram previamente subclonados no vetor retroviral pQCXIP usando técnicas padrão de clonagem de enzimas de restrição17. Após a transformação em E. coli quimiocompetente, prepare DNA de plasmídeo de alta pureza usando kits de preparação midi (por exemplo, de Macherey-Nagel).
    NOTA: As células bacterianas quimiamente competentes devem ser preparadas seguindo os protocolos laboratoriais padrão. A E. coli competente NEB 5-alfa da NEB pode ser usada para clonagem e purificação de plasmídeos.
  2. Para gerar linhagens celulares repórter HeLa GFP estáveis, partículas retrovirais são produzidas por transfecção da linha celular de embalagem Phoenix ampho. Todo o trabalho de cultura de células é conduzido em condições de fluxo laminar BSL2.
    1. No dia anterior à transfecção, semeie 2,0-3,0 x 106 células de anfo Phoenix em um prato de 10 cm em 10 mL de meio para atingir 60%-80% de confluência no dia seguinte. Os anfóricos Phoenix são mantidos em DMEM GlutaMAX-I com alto teor de glicose com 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 unidades/mL de penicilina/estreptomicina e 1 mM de piruvato de sódio.
    2. No dia da transfecção, substitua o meio por 10 mL de meio completo fresco.
    3. Em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, combine 1 mL de GlutaMAX-I com alto teor de glicose DMEM sem soro e suplemento com 10 μg de pQCXIP-EGFP-CDMPR ou pQCXIP-TfR-EGFP e 30 μL de reagente de transfecção FuGENE HD. Misture bem pipetando.
    4. Incubar a mistura à temperatura ambiente durante 15 min para permitir a formação de complexos DNA-reagentes.
    5. Adicione toda a mistura de transfecção gota a gota à cultura de anfo Phoenix. Agite a placa suavemente para distribuir os complexos uniformemente.
    6. Incubar células anfo Phoenix transfectadas por 13-15 h a 37 ° C com 5% de CO2.
      NOTA: Podem ser utilizadas linhas celulares de embalagem alternativas, desde que sejam compatíveis com o sistema vetorial Retro-X Q.
  3. No dia seguinte, descarte o meio de transfecção e substitua-o por 7 mL de meio completo fresco para aumentar a produção viral.
  4. Às 48 h e, opcionalmente, 72 h após a transfecção, colete o sobrenadante da cultura (~ 7 mL) contendo partículas virais usando um auxiliar de pipeta. Monitore a expressão de GFP em células Phoenix ampho transfectadas usando um microscópio de fluorescência ou sistema de imagem (por exemplo, Bio-Rad ZOE).
    NOTA: Novamente, as manipulações retrovirais requerem contenção BSL-2. Execute todo o trabalho em um gabinete de biossegurança certificado, use luvas, jaleco e proteção para os olhos e descontamine as superfícies com hexaquart a 1% seguido de etanol a 70% antes de descartar os resíduos em autoclave.
  5. Filtrar o sobrenadante viral recolhido através de um filtro de 0,45 μm. O sobrenadante filtrado pode ser utilizado imediatamente (ver passo 5.7) ou armazenado a 4 °C para utilização a curto prazo ou a -80 °C para armazenamento a longo prazo. Observe que os títulos virais podem diminuir após o congelamento.
  6. Para estabelecer células HeLa repórter GFP estáveis, prossiga com a transdução retroviral usando o sobrenadante viral filtrado. Todos os procedimentos devem ser realizados sob as condições BSL2.
    1. Um dia antes da transdução, semear aproximadamente 2,0-3,0 x 106 células de α HeLa em uma placa de 10 cm com 10 mL de meio para atingir 60%-80% de confluência no dia seguinte. As células HeLa α de cultura são cultivadas em GlutaMAX-I com alto teor de glicose DMEM suplementada com 10% de FBS e 100 U/mL de penicilina/estreptomicina.
    2. Misture o sobrenadante viral filtrado com 15 μg / mL de polibreno (brometo de hexadimerina) para aumentar a eficiência da infecção.
      NOTA: Polybrene é um irritante - durante a preparação do caldo, manuseie com luvas e proteção para os olhos, evite a formação de aerossóis e descarte as soluções contendo Polybrene como resíduos químicos perigosos.
    3. No dia seguinte, substitua o meio de crescimento padrão por sobrenadante viral não diluído contendo Polybrene, garantindo que toda a superfície do prato esteja coberta.
    4. Incubar células HeLa α sob transdução por 13-15 h a 37 ° C com 5% de CO2.
      NOTA: Para determinar o título viral, podem ser realizados ensaios de diluição em série e infecção em células HeLa α. A titulação, neste caso, é opcional, pois os retrovírus infectam apenas as células em divisão.
  7. No dia seguinte à transdução, descarte o meio viral em resíduos BSL2 e substitua-o por 10 mL de meio HeLa α completo fresco. Incubar durante 13-15 h a 37 °C com 5% de CO2.
  8. No dia seguinte, inicie a seleção substituindo o meio por meio completo contendo 1,5 μg / mL de puromicina.
  9. Mantenha a pressão de seleção por 2-3 semanas, passando as células conforme necessário. Antes de transferir células geneticamente modificadas para um ambiente BSL1, certifique-se de que elas estejam livres de partículas virais competentes para replicação.
  10. Para obter uma população homogênea, use o isolamento clonal usando anéis ou cilindros de clonagem ou a classificação de células ativadas por fluorescência (FACS). O FACS pode ser realizado em células de α HeLa transduzidas usando FACSAria III ou Fusion (BD Biosciences) para enriquecer uma população com expressão uniforme de GFP com base na intensidade de fluorescência.
    NOTA: A expressão do repórter GFP em células HeLa α pode ser validada por microscopia de fluorescência de células fixas ou immunoblotting com anticorpos anti-GFP (ver também Figura 2C).

