Esse protocolo estabelece uma definição objetiva de suficiência do enxerto baseada na produção diária de urina e nos valores do painel de função renal sérica para caracterizar de forma reprodutiva e objetiva se o enxerto é capaz de sustentar homeostase de forma independente, sem depender da diálise, nos primeiros 7 dias após o transplante.
Artigo de método
Um Protocolo Padronizado de Autotransplante de Rim Suíno para Estudar a Função Retardada do Enxerto
Neste artigo
Resumo
Resumo
Função tardia do enxerto (DGF) é comumente definida como a necessidade de diálise dentro de 7 dias após o transplante renal; No entanto, as definições atuais frequentemente dependem de julgamento clínico subjetivo e carecem de critérios padronizados que descrevam a suficiência do enxerto com precisão. Essa inconsistência dificulta diagnósticos e comparações de pesquisas. Este protocolo estabelece limiares objetivos para a DGF usando valores quantificáveis de produção urinar e função renal sérica para descrever objetivamente a suficiência do enxerto e a capacidade independente de manter a homeostase. A pesquisa em modelos suínos é desafiadora devido à ausência de critérios diagnósticos consensuais para a DGF e à dificuldade de realizar diálise por períodos prolongados. Para resolver isso, introduzimos um protocolo claramente definido para definir e induzir o DGF em autotransplante renal suíno após 30 minutos de isquemia renal quente isolada, simulando a obtenção semelhante à morte circulatória (DCD). Descrevemos métodos de cateterismo de Foley não invasivo, acesso venoso central e monitoramento da linha arterial em suínos fêmeas, permitindo medição precisa da produção urina, exames diários e monitoramento intraoperatório. Essas técnicas são detalhadas para garantir transparência e reprodutibilidade, criando um ponto final padronizado para estudos de DGF em suínos que recapitula o fenótipo clínico.
Introdução
A lista de espera para transplante de rim nos EUA ultrapassa 90.000 pacientes. Devido à escassez de enxertos, menos de 30.000 transplantes renais são realizados anualmente, enquanto uma coorte semelhante de novos pacientes foi adicionada à listade espera 1. Para enfrentar essa escassez crescente, rins com DCD lesionados por isquemia, subótimos, são cada vez mais escolhidos. Na verdade, desde 2023, 50% dos rins transplantados nos EUA vieram de doadores com DCD. Rins com DCD estão associados a altas taxas de função retardada do enxerto (DGF). A maioria define o DGF como uma necessidade de diálise dentro de 7 dias após o transplante de rim. Embora a DGF seja uma insuficiência temporária do enxerto, ela está associada a taxas aumentadas de rejeição precoce e tardia, e a uma sobrevivência mediana mais curta de 8-12 anos2. Sendo em sua maioria uma definição clínica subjetiva, a DGF é desafiadora de estudar em modelos suínos devido à falta de uma definição objetiva e padronizada e aos desafios da diálise de longo prazo em suínos. Neste trabalho, desenvolvemos um protocolo objetivo e padronizado para definir a suficiência do enxerto e induzir a DGF no autotransplante renal suíno. Devido às semelhanças comprovadas pela xenotransplante na função dos rins suínos e humanos, esse protocolo pode ser transferido para transplante de rim humano. A autotransplantação renal suína foi escolhida para esse modelo pelo principal motivo de isolar o efeito da lesão isquemia-reperfusão como a variável que controla a insuficiência precoce do enxerto e neutraliza a allimunidade ou toxicidade imunossupressora como fatores de confusão.
Definição de função retardada do enxerto: Para superar os dois principais desafios de 1) definir objetivamente a suficiência do enxerto e 2) definir a natureza temporária do fenótipo na ausência de suporte para diálise como ponte para a recuperação funcional do enxerto, utilizamos valores de produção objetiva de urina e painel de função renal para definir a doença. Padronizar a ressuscitação por volume, critérios de autotransplante, bem como ausência de compromisso anastomótico (artéria, veia ou ureter), descarta uma causa anatômica permanente de insuficiência do enxerto. Definimos a função tardia do enxerto em autotransplante suíno como: insuficiência temporária precoce devido a anúria prolongada (<100 mL/dia) que ultrapassa 3 dias, levando a níveis variáveis de acúmulo de BUN, creatinina e potássio até atingir um desfecho humano de K ≥ 8 mEq/L (alto risco de arritmia cardíaca e indicação objetiva para diálise urgente/urgente) na ausência de comprometimento anastomótico. Com base nessa definição, um enxerto funcional produz produção suficiente de urina para manter o equilíbrio eletrolítico e a queda da BUN e da creatinina. Por outro lado, um enxerto insuficiente não produz urina suficiente para excretar BUN e creatinina e causar hipercalemia potencialmente fatal, exigindo diálise (ou eutanásia humanitária na ausência dela), devido à lesão reversível por isquemia-reperfusão parênquima e não compromisso ou rejeição anastomótica irreversível.
