Artigo de método

Um protocolo econômico e minimamente invasivo para gravação crônica de eletroencefalografia em vários locais em camundongos que se movem livremente

DOI:

10.3791/69314

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10 de outubro de 2025

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1Department of Cellular Biology and Anatomy, Medical College of Georgia at Augusta University, 2National Institute of Biotechnology, 3Department of Neuroscience and Regenerative Medicine, Medical College of Georgia at Augusta University, 4Department of Neurology, Medical College of Georgia at Augusta University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo foi desenvolvido para criar um sistema confiável e de fácil acesso para registrar EEG de roedores em movimento livre.

Resumo

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A eletroencefalografia (EEG) serve como uma ferramenta fundamental para rastrear a atividade elétrica no cérebro e tornou-se cada vez mais importante tanto no diagnóstico clínico quanto na pesquisa pré-clínica com animais. Embora o EEG de roedores ofereça uma plataforma poderosa para modelar distúrbios neurológicos humanos, as gravações de longo prazo geralmente são limitadas pelo alto custo, invasividade ou complexidade técnica dos sistemas existentes. Aqui, apresentamos um protocolo confiável, acessível, economicamente viável e minimamente intrusivo para aquisição crônica de EEG cortical em vários locais em camundongos em movimento livre. A técnica envolve a fabricação de fios de platina-irídio com eletrodos de parafuso conectados a uma interface do tipo barramento serial universal (USB), que são ancorados periduralmente com parafusos ósseos e fixados com adesivo e cimento dentário. O sistema permite a captura de sinal estável ao longo de vários meses, como demonstrado em camundongos C57BL / 6J do tipo selvagem com uma taxa de sobrevida pós-operatória de 85% (n = 20). O EEG foi amostrado a 1.000 Hz e filtrado entre 1 Hz e 500 Hz usando uma configuração de amplificador diferencial. Para validar o sistema, o pentilenotetrazol (20 mg / kg) foi administrado para induzir atividade semelhante a uma convulsão, levando a um aumento acentuado nas descargas interictais - de 2-5 no início do estudo para 20-51 eventos pós-injeção - acompanhado por aumento da amplitude do sinal. As descargas foram identificadas com base na morfologia da forma de onda e nas características do sinal que correspondem aos critérios eletrofisiológicos reconhecidos. A configuração é compatível com rastreamento de vídeo comportamental e pipelines de análise de código aberto e oferece suporte à integração com estudos farmacológicos, genéticos ou de neuromodulação. Este método fornece uma plataforma estável e adaptável para investigar a dinâmica da rede cerebral em modelos de roedores, com aplicações na pesquisa de epilepsia e além.

Introdução

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A eletroencefalografia (EEG) fornece uma medida direta da atividade elétrica cerebral e é amplamente utilizada no diagnóstico de epilepsia1. Nos últimos anos, as técnicas de EEG têm sido cada vez mais adaptadas para uso em modelos de pequenos animais para estudar distúrbios neurológicos, fisiologia do sono e dinâmica da rede cerebral 2,3,4. Com o advento de modelos de camundongos geneticamente modificados e avanços significativos nas tecnologias de registro, o EEG de roedores tornou-se uma ferramenta essencial para pesquisas pré-clínicas, oferecendo informações valiosas sobre mecanismos translacionais relevantes para a saúde do cérebro humano 5,6.

Capturar e manipular a atividade neural simultaneamente é fundamental para estudar a dinâmica cerebral nos níveis de macro e microcircuito. Essa abordagem dupla permite o monitoramento em tempo real das redes neurais envolvidas no início e progressão das convulsões. A epilepsia, caracterizada por crises recorrentes e muitas vezes imprevisíveis, surge de interrupções em circuitos cerebrais complexos4. Apesar de extensas pesquisas, os mecanismos que governam a disseminação e o início das convulsões permanecem incompletamente compreendidos, em parte devido ao uso limitado de tecnologias que permitem gravações simultâneas emvárias áreas do cérebro.

O registro de EEG de modelos animais que recapitulam distúrbios neurológicos humanos revelou picos interictais, descargas de picos e ondas e padrões de início de convulsões que refletem de perto os observados em pacientes humanos 8,9, avançando assim nossa compreensão das mudanças eletrofisiológicas que ocorrem no cérebro humano. Da mesma forma, as anormalidades do EEG detectadas em modelos da doença de Alzheimer, transtorno do espectro do autismo e esquizofrenia fornecem informações críticas sobre a atividade oscilatória neural interrompida e destacam potenciais alvos terapêuticos10.