6. Captação de VHH-mCherry por células cultivadas para imagens de células vivas

NOTA: Todos os procedimentos de cultura de células são realizados em condições estéreis dentro de uma capela de fluxo laminar antes da microscopia de células vivas.

  1. 6.1Sob fluxo laminar estéril, semeie aproximadamente 50.000 a 110.000 células HeLa expressando de forma estável construções de repórter CDMPR ou TfR marcadas com GFP em cada poço de uma lâmina de câmara ibiTreat de 4 poços de lâmina de μ. Use 700 μL de meio de cultura completo contendo antibióticos (DMEM com alto teor de glicose, sem vermelho de fenol), suplementado com 10% de FBS, 100 U / mL de penicilina / estreptomicina, 2 mM de l-glutamina e 1,5 μg / mL de puromicina.
  2. Incubar as células durante 13-15 h a 37 °C numa incubadora humidificada com 5% de CO2 para permitir a adesão e proliferação adequadas. As células devem atingir aproximadamente 80% de confluência no dia seguinte.
  3. No dia da imagem, pouco antes do experimento, substitua suavemente o meio em cada poço por 350 μL de meio completo fresco sem vermelho de fenol.
  4. Paralelamente, preparar uma solução de trabalho VHH-mCherry a uma concentração final de 2,5 μg/ml (aproximadamente 50 nM) em meio pré-aquecido sem vermelho de fenol. Manter a solução a 37 °C até à utilização.
  5. Depois de inicializar o sistema automatizado de imagem de células vivas (por exemplo, FEI MORE ou Nikon Ti2 X-Light V3), pré-aqueça a câmara de incubação do microscópio a 37 °C com 5% de CO2 antes de transferir a câmara de microscopia ibidi para o microscópio e definir as configurações de aquisição da seguinte forma.
    1. Escolha o U PlanS Apo 100x NA 1.4 e adicione a câmara de microscopia ibidi no estágio do microscópio.
    2. Configure dois canais com o comprimento de onda de excitação apropriado e filtros de emissão passa-banda única para EGFP (ex: 470/20 nm, em: 517/20 nm) e mCherry (ex: 550/15 nm, em: 590/20 nm).
    3. Escolha um tempo de exposição curto e baixa intensidade de iluminação para evitar o fotobranqueamento (por exemplo, 50 ms e 5% de potência para EGFP, 160 ms e 25% para mCherry). É importante que os valores escolhidos sejam mantidos constantes para todos os experimentos.
    4. Por condição (=bem), armazene as coordenadas de 10 campos de visão diferentes com 3-4 células em foco em uma lista de pontos.
    5. Visualize todas as posições nesta lista de pontos uma vez com um único instantâneo. Estas são as imagens de referência antes da adição do VHH-mCherry.
    6. Para iniciar a captação endocítica, adicione suavemente 350 μL da solução VHH-mCherry pré-aquecida a cada poço, garantindo o mínimo de perturbação na monocamada celular. Continuar a incubação a 37 °C com 5% de CO2.
    7. Fotografe cada ponto na lista de pontos repetidamente em um experimento de lapso de tempo para 100 quadros com um atraso de 36 s entre os quadros a 37 ° C com 5% de CO2.
    8. Para diminuir o fotobranqueamento, solicite a aquisição dos canais para obter a imagem primeiro do mCherry e depois do EGFP.
    9. Para aumentar a taxa de transferência, ordene que a aquisição primeiro adquira todas as posições sequencialmente e repita isso para cada ponto de tempo.

