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Artigo de método

Estratégias comparativas para detecção de ubiquitinação em lisados celulares de mamíferos usando SMAD2/SMURF2 como modelo

948 vistas

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DOI:

10.3791/69321

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17 de abril de 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Emergency Surgery, Wuhan Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 2Department of Medical Genetics, School of Basic Medicine, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

Neste artigo

Resumo

A ubiquitinação é um regulador crítico das funções intracelulares das proteínas. Aqui, descrevemos dois métodos de lise celular para detectar os níveis de ubiquitinação de proteínas do substrato em células de mamíferos e comparamos sua eficácia na análise dos níveis de ubiquitinação. A superexpressão proteica em células HEK293T foi induzida por transfecção transitória, e proteínas ubiquitinadas foram detectadas por análise western blot.

Resumo

A ubiquitinação, uma modificação pós-traducional, é um regulador crítico da função intracelular das proteínas. A ubiquitinação modula as funções das proteínas promovendo a degradação proteassomal ou alterando a localização subcelular por meio da sinalização dependente da cadeia da ubiquitina. Aqui, descrevemos dois métodos de lise celular para detectar os níveis de ubiquitinação do SMAD2 em células HEK293T e comparamos sua eficácia na análise dos níveis de ubiquitinação de proteínas. A superexpressão de proteínas nas células foi induzida por transfecção transitória. Os plasmídeos (HA-Ub, FLAG-SMAD2 e MYC-SMURF2) e os reagentes de transfecção foram adicionados separadamente ao meio basal, misturados, e a mistura foi adicionada às células. Antes da colheita, MG132 foi adicionado para inibir a degradação proteassomal e aumentar o acúmulo de proteínas ubiquitinadas. A principal divergência entre as duas abordagens experimentais são seus métodos de lise celular — o método do banho de gelo (realizado a 4 °C) e o método de tratamento térmico (envolvendo incubação a 95 °C), que afeta substancialmente a eficiência da lise proteica. Após a conclusão da lise celular, o lisado celular, as esferas de agarose e o anticorpo FLAG foram misturados e incubados a 4 °C durante a noite. Proteínas ubiquitinadas foram então detectadas por análise western blot. Antes de detectar proteínas ubiquitinadas, um anticorpo de cadeia leve era usado para a incubação secundária de anticorpos. Depois, bandas de ubiquitinação foram detectadas. Os resultados mostram que tanto o método do banho de gelo quanto o método de tratamento térmico podem ser usados para detectar níveis de ubiquitinação, enquanto o método de tratamento térmico pode facilitar a detecção da ubiquitinação do SMAD2. Este estudo delimita e compara dois métodos de lise celular para medir os níveis de ubiquitinação em células de mamíferos, utilizando SMURF2/SMAD2 como modelo, para auxiliar pesquisadores a selecionar métodos mais apropriados para detectar os níveis de ubiquitinação das proteínas do substrato.

Introdução

A ubiquitinação, uma modificação pós-traducional indispensável, é um regulador crítico das funções intracelularesdas proteínas 1. O sistema ubiquitina-proteassoma (UPS), que media a degradação de mais de 80% das proteínas em eucariotos, é composto por ubiquitina (Ub), enzimas ativadoras E1, enzimas conjugantes E2, ligases E3, enzimas deubiquitilantes (DUBs) e o proteassoma26S 26S. Esse sistema regula a renovação proteica com alta especificidade, controlando assim processos celulares essenciais como progressão do ciclocelular 3, transdução de sinal 4,5 e respostas aoestresse 6,7. A ubiquitinação é um processo enzimático em múltiplas etapas. E1 hidrolisa ATP para adenilar o C-terminal de Ub, formando um intermediário Ub-AMP. Em seguida, o Ub ativado é transferido de E1 para a cisteína do sítio ativo de uma enzima conjugante E2, formando uma ligação tioéster. Por fim, uma ligase E3 recruta tanto o complexo E2-Ub quanto uma proteína-alvo, catalisando a transferência de Ub de E2 para um resíduo de lisina nosubstrato 8.

