Este estudo apresenta um protocolo para avaliar os efeitos da curcumina no comportamento celular do retinoblastoma por meio da modulação da via Wnt/β-catenina e expressão de miR-22.
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Artigo de investigação
Regulação mediada por miR-22 da sinalização Wnt/β-catenina pela curcumina no retinoblastoma
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O retinoblastoma (RB) é um tumor maligno intraocular comum que afeta bebês e crianças, mas sua etiologia e patogênese precisas permanecem incompletamente compreendidas. A curcumina, um polifenol bioativo, inibe a progressão do tumor por meio da modulação mediada por microRNA da cascata de sinalização Wnt/β-catenina. Este estudo teve como objetivo esclarecer como a curcumina medeia seus efeitos antitumorais em RB, investigando sua regulação da expressão de miRNA-22 (miR-22) e explorando os mecanismos moleculares subjacentes. Dois modelos validados de retinoblastoma (SO-RB50/WERI-Rb-1) foram tratados com curcumina em concentrações variadas. Para delinear a regulação do miR-22 da sinalização Wnt / β-catenina, as células-alvo foram transduzidas com um lentivírus imitador de miR-22 ou um lentivírus de controle não funcional. Modelos de tumor de xenoenxerto foram estabelecidos em camundongos usando células RB humanas para observar os efeitos in vivo da curcumina no tamanho do tumor, expressão de miR-22 e níveis de proteína Wnt / β-catenina. A proliferação, invasão e apoptose celular foram avaliadas usando o ensaio de coloração dupla CCK-8, Transwell e Anexina V-APC-PI, respectivamente. Os níveis de miR-22 foram quantificados por RT-PCR, e os perfis de expressão de Wnt1 e β-catenina foram determinados pela análise de Western blot. O tratamento com curcumina resultou em diminuição da proliferação e invasividade nas células RB, ao mesmo tempo em que aumentou a apoptose e elevou a expressão do miR-22. A inibição do miR-22 diminuiu os efeitos da curcumina na via de sinalização Wnt / β-catenina. Em estudos de xenoenxerto, a curcumina reduziu significativamente o tamanho do tumor e aumentou a expressão de miR-22 dentro dos tumores, suprimindo efetivamente a sinalização Wnt/β-catenina. Esses achados demonstram que a curcumina inibe a proliferação e a invasividade das células RB enquanto promove a apoptose, mediada principalmente pela regulação positiva do miR-22 e subsequente inibição da via Wnt/β-catenina.
Introdução
O retinoblastoma (RB), uma malignidade pediátrica com alta agressividade que surge nos tecidos da retina, representa uma ameaça substancial à saúde, especialmente para crianças menores de cinco anos. Mutações genéticas, particularmente aquelas que afetam o gene RB1, estão intimamente associadas ao desenvolvimento dessa doença1. Considerando a prevalência significativa de retinoblastoma (RB) entre lactentes e crianças, juntamente com o fato de que aproximadamente 9000 novos casos são relatados anualmente, predominantemente em países de baixa renda e em desenvolvimento, uma compreensão abrangente dos mecanismos da doença é imperativa para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas eficazes e melhoria dos resultados dos pacientes2. Ao longo dos anos, a pesquisa sobre RB tem se concentrado principalmente em alterações genômicas, especificamente na expressão de miRNAs3. Certamente, o miR-34a e o miR-22 emergiram como atores vitais na tumorigênese do RB 4,5. Entre esses miRNAs, o miR-22 demonstrou seu envolvimento na tumorigênese em diferentes tipos de câncer 6,7,8, influenciando a proliferação, invasão e migração 6,9. Além disso, pesquisas anteriores indicaram expressão reduzida de miR-22 em linhagens celulares RB de camundongos e humanos, destacando ainda mais seu papel potencial nessa doença10.
A curcumina, principal curcuminóide bioativo dos rizomas de Curcuma longa, tem sido um ingrediente fundamental na medicina tradicional e na culinária asiática11. Seu rico perfil farmacológico, abrangendo efeitos antitumorais, antimicrobianos, anti-inflamatórios, antioxidantes e neuroprotetores, tem recebido atenção significativa na pesquisa biomédica 12,13,14. Numerosos estudos exploraram seu papel antitumoral no RB, destacando sua influência em diferentes vias de sinalização, incluindo NF-κB15, JAK/STAT16 e MRP117. Em comparação com essas vias estudadas anteriormente, o eixo curcumina-miR-22 / Wnt / β-catenina pode oferecer uma abordagem mais direcionada e específica, potencialmente melhorando a eficácia terapêutica e reduzindo os efeitos fora do alvo.