Protocolo
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional de Animais da Universidade Duke (IACUC). Porcos Yorkshire apenas femininos (para inserção de cateter de Foley não invasivo) pesando 40-50 kg (para diâmetros ostiais renais e uretrais convenientes para canulação) são usados neste modelo. Esse protocolo podia ser realizado por uma equipe de quatro pessoas: um cirurgião, um assistente, um perfusionista de órgãos e um gerente de estudo (para amostras, suprimentos e dados).
1. Dia pós-operatório (POD) -1 (Obtenção renal)
- Anestesia
- Pré-medicar os animais com injeções intramusculares (IM) de cetamina (22 mg/kg) e Midazolam (0,5 mg/kg).
NOTA: Começar com uma dose relativamente maior de cetamina ajuda a reduzir com segurança a necessidade intra-operatória de isoflurano. - Administre Isoflurano inicialmente pelo cone do focinho a 1-1,5% (máximo 2,5%) até que a mandíbula e as vias aéreas superiores estejam relaxadas para permitir a intubação. Ajuste o volume de maré entre 7-7,5 mL/kg e a taxa de ventilação em 18-20 respirações por minuto para manter os níveis fisiológicos de saturação de oxigênio ePCO 2. Aplique suavemente pomada para os olhos e/ou cole as pálpebras com fita adesiva para proteger os olhos contra arranhões ou ressecamentos.
- Pré-medicar os animais com injeções intramusculares (IM) de cetamina (22 mg/kg) e Midazolam (0,5 mg/kg).
- Instalação de linhas centrais em túnel
- Coloque uma linha central de Hickman tunelada em um único lúmen de 9,6 Fr, saindo da pele pela parte de trás do porco entre as omoplatas para permitir uma coleta de sangue indolor e sob demanda, permitindo que ela se deite de lado com o mínimo de sofrimento e baixo risco de perturbação do cateter da linha central (Figura 1).
- Após preparar a pele, usando um bisturi de 11 lâminas, realize três incisões superficiais de punhalada pela derme até a camada de gordura subcutânea, entre as omoplatas, na nuca e na parte anterior direita do pescoço.
- Use o tunelador de tecido para criar um túnel subcutâneo que conecta as três incisões. Enquanto estiver deitado, passe o cateter entre as omoplatas até a parte direita anterior do pescoço.
- Para inserir o cateter da linha central na veia jugular externa direita (EJ), vire o porco para a posição de Trendelenburg deitado e use uma agulha localizadora de 18 G para aspirar a EJ usando a técnica de triangulação anatômica de Flourney eMani 3. Fie um fio no lúmen usando a técnica4 de Seldinger, use o introdutor peel-away para dilatar o trajeto, enfie o cateter Hickman no lúmen do EJ e fixe a linha central na parte de trás. Após a confirmação do retorno sanguíneo, a heparina trava a linha e repete após cadauso 5. Se acessar o EJ direito for desafiador, use o túnel de tecido para estender o túnel subcutâneo anterior à traqueia e entregue o cateter para o lado esquerdo do pescoço para inserção no EJ esquerdo.
- Coloque uma linha central de Hickman tunelada em um único lúmen de 9,6 Fr, saindo da pele pela parte de trás do porco entre as omoplatas para permitir uma coleta de sangue indolor e sob demanda, permitindo que ela se deite de lado com o mínimo de sofrimento e baixo risco de perturbação do cateter da linha central (Figura 1).
- Colocação de Foley (três métodos para aumentar a invasividade em caso de falha na inserção)
- Abordagem manual
- Coloque o animal deitado na mesa de cirurgia. Prepare a pele ao redor da abóbada vaginal com betadine e inunde a abóbada vaginal com 10 mL de betadine (para diminuir a carga microbiana e o risco de infecção urinária).