A ubiquitina pode formar diversas cadeias de poliubiquitina por meio de ligação em sete resíduos de lisina (Lys6, Lys11, Lys27, Lys29, Lys33, Lys48, Lys63) ou Met1(M1)4. Cada tipo de ligação dita resultados biológicos distintos: cadeias ligadas a K48 têm como alvo principal proteínas para degradaçãoproteassomal 9, cadeias ligadas a K63 regulam sinalização e reparação do DNA10,11, e cadeias ligadas a M1 são críticas para respostas imunesinatas 12. Ubiquitinação e desubiquitinação são processos de modificação pós-translacional fundamentais que governam diversos eventos celulares, que vão desde a degradação de proteínas até a transdução de sinais. Por exemplo, no câncer colorretal, a ativação aberrante da ubiquitinação mediada por MDM2 da p53 leva à degradação excessiva da p53, prejudicando sua capacidade de induzir parada do ciclo celular e apoptose, impulsionando assim a progressão tumoral e a quimioresistência13,14. Na lesão por isquemia-reperfusão hepática, o OTUD1 estabiliza o NRF2 ao remover sua poliubiquitinação ligada ao K48, melhorando assim os níveis de estresse oxidativointracelular 15,16. Uma variedade de inibidores de proteassoma, como bortezomib, carfilzomib e ixazomib, entrou progressivamente na prática clínica para doenças como o mielomamúltiplo 17,18,19.

Atualmente, existem inúmeros métodos para detectar proteínas ubiquitinadas, incluindo western bloting, ensaios baseados em radioatividade e ensaios defluorescência 20. No entanto, em pesquisas científicas, o western blot permanece como o método preferido para a detecção da ubiquitinação de proteínas devido ao seu protocolo relativamente rápido e direto. Métodos tradicionais para detectar proteínas ubiquitinadas são semelhantes à tecnologia de co-imunoprecipitação (co-IP): eles usam um tampão de lise para incubar e lisar pellets celulares a baixa temperatura para liberar proteínas, e depois usam anticorpos para detectar a ubiquitinação das proteínas dosubstrato 21,22. No entanto, esse protocolo experimental frequentemente requer um grande número de células. Além disso, como o método relativamente suave de lise em baixa temperatura não pode interromper completamente as interações proteicas, isso aumenta a probabilidade de falsos positivos na ubiquitinação detectada. O aquecimento e o uso de SDS podem perturbar significativamente a estrutura das proteínas, induzindo sua desnaturação completa, reduzindo assim efetivamente os resultados falsos positivos causados por interações proteína-proteína 23,24,25. Da mesma forma, as células passam por lise suficiente após aquecimento e tratamento com SDS, liberando mais proteínas e, consequentemente, reduzindo a quantidade de células necessárias para o experimento. Em resumo, tanto o método do banho de gelo quanto o método de tratamento térmico lisam células e detectam os níveis de ubiquitinação das proteínas do substrato por meio da incubação de anticorpos. No entanto, o método de aquecimento resulta em maior lise celular e desnaturação mais forte das proteínas.

O TGF-β desempenha um papel duplo nos processos fisiopatológicos de várias doenças26,27. SMAD2 é um fator crítico de transcrição a jusante do TGF-β. A ubiquitinação mediada pelo SMURF2 do SMAD2 o direciona para degradação proteassômica, ajustando assim a intensidade de sinalizaçãodo TGF-β 28. Este estudo delimita e compara dois métodos de lise celular para medir níveis de ubiquitinação em células de mamíferos, usando SMURF2/SMAD2 como modelo. Aqui, a superexpressão proteica em células HEK293T foi induzida por transfecção transitória com plasmídeos HA-Ub, FLAG-SMAD2 e MYC-SMURF2. As células foram lisadas usando o método do banho de gelo e o método de tratamento térmico, respectivamente. Proteínas ubiquitinadas foram detectadas por análise Western blot. Descobrimos que tanto o método do banho de gelo quanto o método de tratamento térmico podem ser usados para detectar níveis de ubiquitinação, e o método de tratamento térmico pode facilitar a detecção da ubiquitinação do SMAD2. Esse protocolo oferece uma nova alternativa para detectar proteínas ubiquitinadas. Além disso, para certas proteínas do substrato fortemente associadas à ubiquitinação, o método de tratamento térmico alcança melhor eficiência de lise proteica, permitindo assim uma detecção mais fácil da ubiquitinação.

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Protocolo

1. Preparação do tampão de lise e reagentes

NOTA: Prepare todos os buffers nas concentrações indicadas. Siga as instruções do fabricante para pós reagentes para evitar discrepâncias de concentração.