7. Análise de imagem da captação endocítica de VHH-mCherry

  1. Pré-processamento de imagem pós-aquisição e extração de dados em Fiji.
    1. Carregue a imagem de lapso de tempo usando o plug-in do importador Bio-Formats com a opção de divisão de canais ativada.
    2. Corrija o desvio lateral usando o plug-in MultiStackReg. Use o canal EGFP como referência e aplique a transformação ao canal mCherry também.
    3. Por célula, desenhe uma região de interesse (ROI) com a ferramenta de polígono (por exemplo, ao redor da região perinuclear) e adicione-a ao gerenciador de ROI.
    4. Para ambos os canais, meça a intensidade média em todos os ROIs e pontos de tempo usando a função Multimedida do gerenciador de ROI e salve a tabela resultante como arquivo de texto.
    5. Abra a imagem de referência correspondente e repita a medição para cada ROI.
  2. Análise de dados para determinar curvas de captação endocítica
    1. Abra o arquivo de texto e subtraia cada número de quadro por 1 para que eles comecem em 0 e, em seguida, multiplique cada número de quadro pelo atraso entre os quadros em s (ou seja, 36).
    2. Para cada ROI, subtraia a intensidade média no canal VHH-mCherry da imagem de referência de cada quadro da imagem de lapso de tempo correspondente no canal VHH-mCherry para remover a autofluorescência e o fundo.
    3. Para cada quadro e ROI, divida a intensidade VHH-mCherry subtraída de fundo pela intensidade média dos canais EGFP para levar em conta as flutuações de intensidade dentro do ROI diferente de VHH-mCherry, por exemplo, por movimento de Golgi, contração celular, desvio z ou instabilidades de iluminação.
    4. Normalize a curva resultante ao máximo.
    5. Selecione um intervalo de quadros para excluir quaisquer artefatos no início (ou seja, adição de mídia) ou no final (ou seja, desvio, branqueamento) do lapso de tempo.
    6. Ajuste os dados da curva com uma única função de decaimento exponencial que modela um processo cinético de primeira ordem:
      figure-protocol-1
      onde I(t) é a intensidade normalizada no tempo t, e t0 é responsável pelo atraso de tempo entre a adição de VHH-mCherry e o início da gravação. A partir da constante de velocidade k, calcule a meia-vida τ1/2 do processo como:
      figure-protocol-2
      NOTA: Ao conduzir um experimento com vários campos de visão (FOV) de imagem subsequente por ponto de tempo, cada t0 correspondente pode ser ligeiramente diferente, mas deve aumentar para valores mais altos de um FOV para o próximo.
    7. Repita o procedimento para todos os conjuntos de dados e relate os valores de meia-vida em gráficos de caixa.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para investigar o tráfego retrógrado de proteínas para vários compartimentos intracelulares, estabelecemos recentemente uma ferramenta baseada em nanocorpos anti-GFP para rotular e rastrear proteínas de fusão recombinantes da superfície celular17. Aqui, descrevemos a produção bacteriana de tais nanocorpos derivatizados e demonstramos sua utilidade no monitoramento da captação endocítica por imagens de células vivas. Em combinação com um repórter fluorescente residente em Golgi, este protocolo oferece uma plataforma robusta para estudar quantitativamente o transporte retrógrado de proteínas de carga selecionadas para a rede trans-Golgi (TGN) em tempo real.

Geramos uma coleção de nanocorpos anti-GFP funcionalizados distintos compartilhando uma arquitetura modular comum, usando técnicas padrão de clonagem molecular17. Embora o estudo atual se concentre na variante fluorescente VHH-mCherry, também incluímos nanocorpos derivatizados adicionais para ilustrar a versatilidade desse conjunto de ferramentas e destacar seu potencial para aplicações futuras. Nossa construção mais básica, VHH-std (std para padrão), compreende o domínio VHH, epítopos T7 e HA para detecção baseada em anticorpos, uma marca de hexa-histidina C-terminal (His6) para purificação e uma sequência de peptídeo aceptor de biotina (BAP) para permitir a biotinilação enzimática e ensaios pulldown baseados em estreptavidina de alta afinidade (Figura 1A). A partir desse projeto central, vários derivados de nanocorpos foram desenvolvidos para facilitar o estudo do tráfego endocítico e retrógrado por meio de análises bioquímicas, imagens de células fixas e vivas e microscopia eletrônica.

Para imagens de células vivas do transporte endocítico, projetamos um nanocorpo fluorescente anti-GFP incorporando um fluoróforo com espectros de excitação e emissão distintos dos da GFP, garantindo assim a separação espectral ideal durante a microscopia de fluorescência. Com base em suas propriedades superiores de dobramento em E. coli induzida por IPTG e suas propriedades fotofísicas bem caracterizadas, selecionamos mCherry como a marca fluorescente de escolha. Outros fluoróforos com desvio para o vermelho, como a proteína fluorescente vermelha monomérica (mRFP), também seriam alternativas adequadas em princípio, mas o mCherry provou ser particularmente robusto e eficaz neste sistema.

Qual é o potencial de outros nanocorpos funcionalizados além do VHH-mCherry? Para investigar o tráfego de proteínas da membrana plasmática para a rede trans-Golgi (TGN), aproveitamos a localização específica do compartimento de TPSTs, que residem exclusivamente nas cisternas TGN e trans-Golgi. Para isso, modificamos o VHH-std com um motivo de sulfatação de tirosina em tandem (2xTS) derivado da proccolecistocinina29 de rato, permitindo assim uma leitura bioquímica da chegada da carga a esses compartimentos. Enquanto a fusão de VHH-std com mCherry permite a visualização direta do transporte retrógrado por imagens fixas ou de células vivas, a funcionalização com peroxidases como APEX230 permite a localização ultraestrutural por microscopia eletrônica, ablação citoquímica direcionada ou ensaios de biotinilação baseados em proximidade. Além disso, a incorporação de um local de clivagem da protease do vírus gravura em àgua forte do tabaco (TEV) no andaime do nanobody fornece meios bioquímicos distinguir entre os nanobodies internalizados e superfície-ligados (Figura 1A). Anteriormente, empregamos a construção VHH-tev para monitorar a cinética de reciclagem de EGFP-CDMPR e TfR-EGFP17 ligados a nanocorpos. O reaparecimento de receptores marcados com nanocorpos na superfície celular pode ser prontamente detectado pela aplicação extracelular, resultando em uma perda específica do de epítopo C-terminal do nanocorpo. Analogamente, a inclusão de um sítio de clivagem TEV dentro do nanocorpo VHH-mCherry funcionalizado com mCherry aqui apresentado permite a avaliação dinâmica da reciclagem de repórteres EGFP por imagens de células vivas. A funcionalização com domínios proteicos alternativos - como fluoróforos adicionais, marcadores enzimáticos ou motivos de sequência para modificação pós-tradução - pode ser prontamente realizada subclonando as inserções desejadas no backbone VHH-std pelos locais de restrição SpeI e EcoRI. Todas as construções de nanocorpos anti-GFP funcionalizadas usadas no estudo original17 foram depositadas com Addgene para distribuição pública.