Estudos anteriores sugeriram que a curcumina atinge efeitos antitumorais por meio da modulação do eixo da via de sinalização TET1 / Wnt / β-catenina em carcinoma hepatocelular18 e células de câncer de cólon19. No entanto, ainda não se sabe se a curcumina pode suprimir a progressão do tumor em células RB afetando a via de sinalização Wnt/β-catenina. Estudos recentes relataram diminuição da expressão de miR-22 em células de retinoblastoma e carcinoma espinocelular oral ligado a alterações na atividade da via de sinalização Wnt / β-catenina20,21. Considerando a aplicabilidade prática, a curcumina exibe atividade antitumoral eficaz dentro de uma faixa de concentração definida (10-40 μM in vitro)15,22 e pode ser administrada in vivo com propriedades farmacocinéticas gerenciáveis, facilitando a pesquisa translacional. Portanto, este estudo tem como objetivo estabelecer um modelo RB para investigar se a curcumina aumenta os níveis de miR-22 e, subsequentemente, diminui a atividade de sinalização Wnt/β-catenina, fornecendo uma estratégia terapêutica potencialmente mais eficiente e clinicamente relevante em comparação com as abordagens convencionais de modulação NF-κB, JAK/STAT ou MRP1.
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Protocolo
Todos os procedimentos envolvendo animais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética e Bem-Estar Animal (AEWC) do Hospital de Olhos de Tianjin (Aprovação nº. NKYY-DWLL-2023-054). Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
1. Cultura de células
As células das linhagens de retinoblastoma humano WERI-Rb-1 e SO-RB50 foram cultivadas em meio Eagle modificado de Dulbecco com alto teor de glicose suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina. As células foram semeadas em densidade apropriada em frascos de cultura e mantidas a 37 °C em atmosfera umidificada contendo %CO2. O meio foi substituído a cada 2-3 dias e as células foram passadas a 70%-80% de confluência usando tripsinização padrão.
2. Experimentos com animais
Um total de 48 camundongos nus Balb/c livres de patógenos específicos (4 semanas de idade, 16-18 g) foram usados. Os animais foram alojados em gaiolas estéreis, ventiladas individualmente, sob fluxo de ar laminar, com condições ambientais controladas de 26-28 °C e umidade relativa de 40%-60%. Ração, água e roupa de cama foram esterilizadas antes do uso. Os ratos tiveram livre acesso a comida e água e foram aclimatados por uma semana antes dos experimentos.
3. Agrupamento e tratamento dos animais
Células WERI-Rb-1 e SO-RB50 transfectadas de forma estável com uma sequência miR-22 miMic ou uma sequência de controle negativo foram usadas para inoculação tumoral. As células em fase de crescimento logarítmico foram colhidas, ressuspensas em solução salina estéril tamponada com fosfato e ajustadas para uma densidade de 5 × 107 células/mL. Cada camundongo foi injetado por via subcutânea com 0,1 mL da suspensão no membro anterior direito. Os camundongos foram divididos aleatoriamente em seis grupos (n = 6 por grupo): grupo modelo, grupo curcumina, grupo miR-22 mimético, miR-22 mimico + grupo curcumina, grupo controle miR-22 negativo e grupo miR-22 controle negativo + curcumina. Nos grupos que receberam curcumina, os camundongos receberam injeções intraperitoneais de 15 mg / kg de curcumina uma vez ao dia, começando imediatamente após a inoculação das células tumorais. Os grupos restantes receberam volumes iguais de DMSO como controle veicular.
4. Medição do peso e volume do tumor
A taxa de ocupação do tumor foi de aproximadamente 80% -90% em camundongos nus xenoenxertados. O tamanho do tumor foi medido semanalmente usando um paquímetro digital, com o maior diâmetro registrado como comprimento (L) e o menor diâmetro registrado como largura (W). O volume tumoral foi calculado pela fórmula V = (L × W2)/2. Os camundongos foram monitorados regularmente quanto ao crescimento do tumor e estado de saúde, e desfechos humanos foram aplicados se os tumores excedessem 1.500 mm3 ou se os animais mostrassem sinais de sofrimento ou perda de peso. No final da semana 4, os camundongos foram sacrificados por inalação de CO2 seguida de luxação cervical para garantir a morte. Os tumores foram dissecados e pesados imediatamente após a remoção.