NOTA: Mesmo quando totalmente inflados, balões de 5 mL tendem a escorregar. - Insira manualmente um cateter de Foley lubrificado a 12-14 Fr, endurecido com um fio, sentindo a abertura uretral a 4-5 cm de profundidade na abertura vaginal na parede vaginal anterior (ventral).
- Coloque o animal deitado na mesa de cirurgia. Prepare a pele ao redor da abóbada vaginal com betadine e inunde a abóbada vaginal com 10 mL de betadine (para diminuir a carga microbiana e o risco de infecção urinária).
- Abordagem com espéculo: Se a abordagem manual falhar, use um espéculo lubrificado para visualizar a abertura uretral dentro da vagina. Use as pinças DeBakey longas com gaze estéril para secar suavemente o Betadine e insira o cateter Foley balão 12-14 Fr, 10 mL, com ou sem fio de rigidez sob visualização direta. Infle o balão somente após verificar o retorno da urina.
- Abordagem cirúrgica: Se a abordagem do espéculo (passo 1.3.2) também falhar, insira cirurgicamente o cateter de Foley sobre um fio. Após a laparotomia, insira uma agulha de 18 G na bexiga, insira um fio de 0,035" de aproximadamente 1 m de comprimento na uretra através da bexiga, e passe o cateter de Foley sobre ele até a bexiga e infle o balão. Retire o fio pela vagina (para evitar contaminação abdominal) e feche o pequeno orifício da agulha na bexiga com um fechamento em uma única camada em forma de 8 Prolene 6-0. Sutura o corpo do Foley e um saco de coleta de urina de 1 L à pele do porco (Figura 1).
- Abordagem manual
- Medicação pré-incisão
- Administrar a primeira dose diária de antiplaquetas de aspirina 81 mg por via oral dentro da bolsa da bochecha, seguida pelo antibiótico intramuscular ceftiofur depot, 1 g de cefazolina IV via via via central para prevenção de SSI, buprenorfina intramuscular (0,005-0,01 mg/kg) para controle da dor, e iniciar um total de 1 L de solução eletrólica equilibrada a uma infusão constante de 250 mL/h.
2. Autotransplante renal de DCD suíno
- Obtenção renal
- Prepare e coloque a pele do abdômen. Realize uma laparotomia na linha média do xifoide até o púbis.
NOTA: Existem 1 ou 2 veias grandes que cruzam a linha média subcutânea perto do púbis e que sangram profusamente se forem cortadas, mas são facilmente controladas com eletrocauterização. - Instale um retrator Bookwalter (ou dois retratores Balfour a 90°) com quatro lâminas na parede corporal segurando ambos os lados da parede abdominal para cima, para evitar o vazamento do intestino delgado do abdômen, com compressão venosa e linfática subsequente, além de inchaço intestinal.
- Usar duas toalhas cirúrgicas quentes umedecidas com soro fisiológico para retrair o intestino para o lado esquerdo do abdômen e substituir os retratores acima deles para expor suavemente o retroperitônio direito contendo o rim direito.
NOTA: Um certo grau de posição de Trendelenburg (cabeça para baixo) pode ajudar na retração intestinal também. - Abra o peritônio posterior no lado lateral do rim (para evitar ferir o ureter direito antes de visualizá-lo). Dissecar o ureter direito do peritônio posterior e da artéria renal direita e dividi-lo entre duas amarras de seda 2-0 no polo inferior do rim direito. Deixe uma cauda de sutura mais longa no ureter restante para facilitar a identificação durante o implante (24 horas depois). Deixe o restante do ureter coberto pelo revestimento peritoneal para reduzir cicatrizes e a necessidade de dissecação extensa na segunda operação de implante.
NOTA: Tome cuidado para não ferir as duas veias lombares que se juntam à VCI imediatamente após a decolagem da artéria renal direita da aorta (anatomia específica de suínos diferente da retroperitoneal humana). Amarrar e dividir essas veias lombares também é uma opção segura. - Dissecar a artéria renal afastando-a da veia renal e ao longo de seu trajeto sob a VCI até sua origem aórtica para obter o máximo comprimento arterial disponível. Comprima brevemente a VCI e rode-a em direção ao retroperitônio esquerdo para expor a origem da artéria renal direita que corre por baixo dela após sua decolagem da aorta abdominal.