Usando o protocolo descrito acima, todas as variantes de nanocorpos ilustradas aqui foram purificadas para alto rendimento e pureza (Figura 1B). Apenas a fusão mCherry exibiu um pequeno corte proteolítico dos domínios proteicos após a purificação (Figura 1B, pista 5). Os dois produtos de degradação observados provavelmente correspondem aos domínios individuais VHH e mCherry, conforme inferido de seus pesos moleculares aparentes e verificados pela detecção de immunoblot específico do epítopo (Figura 1C). Na ausência de BirA co-expresso, o VHH-mCherry normalmente se recuperou com rendimentos de aproximadamente 20 mg por preparação. Com base em nossa experiência, a co-expressão de BirA reduz consistentemente o rendimento do nanocorpo em aproximadamente 1/3a 1/2. A biotinilação foi bastante completa porque os nanocorpos de uma mistura 1: 1 com BSA foram totalmente recuperados por estreptavidina-agarose ( Figura 1D ).

Para avaliar a adequação deste kit de ferramentas de nanocorpos para estudar o transporte endocítico, geramos linhas celulares HeLa estáveis expressando proteínas receptoras de superfície marcadas com EGFP com rotas distintas de tráfego intracelular. Estes incluíram TfR, que alterna entre a membrana plasmática e os endossomos iniciais (triagem e reciclagem); TGN46, que trafega entre a membrana plasmática e o TGN por endossomos iniciais; e ambos os MPRs, que transitam entre o TGN, a membrana plasmática e os endossomos precoce e tardio17. O EGFP foi fundido ao domínio extracelular de cada receptor - especificamente, inserido entre o peptídeo sinal e a sequência do receptor para CDMPR, CIMPR e TGN46 - e ao terminal C de TfR. Este projeto preservou os domínios citoplasmáticos nativos, garantindo que todos os sinais de classificação conhecidos permanecessem intactos e a etiqueta EGFP acessível para ligação por nanocorpos anti-GFP extracelulares (Figura 1E). Para o CIMPR, cujo domínio extracelular é incomumente grande, foi utilizada uma versão truncada, consistente com estudos anteriores que demonstraram que tal truncamento preserva o comportamento normal de tráfego31,32.

Linhagens celulares estáveis foram estabelecidas por transdução retroviral, seguida de classificação celular ativada por fluorescência (FACS) para isolar populações de células homogêneas com níveis de expressão moderados e comparáveis. Digno de nota, EGFP-CDMPR apareceu consistentemente como uma banda dupla em immunoblots, semelhante à sua contraparte endógena33, indicativa de glicosilação heterogênea. Para avaliar se as proteínas de fusão EGFP recapitulam os padrões de localização e expressão em estado estacionário das proteínas endógenas, as células que expressam de forma estável foram co-cultivadas com células HeLa parentais e analisadas por microscopia de fluorescência confocal (Figura 2B). O sinal EGFP refletiu fielmente a distribuição das proteínas endógenas correspondentes. Como esperado, CDMPR, CIMPR e suas versões marcadas com EGFP localizaram-se predominantemente na região perinuclear - refletindo TGN e compartimentos endossômicos tardios - com marcação adicional em endossomos periféricos. Tanto o TGN46 endógeno quanto o marcado com EGFP foram encontrados quase exclusivamente no TGN perinuclear, enquanto o TfR e o TfR-EGFP exibiram a distribuição endossômica inicial característica, com triagem periférica proeminente e endossomos de reciclagem perinuclear. Embora os anticorpos usados tenham detectado as formas endógena e marcada com EGFP (exceto CIMPR), a intensidade geral da coloração não foi acentuadamente aumentada nas células que expressam as proteínas de fusão, sugerindo que as construções EGFP não foram substancialmente superexpressas. Incluímos EGFP-TGN46 e EGFP-CIMPR na Figura 2B para comparação direta com EGFP-CDMPR e TfR-EGFP. Os protocolos utilizados para fixação celular e microscopia de fluorescência estão descritos em estudos anteriores17,19.