Apesar das diferenças na anatomia e escala do cérebro, os EEGs de camundongos e humanos exibem semelhanças impressionantes 2,11. Ambos exibem bandas de frequência oscilatórias características - delta,, alfa, beta e gama - com espectros de potência geralmente seguindo uma distribuição de 1 / f 2,11. As transições entre os estados cerebrais, como o surgimento da atividade delta durante o sono sem movimento rápido dos olhos (NREM) ou o aumento da sincronização gama durante tarefas de atenção e memória, são conservadas entre as espécies. Além disso, a atividade epileptiforme, incluindo oscilações de alta frequência (HFOs) e padrões ictais, mostra perfis temporais e espectrais comparáveis em camundongos e humanos7.

As características conservadas do EEG de roedores e humanos tornam os modelos de camundongos altamente translacionais para o estudo de distúrbios cerebrais. O EEG do camundongo permite gravações invasivas e de alta resolução, permitindo análises detalhadas em nível de circuito12. Ele também suporta o teste de estratégias neuromoduladoras, incluindo agentes farmacológicos, controle optogenético e estimulação em circuito fechado13,14, que podem ser acoplados a ferramentas comportamentais e moleculares para interrogar com precisão a disfunção neural.

No entanto, deve-se ter cuidado ao extrapolar os resultados. O tamanho menor e a estrutura cortical mais simples do cérebro do camundongo podem afetar a propagação do sinal, e os potenciais relacionados a eventos cognitivos (ERPs) podem ser menos proeminentes em comparação com os humanos15. Garantir a consistência na colocação do eletrodo, referência de sinal e pipelines analíticos é fundamental para melhorar a reprodutibilidade e a validade entre laboratórios16.

O registro de EEG em pequenos animais apresenta oportunidades e desafios. O EEG de camundongo é tipicamente adquirido usando eletrodos implantados cronicamente posicionados por via peridural na superfície do crânio ou como eletrodos de profundidade inseridos em estruturas subcorticais17,18. Os eletrodos de superfície, como eletrodos de parafuso ou fio colocados na dura-máter, são minimamente invasivos e adequados para gravações longitudinais de longo prazo. Esses eletrodos estão abaixo do osso, o que fornece uma barreira de alta impedância para a gravação. Assim, os eletrodos durais em roedores podem ser considerados mais comparáveis à eletrocorticografia (eCoG) do que ao EEG. Os eletrodos de profundidade, por outro lado, oferecem maior resolução espacial e permitem o acesso a regiões cerebrais profundas, como hipocampo, tálamo ou amígdala, facilitando estudos sobre redes convulsivas e acoplamento oscilatório entre a distribuição das regiões 2,11.

Os modernos sistemas de EEG para roedores suportam gravação multicanal com alta resolução temporal e são frequentemente acoplados ao monitoramento de vídeo para correlação comportamental18. Além disso, os sistemas de EEG sem fio permitem a aquisição sem amarras e em tempo real em animais que se comportam livremente, minimizando as restrições de movimento e o estresse19. Embora com o tempo essas modernizações tenham sido disponibilizadas comercialmente, elas são muito caras ou muito invasivas para estudar o modelo de roedor por um longo período de tempo.

Para resolver essa lacuna, apresentamos um protocolo versátil e econômico para aquisição de EEG em vários locais em modelos de roedores, adequado para estudos de longo prazo com invasividade mínima. Esta abordagem de registro de EEG é particularmente adequada para estudos que requerem avaliação de alta resolução da atividade cortical em camundongos sob condições experimentais controladas. É melhor aplicado quando (i) o animal pode tolerar uma breve anestesia durante o implante do eletrodo e se recuperar totalmente, (ii) o posicionamento estável da cabeça ou o movimento mínimo é garantido durante as gravações, (iii) o monitoramento de longo prazo ou repetido da atividade neural é desejado e (iv) o projeto experimental pode acomodar a gravação de um ou vários animais, dependendo da capacidade do amplificador. Os investigadores devem considerar essas restrições para determinar se esse método está alinhado com seus objetivos experimentais.

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Protocolo

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Este protocolo recebeu aprovação do Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Augusta. O Guia do National Institutes of Health para Cuidados e Uso de Animais de Laboratório foi seguido em cada etapa do experimento. Todas as medidas possíveis foram implementadas para minimizar o número de animais utilizados neste estudo. Os camundongos usados para este estudo são C57Bl6J do tipo selvagem de 2 meses. O tempo necessário para executar cada etapa está incluído nas respectivas etapas.