NOTA: Em suínos, normalmente há 1 a 2 linfonodos associados à artéria renal que a obscurecen; no entanto, a artéria renal torna-se bem esqueletocada após a dissecação e remoção desses gânglios. - Dissecar a veia renal direita para longe da glândula adrenal direita de forma craniana. Para obter alguns milímetros de folga entre a veia renal direita e a glândula adrenal, levante cuidadosamente o revestimento peritoneal posterior da veia renal direita até que as veias maiores drenantes adrenais sejam visualizadas entrando na VCI.
- Para simular o processo de obtenção da DCD, administre 500 U/kg de heparina pela linha central e deixe circular por 5 minutos, depois faça uma dupla amarração na artéria renal seguida pela veia renal em sua origem (para máxima extensão) usando laços de seda 2-0 ou maiores (os laços 3-0 são muito finos e frágeis para esse tecido complacente e escorregam frequentemente) e comece um cronômetro por 30 minutos de in-situ Tempo isquêmico quente renal isolado. Durante o período isquêmico quente, use tesouras de tenotomia ou eletrocauterização na configuração de corte para esqueletar e separar a artéria renal e a veia entre si, facilitando o implante posteriormente.
NOTA: A esqueletização dos vasos in situ durante o período isquêmico quente aproveita o controle vascular para prevenir a perda de sangue em caso de lesão vascular, permitindo que os vasos cheios de sangue revelem quaisquer pequenos vazamentos vasculares que possam ser reparados por sangramento da circulação renal isolada ligada para a simulação da lesão isquêmica. - Ao final do tempo isquêmico quente, divida os vasos e o ureter e canule a artéria renal com uma cânula reta de 3 mm e administre 250 mL de solução gelada da Belzer University of Wisconsin via artéria renal.
NOTA: Uma cânula reta de 5 mm é grande demais e pode causar danos íntimos e formação de abas. - Preserve o enxerto por meio de perfusão de máquina hipotermica não oxigenada por 24 horas. Irrige o abdômen com 1 L de solução eletrolítica equilibrada e feche a fáscia com suturas contínuas em laço Prolene 1-0. Irrige a ferida e feche a pele com grampos.
- Extube o porco, volte ao terrário e recupere da anestesia por 24 horas. Para controle da dor, intenha Bupivacaína (dosagem baseada em peso) subcutâneamente nas bordas da ferida e administre Buprenorfina de liberação prolongada intramuscular (dosagem baseada em peso).
NOTA: O paracetamol também pode ser administrado sem efeito sobre a GFR (diferente dos AINEs).
- Prepare e coloque a pele do abdômen. Realize uma laparotomia na linha média do xifoide até o púbis.
- Implantação renal
NOTA: A implantação renal ocorre intraperitonealmente após a abordagem modificada Starzl do implante renal diretamente na aorta abdominal e na VIN com anastomose ureter-ureter6. O rim direito é explantado e reimplantado em uma posição inferior, invertido no retroperitônio direito, seguindo a técnica Simforoosh7. O tempo da cirurgia do implante varia entre 3 e 5 horas, e o tempo de costura do implante entre 20 e 40 minutos, dependendo do nível de treinamento ou especialização e da complexidade da anatomia.- Após 24 horas de recuperação, pré-medice, intube, prepare e coloque novamente o abdômen do porco na sala cirúrgica (Figura 2).
- Colocação da linha arterial (três métodos em caso de falha na inserção)
- Linha arterial auricular: Para monitorar a hemodinâmica intraoperatório e guiar a ressuscitação de fluido e pressor, especialmente após a reperfusão, para apoiar o animal durante a síndrome de reperfusão e evitar causar uma lesão renal aguda secundária de baixo fluxo (AKI), colocar uma linha arterial angiocath 22 G na artéria auricular através da palpação do pulso da artéria auricular no lado posterior de qualquer das orelhas do porco.
- Linha arterial carótida: Se a inserção auricular falhar, alternativamente, crie uma incisão na linha média do pescoço até a traqueia. Dissece o tecido conjuntivo adjacente à traqueia e retraia-o usando um Weitlaner ou um retrator auto-retido Gelpi. Uma vez visualizado, circundeie a artéria carótida com uma amarração de seda 2-0. Coloque uma linha carótida percutânea de 4 Fr Cordis via técnica de Seldinger sem a necessidade de dilatação arterial. Amarre a extremidade distal da carótida e deixe uma amarração de seda 2-0 para amarrar a extremidade proximal ao final da operação após a remoção da linha arterial, seguida de um fechamento da pele grampeada.