Usando VHH-mCherry, o transporte endocítico de proteínas repórter marcadas com EGFP pode ser monitorado por imagens de células vivas. Para isso, utilizamos como exemplos células expressando EGFP-CDMPR e TfR-EGFP. As células foram fotografadas ao longo do tempo com um microscópio fluorescente de campo amplo invertido após a adição de VHH-mCherry ao meio (Vídeo 1 e Vídeo 2). Imagens estáticas em vários pontos de tempo são mostradas na Figura 3. A captação foi quantificada medindo o sinal no canal mCherry, subtraindo o fundo de autofluorescência e normalizando para o sinal EGFP para eliminar flutuações devido ao movimento de compartimentos marcados ou possíveis pequenos deslocamentos no plano focal. A fluorescência de VHH-mCherry no meio a 25 nM foi insignificante e não interferiu nas medidas. A análise do transporte dos repórteres da superfície celular para seus compartimentos intracelulares, para a distribuição em estado estacionário, produziu os mesmos resultados cinéticos que os experimentos bioquímicos mostrados na Figura 2 da publicação anterior17, com meias-vidas aparentes de captação de ~ 9 min para EGFP-CDMPR e ~ 4 min para TfR-EGFP, e saturação após ~ 43 min e ~ 20 min, respectivamente. Esses valores foram comparáveis aos valores obtidos em experimentos de captação bioquímica usando ensaios de immunoblotting17. Em princípio, a cinética do transporte retrógrado para regiões subcelulares de interesse, como a região perinuclear de maior concentração de MPRs, também pode ser analisada. No entanto, a região perinuclear contém não apenas Golgi / TGN, mas também é enriquecida em endossomas tardios e endossomos de reciclagem. A cinética de absorção de nanocorpos na região perinuclear não é suficientemente específica para analisar o transporte retrógrado para uma organela definida. Para avaliar de forma mais confiável o transporte da membrana plasmática para o TGN, outra proteína fluorescente, uma proteína transmembrana residente no TGN, deve ser co-expressa de forma estável junto com a proteína repórter GFP, de forma que não haja sobreposição espectral das propriedades do fluoróforo. O uso desse marcador extra permite a detecção de VHH-mCherry importado por repórter, análogo à sulfatação de tirosina mediada por TPSTs, conforme documentado anteriormente19.