1. Preparação dos pinos do plugue com eletrodos (5 min)

  1. Use pinos de plugue fêmea USB tipo B com 5 pinos para soldar com fio de platina-irídio de 0.003". Remova a camada do fio antes de soldá-lo com o pino. O quarto pino dos cinco pinos é o pino de aterramento; não o use para conectar aos eletrodos (Figura 1A). Use os outros 4 pinos para conectar os eletrodos.
  2. Dobre os pinos em cerca de 45° e enrole os fios em torno de cada pino duas vezes para garantir que os fios permaneçam conectados corretamente e não se soltem (Figura 1A).
  3. Adicione um pouco de pasta de fluxo de resina de solda a cada pino para limpar a superfície do pino para que possa ser soldado de forma eficaz.
  4. Adicione um pequeno pedaço de fio de solda a cada pino, use um ferro de solda para derreter o fio de solda e prenda permanentemente o pino ao fio de platina-irídio (Figura 1B-D).
    NOTA: Use uma pinça de 45° para segurar o fio e use outra para enrolar o pino. Faça todo o procedimento sob um microscópio de campo claro. Corte o fio restante após enrolar e soldar e mantenha a outra extremidade presa aos eletrodos.

2. Eletrodos de implantação (30 min)

  1. Anestesiar o camundongo com 0,5 mL de algodão embebido em isoflurano em uma câmara fechada e montar o camundongo no estágio estereotáxico. Certifique-se de que o mouse não esteja subdosado antes de montá-lo no palco, beliscando a perna traseira e esperando até que ele pare de responder ao beliscão. Inicie rapidamente o ventilador de isoflurano/oxigênio no nariz a uma taxa de 1.5% v/v.
  2. Injete no camundongo carprofeno (5 mg / kg) para reduzir as respostas inflamatórias e a dor, e dexametasona (0,1 mg / kg IM) para reduzir a inflamação e o inchaço cerebral. Use pomada para os olhos para manter os olhos úmidos, pois a exposição prolongada a anestésicos pode ressecar os olhos e danificá-los.
  3. Use um removedor de pelos ou raspe a parte superior do crânio para expor a pele. Siga a técnica asséptica para limpar a área da incisão usando etanol 70% e almofadas de iodo.
  4. Faça uma incisão clara de um único traço no meio da cabeça com um bisturi. Corte ao redor da incisão para expor o local de implantação do eletrodo. Certifique-se de que os músculos não estejam expostos (Figura 2A).
  5. Lave com solução de NaCl a 0,9% e seque a superfície. Esfregue a superfície com cotonetes embebidos ou embebidos em água oxigenada. O tecido conjuntivo no osso que é persistente pode ser removido com um bisturi. Aguarde pelo menos 1 minuto após esfregar.
  6. Lave com solução de NaCl a 0,9% e seque a superfície antes de começar a perfurar.
  7. Use uma broca dentária para tornar a superfície do crânio áspera para promover a adesão acrílica.
  8. Meça e aponte os locais de implantação do eletrodo (AP: +2, -4, ML: ±1,5)20 (Figura 2B).
  9. Perfure a superfície usando brocas de 1,4 mm e coloque 4 parafusos ósseos (1,5 mm) no orifício usando chaves de fenda de precisão. Certifique-se de que a perfuração não faça furos no osso. Os parafusos não devem fazer um orifício no cérebro, mas sim tocar a superfície (Figura 2C).
  10. Lave com uma solução de NaCl a 0,9% se houver sangue e espere secar. Use um vácuo, se necessário.
  11. Enrole os fios conectados ao conector USB ao redor de cada um dos parafusos 2 a 4 vezes e corte os fios restantes (Figura 2D).
  12. Coloque uma pequena gota de super cola (Loctite) na parte superior de cada parafuso e deixe secar para fortalecer a conexão. Certifique-se de que o conector esteja colocado no meio do crânio e não toque no crânio ou em qualquer um dos eletrodos (Figura 2E).
  13. Use cianoacrilato para construir lentamente a tampa da cabeça, um pouco de cada vez. Evite aplicar uma camada muito grossa, pois pode aquecer o osso. Prenda um parafuso grande na superfície plana do conector, que não entre em contato com o osso ou animal, usando cimento dental para auxiliar na conexão do cabo USB (Figura 2F).
  14. Deixe a tampa da cabeça secar por pelo menos 2 minutos antes de soltar o mouse do estágio estereotáxico. Observe o mouse pelas próximas 24 horas em uma almofada térmica.
  15. Trate o camundongo com carprofeno pelos próximos 7 dias na dosagem de 5 mg / kg a cada 12 h. O mouse estará pronto para gravação de EEG após 2 semanas de espera para promover o crescimento ósseo na interface acrílica.
    NOTA: Tente manter o conector o mais próximo possível do crânio. Certifique-se de que não toque no crânio ou nos parafusos ósseos. Certifique-se de que os fios não estejam conectados uns aos outros em nenhuma das extremidades. Tenha cuidado para que o cianoacrilato entre no conector USB e nos olhos.