- Linha arterial femoral. Alternativamente, uma linha femoral pode ser inserida percutaneamente ou por meio de corte.
NOTA: Uma linha femoral será temporariamente infuncional durante o clampamento da aorta para a anastomose arterial durante o implante.
- Colocação da linha arterial (três métodos em caso de falha na inserção)
- Medicação pré-incisão
- Administrar a segunda dose diária de antiplaqueta, aspirina 81 mg por via oral dentro da bolsa da bochecha, seguida por 1 g de cefazolina IV via via linha central para prevenção de SSI, Buprenorfina intramuscular (0,005-0,01 mg/kg) para controle da dor, e iniciar um total de 4 L de solução eletrólica equilibrada a uma infusão constante de 250 mL/h.
- Inicie uma infusão constante de dopamina não titulável pela linha central em 2 μg∙kg-1∙min-1 e a infusão de noradrenalina pode ser titulada até um máximo de 0,4 μg∙kg-1∙min-1 para um MAP-alvo de 80-100 mmHg.
NOTA: A taxa de administração de líquido pode ser temporariamente aumentada para 1 L/h ou mais por meio de uma bolsa de pressão imediatamente antes da reperfusão para proporcionar melhor suporte hemodinâmico caso a hipotensão durante a síndrome de reperfusão seja particularmente desafiadora.
- Reabra o abdômen removendo os grampos da pele e cortando os pontos fasciais, e reintroduza o retrator Bookwalter.
- Dissecar a cobertura peritoneal descendente do cólon sobre a linha média sobre a aorta e a VI (em suínos, o cólon descendente é fixado por meio de uma cobertura peritoneal mais curta à linha média que cobre a aorta e a VCI, dos vasos renais esquerdos até a artéria mesentérica inferior, revelando a aorta e a VI no retroperitônio (local da inserção do enxerto renal)8.
NOTA: Tome cuidado para dividir apenas a fixação peritoneal do cólon imediatamente acima dos grandes vasos e não desvascular o cólon descendente dividindo as artérias mesentéricas superiores e inferiores arqueadas que correm mais próximas à parede do cólon.
Não foi observada hérnia interna com essa manobra, como evidenciado pelas necrópsias, que revelaram que esse espaço já havia cicatrizado e fechado espontaneamente no sétimo dia pós-operatório. - Dissecar a aorta e a VCI de sua fixação peritoneal lateral aos músculos psoas bilateralmente. Depois, dissecar a aorta e a VCI separadas até que as artérias e veias lombares sejam visualizadas. Opcional: permitir a máxima elevação e exposição do lúmen da aorta na pinça Satinsky durante a costura, dissecar, amarrar e dividir as 1-2 artérias e veias vertebrais que geralmente são encontradas naquele segmento dos grandes vasos (dos vasos renais esquerdos até a artéria mesentérica inferior) nesse segmento da aorta lombar entre 2-0 amarras de seda. Esqueletice a seção lombar da aorta a partir de sua pesada cobertura adventícia para prepará-la para a implantação.
NOTA: Não foram observadas complicações na coluna com essa manobra. - Administre 100 U/kg de heparina sistematicamente pela linha central e deixe circular por 5 minutos. Simultaneamente, peça à equipe de anestesia que aumente temporariamente a taxa de infusão de solução eletrolítica equilibrada de 250 mL/h para 1 L/h e comece a titular a norepinefrina conforme necessário até um máximo de 0,4 μg∙kg-1∙min-1 para alcançar uma MAP de 80-100 mmHg em preparação para a síndrome de reperfusão.
- Prenda a VCI com uma pinça Satinsky de mordida lateralmente em ângulo caudal (para não interferir nas mãos do cirurgião de costura posicionadas do lado esquerdo do porco) e crie uma venenotomia e aspire/lave o interior da VCI.
- Retire o rim do gelo ou da perfusão da máquina e lave-o com 250 mL de solução eletrolítica equilibrada a gelo e leve-o ao campo operatório, marcando o início do segundo tempo isquêmico quente (de costura).
- Vire o autoenxerto de rim direito de cabeça para baixo (técnica Simforoosh), de modo que o ureter fique apontado para cima, a artéria medial e a veia lateral, colocando-se no lado direito do abdômen, voltado para a aorta infrarrenal 7,9.