figure-results-1
Figura 1: Projeto e produção de nanocorpos derivatizados para rastrear proteínas de superfície celular marcadas com EGFP. (A) Visão geral esquemática dos nanocorpos derivatizados. A construção padrão de nanocorpos compreende um domínio VHH específico para GFP, etiquetas de epítopos T7 e HA, um peptídeo aceitador de biotina (BAP) e uma marca de hexahistidina C-terminal (His6) para purificação. Variantes adicionais de nanocorpos incluem modificações com locais de sulfatação de tirosina em tandem (2xTS), a peroxidase projetada APEX2 ou a proteína fluorescente mCherry. A barra de escala indica o comprimento do aminoácido (aa). (B) Nanocorpos expressos por bactérias e purificados por afinidade (20-50 μg) foram analisados por gradiente SDS-PAGE e visualizados pela coloração de Coomassie. Os padrões de peso molecular (em kDa) são indicados à esquerda. Clipagem proteolítica menor foi observada apenas para VHH-mCherry, provavelmente ocorrendo entre os domínios VHH e mCherry. (C) Análise imunoblot de preparações de nanocorpos (10 ng) usando anticorpos direcionados contra epítopos T7, HA ou His6 , ou detectados por estreptavidina-HRP (SA-HRP) para avaliação da biotinilação. (D) A extensão da biotinilação de nanocorpos foi avaliada pela incubação de nanocorpos na proporção de 1:1 com BSA, seguida de pulldown de estreptavidina-agarose, peletização e lavagem das contas. Volumes iguais do sobrenadante (S) e do material ligado ao cordão (B) foram posteriormente analisados por SDS-PAGE e coloração de Coomassie. A recuperação quantitativa do nanocorpo na fração ligada ao grânulo indica biotinilação completa. A presença de fragmentos de VHH e mCherry na fração ligada sugere degradação parcial, provavelmente ocorrendo durante a preparação da amostra para análise SDS-PAGE. A linha branca entre as pistas 2 e 3 indica a exclusão de duas faixas não relacionadas. Este número foi modificado de17. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Expressão e localização intracelular de receptores de carga marcados com EGFP marcados com fluorescência. (A) Representação esquemática das construções de fusão EGFP. As sequências derivadas de proteínas transmembranares secretoras são representadas em preto, com peptídeos sinal N-terminais e domínios transmembranares internos destacados em amarelo. A metade EGFP é ilustrada em verde. Construtos completos foram gerados para CDMPR, TfR e TGN46, enquanto uma variante truncada bem caracterizada foi usada para CIMPR para preservar o comportamento normal de tráfego. A barra de escala indica o comprimento do aminoácido (aa). EGFP-CDMPR e TfR-EGFP foram descritos anteriormente17. (B) Para avaliar a localização subcelular, as células HeLa que expressam de forma estável as proteínas de fusão EGFP foram co-cultivadas com células HeLa parentais e analisadas por microscopia de fluorescência. A barra de escala representa 10 μm. (C) As células HeLa que expressam de forma estável as proteínas repórteres marcadas com EGFP foram lisadas e os extratos de proteínas foram submetidos a SDS-PAGE seguido de immunoblotting usando anticorpos contra GFP e actina. Os marcadores de peso molecular (em kDa) são indicados à direita. Este número foi modificado de17. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Imagem de células vivas da cinética de captação endocítica de nanocorpos mediada por EGFP-CDMPR e TfR-EGFP. A imagem de células vivas foi realizada após a adição de 25 nM VHH-mCherry às células HeLa expressando de forma estável (A) EGFP-CDMPR ou (B) TfR-EGFP em meio completo sem vermelho de fenol a 37 ° C. As células foram fotografadas nos canais GFP e mCherry usando um microscópio de fluorescência de campo amplo semiautomatizado em intervalos de 36 s. Imagens estáticas mescladas representativas são mostradas, acompanhadas por visualizações ampliadas da região perinuclear (ampliação: 2,2x) em canais individuais abaixo. (Barras de escala, 10 μm.) Veja também o Vídeo 1 e o Vídeo 2. A análise quantitativa da cinética de absorção de nanocorpos em (C) EGFP-CDMPR e (D) TfR-EGFP foi realizada usando dados de três experimentos independentes, cada um capturando aproximadamente 40 células individuais. Para levar em conta o movimento da organela e a variabilidade do plano focal, a intensidade de fluorescência mCherry foi normalizada (norma) para o sinal GFP e plotada como a média ± DP em todas as células dos três experimentos. O sinal de captação máxima média foi normalizado para 1. A cinética de captação para cada célula foi ajustada individualmente usando um modelo cinético de primeira ordem. As linhas plotadas representam as curvas médias derivadas da média das constantes de taxa correspondentes. Este número foi modificado de17. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 1: Imagem de células vivas da captação de nanocorpos mCherry por EGFP-CDMPR. As células HeLa expressando EGFP-CDMPR de forma estável foram incubadas a 37 ° C em meio completo contendo 25 nM VHH-mCherry e fotografadas nos canais de fluorescência EGFP e mCherry em intervalos de 36 s. O filme foi renderizado a uma taxa de reprodução de 5 quadros/s, correspondendo a uma compactação em tempo real de 3 min/s. Este filme foi modificado de17. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 2: Imagem de células vivas da captação de nanocorpos mCherry por TfR-EGFP. As células HeLa que expressam TfR-EGFP de forma estável foram incubadas a 37 ° C em meio completo suplementado com 25 nM VHH-mCherry e imageadas para fluorescência de EGFP e mCherry em intervalos de 36 s. O filme foi renderizado a 5 quadros/s, representando uma taxa de lapso de tempo de 3 min/s. Este filme foi modificado de17. Clique aqui para baixar este vídeo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os nanocorpos representam uma classe emergente de andaimes de ligação a proteínas que oferecem inúmeras vantagens sobre os anticorpos convencionais: são pequenos, altamente estáveis, monoméricos, não reticulados, não possuem ligações dissulfeto e podem ser selecionados para ligação de alta afinidade24. Em nosso estudo anterior, desenvolvemos e aplicamos nanocorpos funcionalizados produzidos por expressão bacteriana para marcar proteínas expostas à superfície e monitorar seu tráfego intracelular para vários compartimentos, com foco particular no transporte retrógrado para a rede trans-Golgi (TGN) 17 . Utilizamos um nanocorpo anti-GFP para garantir versatilidade, permitindo o direcionamento de proteínas de fusão marcadas com GFP extracelular, YFP ou mCerulean - marcas fluorescentes que estão amplamente disponíveis e muitas vezes já caracterizadas. A funcionalização do nanocorpo anti-GFP com motivos de sulfatação mCherry, APEX2 ou tirosina nos permitiu visualizar a absorção de carga por imagens fixas e de células vivas, localizar compartimentos de transporte retrógrados no nível ultraestrutural, realizar ablação de compartimento direcionada e avaliar quantitativamente a cinética de transporte para o TGN. Uma limitação dessa abordagem é o pré-requisito de modificação genética das linhagens celulares alvo - seja por superexpressão estável ou marcação endógena - antes que os nanocorpos anti-GFP funcionalizados possam ser efetivamente empregados. No entanto, essa estratégia pode ser prontamente adaptada ao crescente repertório de nanocorpos direcionados contra proteínas-alvo endógenas não marcadas geradas por meio de imunização animal ou seleção in vitro de bibliotecas sintéticas de VHH usando tecnologias de exibição de ribossomos ou fagos34. Além disso, nanocorpos direcionados a tags de epítopos comumente usados, como mCherry, V5 ou ALFA, foram desenvolvidos nos últimos anos 35,36,37. Notavelmente, recentemente utilizamos um nanocorpo anti-mCherry competente para sulfatação para investigar o tráfego retrógrado de CDMPR em células HeLa depletadas de GGA2 por meio de inativação funcional rápida28. Pequenas etiquetas de epítopos oferecem a vantagem de preservar a conformação nativa e a função da proteína-alvo, pois são menos propensas a interferir em domínios estruturais críticos. Os nanocorpos que reconhecem esses epítopos compactos (por exemplo, ALFA, V5) podem ser perfeitamente integrados ao kit de ferramentas de nanocorpos funcionais para estender sua utilidade no estudo de mecanismos de tráfego endocítico e retrógrado.