5. transfecção de microRNA
Oligonucleotídeos sintéticos, incluindo miR-22 mimic, controle negativo, anti-miR-22 (modificado com 20-metoxi), anti-miR controle negativo, siRNAs específicos de Wnt1 e siRNA de controle, foram usados para transfecção. As células em confluência de 70% a 80% foram semeadas em placas de 6 poços um dia antes da transfecção. A transfecção foi realizada com um reagente à base de lipídios de acordo com as instruções do fabricante. Para cada poço, os ácidos nucléicos foram diluídos em meio livre de soro e combinados com o reagente de transfecção na proporção recomendada para formar complexos, que foram incubados por 15-20 min à temperatura ambiente antes de serem adicionados gota a gota às células em meio completo. O volume final por poço foi de 2 mL. Após 6 h de incubação a 37 °C com 5% de CO2, o meio foi substituído por meio completo fresco. As células foram mantidas por 48 h antes dos ensaios subsequentes. A eficiência de transfecção foi avaliada por PCR quantitativo em tempo real. Três siRNAs diferentes direcionados a Wnt1 (si-Wnt1-1: 5'-CCAAGAGTCTGCAACTGGTACTCGA-3'; si-Wnt1-2: 5'-CGAGAAACGGCGTTTATCTTCGCTA-3'; si-Wnt1-3: 5'-GCTTCCTCATGAACCTTCACAACAA-3') foram usados individualmente ou como uma mistura equimolar para minimizar os efeitos fora do alvo.
6. Ensaio de contagem de células Kit-8 (CCK-8)
As células foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 5 × 103 células por poço em 100 μL de meio completo e deixadas aderir durante a noite. Após o tratamento com as concentrações indicadas de curcumina pela duração especificada, 10 μL de solução de trabalho CCK-8 foram adicionados diretamente a cada poço. Poços contendo meio sozinho serviram como controles em branco. As placas foram incubadas a 37 ° C com 5% de CO2 por 4 h, após o que a absorbância foi medida a 490 nm usando um leitor de microplacas. A viabilidade celular foi calculada como:
Viabilidade (%) = 
x 100
Curvas dose-resposta foram geradas e a concentração inibitória semimáxima (IC50) da curcumina foi determinada de acordo.
7. Ensaio Transwell
Para o ensaio de migração, as células foram suspensas em meio livre de soro e semeadas nas câmaras superiores das inserções Transwell (tamanho dos poros 8 μm) a 3 × 105 células em 200 μL por inserção. As câmaras inferiores foram preenchidas com 600 μL de meio completo contendo 10% de soro fetal bovino como quimioatraente. As placas foram incubadas a 37 °C com 5% de CO2 por 24 h. Após a incubação, as células não migratórias na superfície superior da membrana foram removidas suavemente com um cotonete estéril. As inserções foram enxaguadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato, fixadas em glutaraldeído a 5% a 4 °C por 30 min, enxaguadas novamente e coradas com cristal violeta a 0,1% por 30 min em temperatura ambiente. O excesso de corante foi removido por lavagem em PBS. As membranas foram deixadas secar ao ar e as células migradas foram visualizadas sob um microscópio invertido com ampliação de 400×. Para quantificação, três campos aleatórios por inserção foram fotografados e o número médio de células foi calculado.
8. Ensaio de anexina V-APC-PI
As células de cada grupo foram colhidas, lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato pré-resfriado (PBS) e centrifugadas a 300 × g por 5 min a 4 °C. O pellet foi ressuspenso em 300 μL de tampão de ligação 1× a uma densidade de aproximadamente 1 × 106 células/mL. Anexina V-APC (5 μL) foi adicionada e as amostras foram incubadas por 15 min em temperatura ambiente no escuro. Imediatamente antes da citometria de fluxo, 5 μL de iodeto de propídio foram adicionados a 200 μL da suspensão celular e incubados por 5 min à temperatura ambiente. As amostras foram analisadas em um citômetro de fluxo usando canais apropriados (APC e PI), e os dados foram processados com estratégias de gating padrão para distinguir células vivas, apoptóticas precoces, apoptóticas tardias e necróticas.