- Anastomose venosa: Use dois pontos 6-0 Prolene de braços duplos para realizar uma anastomose venosa em movimento. Coloque uma pinça de bulldog na veia renal e remova a pinça Satinsky. Independentemente do momento da costura da veia, mantenha a pinça Satinsky na VCI por 25 minutos padronizados para permitir lesão isquêmica padronizada no enxerto.
- Anastomose arterial: Após a pinça de 25 minutos da veia intravenosa e a fixação de 5 minutos entre vasos, use novamente a pinça Satinsky para prender completamente a aorta. Faça uma incisão em fenda e alarge-a usando um punção redonda de 4,0 mm para garantir uma abertura limpa. Use um ponto Prolene 6-0 com dois braços para realizar um paraquedas ou anastomose arterial de cicatrização até os dedos. Da mesma forma, independentemente da velocidade de conclusão da anastomose arterial, mantenha a pinça Satinksy por 25 minutos na aorta para padronizar um tempo total de costura de 55 minutos.
NOTA: O tempo isquêmico quente total (30 minutos simulando doação e 55 minutos simulando manipulação do implante) levou à indução do DGF. - Reperfusão de enxerto: Após os 55 minutos padronizados de tempo isquêmico quente de costura, remova primeiro a pinça bulldog na veia renal, seguida pela pinça Satinksy na aorta, e verifique a reperfusão do enxerto e hemostasia. Manter uma ressuscitação agressiva de fluidos e norepinefrina para alcançar uma MAP de 80-100 mmHg por aproximadamente 1 hora após a reperfusão, para apoiar o animal durante a síndrome da reperfusão.
NOTA: Não se esqueça de controlar quaisquer locais de biópsia com agulha de 18 G — se realizados — com pressão e eletrocauterização superficial coagulativa alta. - Anastomose do ureter: Esqueletizar-se os ureteres restantes e os do enxerto removendo 1 cm do tecido adiposo ao redor. Espatulado 1 cm do ureter do enxerto e do ureter direito remanescente. Use dois pontos 6-0 Prolene (PDS de dois braços ao planejar sobrevivência a longo prazo para diminuir o risco de formação de pedras) para aproximar os pontos. Passe um stent ureteral duplo J de 7F x 24 cm sobre a anastomose fresca e complete a anastomose com suturas correndo.
- Nefrectomia contralateral
- Para permitir que o rim transplantado seja o rim que sustenta a vida, remova-se o rim contralateral (esquerdo).
- Fechamento abdominal
- Após verificar a hemostasia e a contagem, irrige o abdômen com 1 L de solução eletrólica equilibrada e feche a fáscia com Prolene 1-0 em laço, seguido de irrigação e fechamento da pele com grampeador. Injetar 0,25% de bupivacaína na linha de sutura para fornecer anestesia local e injetar SQ de liberação prolongada suficiente para controle da dor. Extube o porco e devolva-o ao terrário separado usando barreiras de vidro ou plástico para evitar que ele morda as linhas centrais e os cateteres de Foley um do outro.
- Após 24 horas de recuperação, pré-medice, intube, prepare e coloque novamente o abdômen do porco na sala cirúrgica (Figura 2).
- Cuidados diários pós-operatórios
- Verifique os porcos durante as rondas de QID principalmente para garantir que o saco coletor de urina não fique superlotado, causando obstrução pós-renal iatrogênica e rupturas da bexiga ou ureter.
- Pela manhã, administre 81 mg de aspirina antiplaquetária oral, colete uma amostra de sangue da linha central e faça heplock, e meça a produção urinar no saco e amostre.
NOTA: Não são indicados mais fluidos intravenosos ou medicamentos, pois os porcos geralmente recuperam o apetite e a função intestinal com POD1.
- Sacrifício
- Ao final do estudo com POD7, ou antes para um desfecho humano, coloque o porco novamente sob anestesia endotraqueal geral e examine o enxerto com ultrassom para integridade anastomótica, seguido da reabertura do abdômen conforme descrito anteriormente.
- Examine o enxerto em busca de sinais de perfusão e examine as três anastomoses para verificar a permeabilidade. Remova o enxerto com as três anastomoses intactas e espatule-as ao longo do comprimento para verificar sua integridade interna e permeabilidade.
- Biópsia do parênquima do rim com uma pistola de biópsia de 18 G.