3. Gravação de EEG (65 min)

  1. Registre o EEG de cada camundongo por 1 h, 30 min antes do tratamento com Pentilenotetrazol (PTZ) e 30 min após o tratamento com PTZ de 20 mg/Kg.
  2. Conecte o cabo USB ao conector. Conecte o cabo USB a uma corrente alternada diferencial (CA) amplifier usando garras jacaré com o ganho definido para 10k e filtrado entre 0.1 Hz e 250 Hz21. Amostra de sinal de EEG a 1000 Hz (Figura 3).
  3. Grave as saídas do amplificador simultaneamente no computador e exiba-as em um osciloscópio para monitoramento em tempo real. Conecte o amplifier saídas a um dispositivo USB de aquisição de dados e condicionamento de sinal (por exemplo, NIDAQ) conectado ao computador (Figura 3).
  4. Use o código Python para registrar o sinal de EEG (disponível em https://github.com/schrodi159/blakelabeeg). O código filtra digitalmente o sinal em 0,1 Hz e 250 Hz.
    NOTA: A gravação do EEG em uma sala sem interferência elétrica melhora a qualidade dos dados e da gravação.

4. Interpretação dos dados

  1. Use o código Python para visualizar dados (disponível em https://github.com/schrodi159/blakelabeeg). Identifique as descargas interictais de cada registro (Figura 4A).
    NOTA: A descarga interictal foi considerada se a forma de onda for o dobro da linha de base e tiver uma duração inferior a 200 ms22 e seguir pelo menos 4 dos 5 critérios a seguir - onda di ou trifásica com um pico pontiagudo, duração diferente do fundo, assimetria da forma de onda, a atividade de fundo é interrompida pela presença e seguida por uma onda lenta posterior8, 20,22.

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Resultados

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Os eletrodos foram implantados em 20 camundongos em um fundo C57Bl6J, incluindo 5 camundongos C57Bl6J do tipo selvagem, com uma taxa de sobrevida pós-operatória de 85% mantida até 6 meses após a cirurgia (Figura 4B). Após 6 meses, as calotas começaram a se soltar e todos os camundongos foram sacrificados aos 8 meses de idade. O peso médio do conjunto das cabeças, incluindo o conector e os parafusos, foi de 1,13 g (n = 20). Os camundongos recuperaram a consci...

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Discussão

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Neste estudo, desenvolvemos e validamos um protocolo robusto, econômico e minimamente invasivo para registro crônico de EEG em vários locais em camundongos que se movem livremente. A implantação bem-sucedida de eletrodos de parafuso e eletrodos de platina-irídio fabricados sob medida soldados a um conector USB, juntamente com a taxa de sobrevivência observada e a qualidade do registro, demonstra a viabilidade e confiabilidade da técnica em registros crônicos. Notavelmente, este protocolo...

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Divulgações

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DTB é um consultor pago da Fundação Alfred Mann. Os autores não têm interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse de acordo com este trabalho.

Agradecimentos

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O DTB é apoiado pelo R01EY036089 de concessão do NEI e pelo RF1AG060754 de concessão do NIA. O XF foi apoiado por doações do James Fickel Alzheimer's Disease Research Fund, EY028158 e EY032488.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Fio de irídio platina 0,003"Sistemas AM777000
Parafusos de osso de 1,5 mmEspecialidades da Antrin Miniature000-120X1/16 SL BIND MS SST
Amplificador AC Sistemas AM
CarprofenoCovetrus11695-6935-1
Coldpac Dentadura base acrílicaYates Motloid Companyhttps://www.yates-motloid.com/collections/coldpac/denture-base
Broca dentária 1,4 mmVolvere GXN/A
DexametasonaVEDCO50989-437-12
Lubrificante para os olhosOptix Carehttps://theoptixcare.com/
Peróxido de hidrogênioSigma Aldrich7722-84-1
NIDAQ USB & NBSP;Instrumentos Nacionaishttps://www.ni.com/en/shop/data-acquisition/entry-level-usb-daq.htmlAquisição de dados e condicionamento de sinal USB 
PentilenetetrazolCaymen Chemicals18682
Pasta de fluxo de resina de solda  Wellerhttps://www.weller-tools.com/us/en/consumer/products/soldering-accessories/
Fio de solda 0,32"Radio ShackN/A
SupercolaLoctiteN/A
Plugs USB tipo B fêmeaVendedor QMX00292ABU9

Referências

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