9. Perfil qRT-PCR
O RNA total foi extraído pelo método fenol-clorofórmio, e a concentração e a pureza foram determinadas por espectrofotometria ultravioleta. Para a transcrição reversa, foi utilizado 1 μg de RNA total em uma reação de 20 μL com master mix de transcrição reversa de acordo com o protocolo do fabricante. A PCR quantitativa foi realizada em reações de 20 μL contendo 2 μL de cDNA, 10 μL de master mix SYBR Green e 0,4 μM de cada primer. As reações foram executadas em um sistema de PCR em tempo real com o seguinte programa de ciclagem: 95 °C por 1 min, seguido por 40 ciclos de 95 °C por 15 s e 63 °C por 25 s, com aquisição de fluorescência no final de cada ciclo. Uma análise da curva de fusão foi realizada de 55 °C a 95 °C para verificar a especificidade do produto. Cada amostra foi analisada em triplicata, e a expressão relativa foi quantificada pelo método 2-ΔΔCt. O U6 serviu como gene de referência para a quantificação do microRNA e a β-actina foi usada para a normalização do mRNA.
As sequências de primers foram as seguintes: U6: 5'-CTCGCTTCGGCAGCACACA-3', 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'; miR-22: 5'-GCCTGAAGCTGCCAGTTGA-3', 5'-GTGCAGGGTCGAGGT-3'; Wnt1: para frente 5'-CGATGGTGGGGTATTGTGAAC-3', reverso 5'-CCGGATTTTGGCGTATCAGAC-3'; β-actina: 5'-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3', 5'-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3'. Os dados de amplificação foram processados usando o software do sistema. Todos os primers foram obtidos de um fornecedor comercial.
10. Mancha ocidental
As proteínas foram extraídas de células ou tecidos cultivados usando um tampão de lise contendo inibidores de protease, e as concentrações de proteínas foram determinadas pelo método do ácido bicinconínico. Quantidades iguais de proteína (40 μg por pista) foram separadas por 10% de SDS-PAGE sob tensão constante (80 V para empilhamento de gel e 120 V para gel de resolução) e transferidas para membranas de polivinilideno difluoreto usando um sistema de transferência úmida a 100 V por 90 min. As membranas foram bloqueadas em leite desnatado a 5% preparado em solução salina tamponada com Tris com Tween-20 a 0,1% (TBST) por 1 h à temperatura ambiente. Os anticorpos primários contra Wnt1, β-catenina e β-actina foram diluídos 1:1000 em TBST contendo 1% de leite desnatado e incubados com as membranas durante a noite a 4 °C. Após lavagem três vezes com TBST (10 min cada), as membranas foram incubadas com um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (diluição 1:5000) por 1 h à temperatura ambiente. Após outras três lavagens com TBST, as bandas de proteínas foram visualizadas usando um reagente de detecção de quimioluminescência aprimorado e os sinais foram capturados com um sistema de imagem digital. As intensidades das bandas foram quantificadas usando o software ImageJ.
11. Ensaio de luciferase
Um plasmídeo repórter de tipo selvagem (Wnt1-WT) contendo o 3′UTR de Wnt1 com locais de ligação de miR-22 previstos e um repórter mutante (Wnt1-MUT) com locais de ligação interrompidos foram construídos. As células de retinoblastoma humano foram semeadas em placas de 24 poços a uma densidade de 1 × 105 células por poço e co-transfectadas com plasmídeos repórter Wnt1-WT ou Wnt1-MUT junto com um miR-22 imitador ou controle negativo usando um reagente de transfecção à base de lipídios. Para cada poço, foram utilizados 500 ng de plasmídeo repórter e 50 nM de miRNA mimético ou controle. Após 48 h de incubação a 37 °C com 5% de CO2, as células foram lisadas em 100 μL de tampão de lise passiva. As atividades de luciferase Firefly e Renilla foram medidas sequencialmente usando um sistema de ensaio repórter de luciferase dupla de acordo com o protocolo do fabricante. A atividade da luciferase do vaga-lume foi normalizada para a atividade da luciferase de Renilla para controlar a eficiência da transfecção. Cada condição foi testada em poços triplicados e repetida em três repetições biológicas independentes.
12. Análise estatística
Todos os dados são apresentados como média ± desvio padrão (DP) de pelo menos três réplicas biológicas independentes. As análises estatísticas foram realizadas por meio de software estatístico. As comparações entre os múltiplos grupos foram realizadas por análise de variância (ANOVA) de uma via, seguida pelo teste post hoc de Tukey. Um valor de p de <0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
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Resultados
Efeitos antiproliferativos e anti-invasivos dose-dependentes da curcumina em células de retinoblastoma humano, acompanhados pela desativação da via Wnt/β-catenina
As células RB humanas foram tratadas com doses variadas de curcumina durante um período de 24 horas. Os resultados revelaram um declínio dependente da dose na viabilidade e invasão celular, juntamente com um aumento na apoptose. Especificamente, à medida que a concentração de curcumina aumentou de 10 para 50 μM, a proliferação celular diminu...