Resultados
Função imediata versus retardada do enxerto. Realizamos autotransplantes de rins com DCD de 30 minutos em n = 5 porcinos após 24 horas de preservação da máquina hipotermica não oxigenada usando (MAP = 40 mmHg) e monitoramos o fenótipo da recuperação e função do enxerto na primeira semana após o transplante, utilizando amostras diárias de sangue e produção total de urina. Observamos dois fenótipos de recuperação pós-transplante. O primeiro fenótipo foi de recuperação/suficiência imediata/precoce do enxerto. Três em cada cinco porcos implantados com os enxertos simulados de DCD (60%) tiveram retorno da produção urinar (produção diária de urina > 500 mL/dia) pelo POD 2-3, permitindo homeostase eletrolítica contínua sem intervenção (diálise, quelação de potássio ou deslocamento intracelular mediado por insulina) (Figura 3). O segundo fenótipo foi função tardia do enxerto (DGF), caracterizada por anúria sustentada após POD 3, associada ao acúmulo de BUN sérico, creatinina e desenvolvimento de hiponatremia e hipercalemia, que seria uma indicação clínica objetiva para diálise. Anúria e hipercalemia progrediram a ponto de causar alterações no ECG (ondas T de pico) em torno de K ≥ 8 mEq/L. Isso representou uma indicação urgente para a diálise e, portanto, foi tratado como um desfecho humano. Uma vez alcançado esse desfecho, foi realizada eutanásia sob anestesia geral para descartar outras causas de insuficiência/falha do enxerto devido a compromisso anastomótico ou outras complicações cirúrgicas. Usando essa definição de DGF, rins de DCD suínos com 30 minutos de isquemia quente in situ , seguidos por 24 horas de preservação da máquina hipotermia não oxigenada e 55 minutos de costura em tempo isquêmico quente desenvolveram DGF a uma taxa de 40% (dois em cada cinco porcos). Essa taxa de DGF recapitula a taxa relatada em transplante renal deDCD humano 1.
Figura 1: Linha central em túnel e colocação do cateter Foley. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Autotransplante renal de DCD porcino que sustenta a vida. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Figura 3: Função retardada do enxerto no modelo suíno. A diferença na produção de urina (A ) entre enxertos de função imediata e de função retardada; (B) níveis de potássio entre enxerto de função imediata e retardada; (C) níveis diários de creatinina sérica entre enxertos de função imediata e retardada. Todos os valores são representados como Média + SEM com valores reportados como LOCF e analisados por análise de modelos mistos. Abreviação: LOCF = última observação levada adiante. N=5 porcos por braço. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Discussão
O atraso na função do enxerto impacta negativamente o curso clínico após o transplante renal. No início do pós-transplante, está associada a hospitalização prolongada, maior taxa de procedimentos invasivos e maior risco de rejeição. A longo prazo, o DGF também está associado a uma sobrevivência mais curta do enxerto. A DGF é uma manifestação de lesão severa por isquemia-reperfusão (I/RI), evidenciada por sua maior prevalência em transplantes de DCD em comparação com DBD ou transplantes de rim com doador vivo. A lesão renal aguda (AK) é secundária à necrose tubular aguda causada por I/RI e acredita-se ser a razão mais comum pela qual um aloenxerto não funciona imediatamente. Clinicamente, o DGF é definido pela necessidade de diálise dentro da primeira semana após o transplante. Em modelos animais de grande porte, a DGF tem sido desafiadora de definir e estudar devido à falta de uma definição padronizada de suficiência do enxerto e à incapacidade de realizar diálise para determinar a natureza temporária da condição, sendo a diálise uma ponte para a recuperação funcional do enxerto.
Neste protocolo, foi escolhido um modelo suíno, pois é amplamente aceito como estreitamente paralelo à fisiologia renal humana (como comprovado por recentes xenotransplantes bem-sucedidos)10,11. A autotransplantação foi escolhida para eliminar a resposta alloimune, a rejeição e a necessidade e os efeitos tóxicos confundidores dos inibidores de calcineurina. A definição de DGF baseia-se em anúria prolongada (<100 mL de urina por dia) após POD3, levando a alterações graves no eletrocardiograma associadas à hipercalemia. A cateterização de Foley possibilita a coleta precisa de urina, o que ancora a definição de função e suficiência retardada do enxerto ao resultado funcional da qualidade e quantidade da urina. A coleta diária de sangue permite a vigilância diária dos parâmetros tradicionais do painel de função renal, fornecendo um quadro abrangente da homeostase eletrolítica.