No presente estudo, demonstramos a aplicação do VHH-mCherry em experimentos de imagem de células vivas. Usando EGFP-CDMPR e TfR-EGFP como proteínas repórteres, fomos capazes de visualizar a captação endocítica específica do receptor e sua progressão em direção à distribuição em estado estacionário. A análise quantitativa do tráfego desses repórteres da membrana plasmática para seus respectivos compartimentos intracelulares revelou cinética consistente com as obtidas por meio de ensaios bioquímicos apresentados na Figura 2 de um estudo anterior17. Descobrimos que a meia-vida aparente foi consideravelmente mais longa para EGFP-CDMPR (~ 9 min) do que para TfR-EGFP (~ 4 min), com os sinais ficando saturados após cerca de 43 min e 20 min, respectivamente. Esses achados quantitativos se alinham bem com os dados publicados anteriormente sobre a dinâmica do tráfico de MPR e TfR 38,39,40. Notavelmente, a construção VHH-mCherry atraiu atenção significativa da comunidade de pesquisa, como evidenciado por inúmeras solicitações de distribuição de Addgene, e já foi implementada com sucesso em vários estudos independentes 28,41,42,43,44.

Dependendo da configuração do microscópio ou dos requisitos experimentais, os nanocorpos anti-GFP marcados com mCherry podem nem sempre ser ideais. Nesses casos, fluoróforos alternativos ou variantes de proteínas fluorescentes podem fornecer propriedades espectrais mais adequadas quando usados em combinação com linhagens de células repórter GFP. Para resolver isso, estabelecemos uma biblioteca de nanocorpos funcionalizados incorporando uma gama diversificada de proteínas fluorescentes, incluindo mTagBFP2, mNeptune2.5, mCardinal2, TagRFP657 e iRFP670 (243764-68). Essas construções adicionais de nanocorpos serão disponibilizadas por meio do Addgene. O uso de fluoróforos espectralmente distintos permite uma separação clara dos sinais de excitação e emissão, facilitando assim a obtenção de imagens ideais ao vivo e em tempo real de até três canais de fluorescência com sobreposição espectral mínima.

Embora o monitoramento da captação endocítica até o estado estacionário possa parecer simples, rastrear o transporte retrógrado de proteínas para o TGN apresenta um desafio experimental maior. Além de VHH-mCherry e uma proteína repórter marcada com GFP, um marcador fluorescente ou residente em TGN conjugável com corante adicional é necessário para visualização e quantificação. No entanto, certas proteínas residentes em Golgi exibem vazamento parcial na superfície celular, que pode ser ainda mais exacerbado por perturbações das vias de tráfego intracelular, como as introduzidas pela manipulação experimental de componentes da maquinaria de transporte. O TGN46, por exemplo, é comumente usado como um marcador residente em Golgi, apesar de seu papel funcional como receptor de carga mediando o transporte de superfície de TGN para célula de certas cargas secretoras16,45. Da mesma forma, glicosiltransferases como a β-1,4-galactosiltransferase também foram detectadas na membrana plasmática41. Embora essas proteínas possam circular para a superfície, sua localização predominante em estado estacionário permanece dentro do TGN. Marcar esses marcadores com uma proteína fluorescente espectralmente distinta ou uma etiqueta compatível com corante (por exemplo, SNAP, Halo, etc.) e co-expressá-los de forma estável com um repórter transmembrana marcado com GFP permitiria imagens quantitativas de células vivas da chegada de TGN. Isso pode ser medido de forma análoga ao fluxo de trabalho descrito acima, com quantificação baseada no acúmulo de sinal mCherry dentro do canal de fluorescência correspondente à proteína de fusão residente em Golgi. As estratégias atuais para investigar o tráfego retrógrado em células fixas ou vivas geralmente dependem de construções de receptores quiméricos em combinação com anticorpos IgG (por exemplo, CD8) 46 , 47 . No entanto, o risco inerente de reticulação devido à bivalência de IgGs convencionais durante a marcação de superfície pode alterar significativamente o destino intracelular da proteína marcada, frequentemente redirecionando-a para a degradação lisossômica após endocitose48,49. Em contraste, os nanocorpos, devido à sua natureza monovalente e estequiometria de ligação 1:1, não induzem a reticulação, preservando assim as rotas de tráfego fisiológico da proteína alvo. Isso torna as abordagens baseadas em nanocorpos particularmente valiosas para estudar a dinâmica de transporte retrógrada autêntica sem introduzir artefatos de roteamento artificiais.

O desempenho ideal deste protocolo para imagens de células vivas requer uma titulação cuidadosa da concentração de nanocorpos, pois quantidades excessivas levam a uma fluorescência de fundo elevada de nanocorpos não ligados no meio. Além disso, as diferenças nos níveis de expressão de linhagens celulares repórter de GFP devem ser contabilizadas durante a titulação para garantir uma comparação quantitativa precisa. Para a produção de nanocorpos, a indução de baixa temperatura em E. coli é fundamental para promover o dobramento adequado do domínio mCherry. Temperaturas de indução mais altas geralmente resultam em proteína mal dobrada ou degradada e, portanto, não são recomendadas.