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Discussão
A curcumina, um polifenol derivado dos rizomas de Curcuma longa, é conhecida por suas propriedades anti-inflamatórias, antiangiogênicas, antiproliferativas e antioxidantes23,24. Além disso, possui propriedades antitumorais, particularmente sua capacidade de induzir apoptose em células malignas25. Embora pesquisas anteriores tenham enfatizado os efeitos supressores de crescimento da curcumina nas células RB...
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82271218); Fundo de Ciência do Hospital de Olhos de Tianjin (Projeto Geral ykyb1908).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Kit de coloração dupla Anexina V-APC/PI | Solarbio | CA1020 | avaliar quantitativamente a apoptose em células RB por citometria de fluxo |
| Kit de ensaio CCK-8 | Beyotime | C0038 | medir a absorvância a 490 nm para avaliar a capacidade proliferativa celular |
| Incubadora CO2 | Eppendorf | manter condições ótimas de cultura (37° C, 5% de CO2 e umidade saturada) para propagação de células RB | |
| Curcumina | Sigma | C1386 | Investigando os efeitos antitumorais da curcumina no retinoblastoma (RB) |
| Substrato quimioluminescente ECL | Biografia | C05-07004 | visualizar bandas de proteínas na análise de Western blot |
| Soro fetal bovino (FBS) | VivaCell | C04001-500 C04002-500 | Cultura de células |
| Citometria de fluxo | Beckman Coulter | Gálio | analisar quantitativamente a taxa de apoptose das células |
| ImageJ Software | Institutos Nacionais de Saúde | Versão 6 | Análise de banda de Western blot, avalia os níveis de expressão de proteínas |
| Microscópio invertido | Olimpo | CKX53 | observar e contar células invasivas em 400 vezes; magnificação no ensaio de Transwell |
| Lipofectamina 3000 | Invitrogen | L3000015 | Transfecção Celular |
| Leitor de microplacas | Thermo | K3 | quantificação do ensaio de imunoadsorção enzimática (ELISA) |
| miR-22 imita lentivírus | Hanheng Biotecnologia | tem-miR-22 | estabelecer uma linhagem celular transfectada de forma estável para experimentos com animais |
| Sistema multiplex de PCR em tempo real | Bio-Rad | CFX384 | realizar RT-PCR quantitativo (qRT-PCR) para análise precisa da expressão gênica |
| Penicilina-estreptomicina (PS) | Abbkine | BMC1030 | Adicionado a meios de cultura de células para evitar contaminação bacteriana |
| Kit de extração de proteínas | Solarbio | BC3640-50T | Isolamento de proteínas de amostras celulares e de tecidos |
| Vetor psiCHECK-2 | mega | JR20110328 | construir plasmídeos repórter Wnt1-WT (tipo selvagem) e Wnt1-MUT (mutante) para investigar a interação entre miR-22 e Wnt1 3'UTR |
| Membrana em PVDF | Merck | ISEQ00010 | blotting de proteínas |
| Anticorpo secundário IgG de coelho | Tecnologias de sinalização celular | 14708 | Detecção de Western blot por ligação ao anticorpo primário |
| Software estatístico SPSS | IBM | SPSS 20.0 | realizar análises estatísticas sobre os dados experimentais |
| Kit SuperMix de síntese de primeira fita SuperScript III | Invitrogen | 11752-050 | transcrição reversa de RNA em cDNA para análise subsequente de RT-PCR |
| SYBR Premix Ex Taq II Kit | Biografia de TaKaRa | RR820A | Para RT-PCR detectar quantitativamente a expressão de Wnt1, β-actina e outros genes-alvo |
| Reagente de TRIzol | Invitrogen | 12183-555 | Extração de RNA de amostras celulares e de tecido |
| Espectrofotômetro UV | Beckman | DU800 | determinar a concentração e pureza de amostras de RNA |
| Wnt1 anticorpo | Abcam | AB15251 | Análise de Western blot para detectar a expressão da proteína Wnt1 |
| anticorpo β-actina | Abcam | AB8227 | usado como referência interna para normalizar a carga de proteínas na análise de Western blot |
| anticorpo de β-catenina | Tecnologias de sinalização celular | 37447 | Análise de Western blot para detectar a expressão da proteína β-catenina |
Referências
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