Acreditamos que estabelecer um modelo animal confiável e reprodutível de função retardada do enxerto aceleraria o estudo de terapias eficazes para função retardada do enxerto e resultaria, em última análise, em melhorias nos resultados do transplante renal. Em resumo, este protocolo estabelece um modelo reprodutível de autotransplante renal suíno que permite a caracterização objetiva da função retardada do enxerto usando produção quantificável de urina e parâmetros bioquímicos séricos após lesão isquêmica quente controlada. Ao incorporar condições cirúrgicas padronizadas, coleta de urina não invasiva e monitoramento laboratorial seriado, essa abordagem fornece um arcabouço prático para estudar a DGF na ausência de diálise e facilita a comparação com fenótipos clinicamente relevantes da disfunção pós-transplantedo enxerto 12,13,14,15.
Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
Agradecemos ao laboratório de perfusão de órgãos de Toronto (Top lab) por compartilhar sua expertise durante o treinamento em transplante renal suíno. Também agradecemos a Michelle Mendiola Pla por compartilhar sua expertise sobre a inserção de Foley suíno não invasivo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Inserção de Foley Supina | |||
| 12 Pe. Foley | Coleta de urina | ||
| Lubrificante cirúrgico | Inserção de foley | ||
| 1 L de saco de urina | Coleta de urina | ||
| Sutura de nylon 2-0 | Foley e fixação da linha central | ||
| Espéculo & Long Debakey & Luz | Inserção de foley | ||
| Tubos de amostragem de urina (50ml cônico) | Amostragem de urina | ||
| CG8 + Chem 8 + Cartuchos Piccolo | Laboratórios diários | ||
| Inserção da linha central propensa a deitada | |||
| 9,6 Fr Bandeja de cateter Hickman de lúmen único | Laboratórios diários | ||
| Lâmina 10 | incisões de faca para inserção de CVC | ||
| Linha central neddless luer-lock cap | |||
| Saco de hep-soro fisiológico (1L de soro fisiológico + 10 frascos de heparina) | heplock CVC | ||
| Explant | |||
| Pacote de laparotomia | |||
| Bovie | |||
| Alças de luz estéreis | |||
| Pacote de esponja | |||
| Toalhas OR - brancas 17X23 polegadas (4 por pacote) | |||
| 2-0 Gravatas de seda | Controle vascular | ||
| 1 L Plasmalito | Solução eletrólica balanceada | ||
| Bandeja de instrumentos para laparotomia geral estéril, bandeja | |||
| Solução fisiológica normal e quente para toalhas de molho de intestino | Manuseio intestinal | ||
| Caixa de gerenciamento de agulhas | |||
| Retrator Bookwalter | |||
| Backtable | |||
| Bolsas de órgãos estéreis - 2 por rim | |||
| 1 L de saco cristaloide para slushy | |||
| Solução UW - 250ml por rim | |||
| Tubo de lavagem | |||
| Angiocath calibre 14 | |||
| Drape de máquina | |||
| Peso do órgão (Balança + tigela + bolsa estéril do órgão) | |||
| Perfusão por máquina | |||
| Máquina de perfusão | Transportador de Rim Lifeport | ||
| Câmara de órgão descartável | Transportador de Rim Lifeport | ||
| Solução de perfusão | Solução KPS-1 | ||
| Implante | |||
| Tubo de sucção | |||
| Ponta de sucção Yankauer | |||
| Recipiente de sucção | |||
| Ferras de borracha | |||
| Punção aórtica de 4 mm | Anastomose arterial | ||
| Instrumentos de microcirurgia + pinça | |||
| Fio-guia do ureter | |||
| Stent de ureter - 4,8 fr x 12 mm | Anastomose do ureter | ||
| Fechamento abdominal | |||
| Proleno em 1 loop | |||
| Bupivacaína | |||
| Grampeadores de pele | |||
| Amostras | |||
| Bandeja de amostras | |||
| Pistola de biópsia 14 G | |||
| Potes de biópsia NBF | |||
| Tubos Eppendorf | |||
| Tubos de sangue verdes no topo | |||
| Cônicas de 15 mL | |||
| Medicamentos | |||
| Frasco de norepinefrina | |||
| Frasco de dopamina | |||
| 1 L plasmalito | Solução eletrólica balanceada | ||
| Comprimidos de aspirina 81 mg post-pom a cada dia | |||
| Frasco de cefazolina | |||
| Exceed | |||
| Unidades de heparina 10K |
Referências
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Reimpressões e permissões