O sucesso deste protocolo depende criticamente de três aspectos principais: primeiro, a expressão de alto rendimento e a pureza das construções funcionais de nanocorpos para garantir uma rotulagem consistente e um fundo mínimo; segundo, o uso de linhagens celulares bem caracterizadas expressando de forma estável proteínas repórteres marcadas com GFP com localização na superfície celular para recapitular as vias fisiológicas de tráfego; e terceiro, manuseio e configuração ideais da configuração da microscopia de fluorescência, incluindo parâmetros de imagem e separação espectral, para permitir uma análise quantitativa e qualitativa precisa da dinâmica do transporte de carga.

O método e o protocolo aqui apresentados, centrados no uso de nanocorpos anti-GFP marcados com mCherry, permitem o rastreamento quantitativo e qualitativo de proteínas de carga da superfície celular até os compartimentos endocíticos em células de mamíferos cultivadas. Quando co-expressa com um marcador residente de Golgi marcado com fluorescência, essa abordagem permite ainda mais a análise das vias de transporte retrógradas. Como tal, esta ferramenta fornece uma estratégia poderosa para monitorar o tráfego intracelular de proteínas e receptores transmembranares da superfície celular que antes eram inacessíveis à marcação devido à ausência de ligantes específicos ou reagentes de ligação monoméricos compatíveis.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pela Universidade de Basel. Agradecemos ao Prof. em. Dr. Martin Spiess pela criação e layout de figuras, o Imaging Core Facility (IMCF) do Biozentrum pelo apoio e o PNAS pela permissão de reimpressão.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anticorpo anti-GFP  Sigma-Aldrich118144600001O produto é distribuído pela Sigma-Aldrich, mas fabricado pela Roche
Pratos de cultura celular de 100 mmTPPTPP93100
Anticorpo anti-actinaEMD Millipore MAB1501
Anticorpo anti-HAdo laboratóriofeito a partir do híbridoma 12CA5
Anticorpo Anti-His6Laboratórios Bethyl & nbsp;A190-114A
Anticorpo anti-T7  Laboratórios Bethyl & nbsp;A190-117A
BL21(DE3) Competent E. coliNEBC2527H
Diidratado de cloreto de cálcioMerck Millipore102382dissolvido em água estéril, o estoque é de 1 M
Carbenicilina sal dissódicoAplichemA1491dissolvido em água estéril, o caldo é 100 mg/mL
Coomassie-R (Azul Brilhante)Sigma-AldrichB-0149
D-biotinaSigma-AldrichB4501dissolvido em NaH2PO4 ou DMSO estéril de 500 mM,
Colunas descartáveis PD10 de dessalinizaçãoGE HealthcareGE17-0851-01
DMEM GlutaMAX-IThermo Fisher Scientific61965026
DMEM, glicose alta, sem glutamina, sem fenol vermelhoThermo Fisher Scientific31053028
DNase IAplichemA3778dissolvido em água estéril
Dulbecco' s soro tampão fosfatado (DPBS) sem Ca2+/Mg2+Sigma-AldrichD8537
Soro fetal bovino (FBS)Thermo Fisher ScientificA5256701
Filtropur S, PES, Porengrö ß e: 0,45 & micro; mSarstedt83.1826
Reagente de transfecção FuGENE HDPromega E2311
Coberturas de vidro (nº 1.5H)VWR631-0153
HRP anti-camundongoSigma-AldrichA-0168
Anti-coelho de cabras HRPSigma-AldrichA-0545
Seu kit de proteçãoCytvia11003400
Suas colunas GraviTrapCytvia11003399
ibidi µ-Slide 4 bem, ibiTreat80426-IBIibidi
Isopropil-β-D-tiogalactopiranoside (IPTG)AplichemA1008dissolvido em água estéril, o estoque é de 1 M
Sulfato de kanamicinaAplichemA1493dissolvido em água estéril, o caldo é 100 mg/mL
L-glutaminaAplichemA3704
Lisozima  Sigma-Aldrich18037059001O produto é distribuído pela Sigma-Aldrich, mas fabricado pela Roche
Cloreto de magnésio hexahidratadoMerck Millipore105833dissolvido em água estéril, o estoque é de 1 M
Mini géis proteicos TGX, 4-20%, 15-poçoBio-Rad4561096
HeLa Kyoto modificadodo laboratório
NEB5-alpha Competent E. coliNEBC2987U
NucleoBond Xtra Midi Plus, 10 preparaçõesMacherey-Nagel 740412.1
Penicilina/EstreptomicinaBioconceito 4-01F00-H
Fenilmetilsulfonil fluoreto (PMSF)AplichemA0999.0025dissolvido em DMSO a 40%, 60% isopropanol, estoque em 500 mM
Linha celular Phoenix amphoLaboratório Nolan
Polibrena (brometo de hexadimetrina)Sigma-AldrichH9268
PuromicinaInvivogenANT-PR-1
Cloreto de sódio  Merck Millipore106404dissolvido em água estéril, o estoque tem 5 M
Piruvato de sódio  Thermo Fisher Scientific11360039
Trans-Blot Turbo Pack, miniBio-Rad1704158
TriptonaAplichemA1553
Extrato de levedura & nbsp;AplichemA1552

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Johannes, L., Popoff, V. Tracing the retrograde route in protein trafficking. Cell. 135 (7), 1175-1187 (2008).
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