  1. Prepare o tampão de lise contendo 20 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM de NaCl, 1 mM de EDTA (pH 8,0) e 1% de Triton X-100. Ajuste a concentração de NaCl entre 50-150 mM, se necessário. Prepare todos os tampões usando H₂O duplamente destilado.
  2. Prepare a solução de trabalho suplementando o tampão de lise com um coquetel inibidor de protease a 1% (sem EDTA). Misture bem e deixe no gelo até o uso.
  3. Prepare 10% de SDS dissolvendo 1 g de pó de SDS em 10 mL de PBS. Misture até estar totalmente dissolvido. Armazene em temperatura ambiente.
  4. Prepare 5× tampão de carga proteica contendo 250 mM de Tris-HCl (pH 6,8), 10% SDS, 50% de glicerol, 0,5% de azul de bromofenol e 5% de β-mercaptoetanol. Dissolva os componentes em H2Oduplamente destilado. Misture bem antes do uso.
    NOTA: Manusear SDS e β-mercaptoetanol em uma exaustão enquanto usa o equipamento de proteção adequado. Descarte materiais contaminados conforme as diretrizes institucionais de resíduos químicos.

2. Preparação das células

  1. Mantenha HEK293T células em DMEM de alta glicemia suplementadas com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina. Incubar a 37 °C com 5% de CO₂ em condições estéreis. Células de passagem em aproximadamente 90% de confluência.
  2. Células de semente em placas de 6 poços a 5 × 10⁵ células por poço. Agrupe células de dois poços para gerar uma amostra.
  3. Prepare misturas de transfecção para representar 10% do volume total da cultura e use a ubiquitinação SMAD2 como modelo experimental. Combine 1 μg de plasmídeo HA-Ub, 1 μg de plasmídeo FLAG-SMAD2 e 0,5 μg de plasmídeo vetor vazio ou MYC-SMURF2 em 100 μL de DMEM sem soro. Em um tubo separado, dilua 3,75 μL de reagente de transfecção em 100 μL de DMEM sem soro. Adicione a mistura de reagentes gota a gota à solução plasmídica, incube por 15 minutos em temperatura ambiente e distribua uniformemente sobre as células.
  4. Substitua o meio de transfecção após 6-8 horas por 2 mL de DMEM completo e fresco por poço. Incube células por 48 horas.
  5. Trate as células com 5 μM MG132 por 12 horas antes da colheita.
    NOTA: Manuseie MG132 em um armário de biossegurança usando luvas. Descarte materiais contaminados conforme os procedimentos de segurança institucionais.

3. Coleta de celular

  1. Colhe células com confluência de 90-100% (~3 × células 10⁶). Aspire o meio e lave cada poço com 1 mL de PBS pré-resfriado. Remova completamente o PBS.
  2. Adicione 1 mL de PBS a cada poço e ressuspenda suavemente as células. Transfira a suspensão para um tubo de 1,5 mL e coloque no gelo.
  3. Centrifuge a 380 × g por 5 minutos a 4 °C. Remova o sobrenadante e mantenha a bola.

4. Preparação de contas de agarose

  1. Transfira 50 μL de esferas de agarosa Proteica A/G por amostra para um novo tubo. Lave as esferas 3 vezes com 1 mL de tampão de lise. Centrifuge a 100 × g por 1 minuto a 4 °C entre as lavagens.
  2. Remova o buffer residual sem mexer no pellet. Adicione 100 μL de solução ativa e 5 μL de anticorpo anti-FLAG. Incube por 6 horas a 4 °C com rotação suave.

5. Lise celular

  1. Método do banho de gelo
    1. Adicione 500 μL de solução de trabalho pré-fria ao pellet. Incube no gelo por 30 minutos.
    2. Sonicate a 2 W usando ciclos de 4 s ligados/4 s desligados para cinco repetições. Mantenha as amostras no gelo durante a sonicação. Devolva as amostras ao gelo pelo restante da incubação.
      NOTA: Para interações proteicas fracas, reduza a concentração de NaCl para 50-75 mM e omita a sonicação.
  2. Método de tratamento térmico
    1. Adicione 45 μL de solução de trabalho ao pellet. Adicione 5 μL de SDS a 10% enquanto mistura continuamente.
    2. Vórtice brevemente e aquece a 95 °C até que a suspensão se torne transparente e totalmente liquefeita. Inverta de forma intermitente para garantir uma desnaturação uniforme.
    3. Adicione 450 μL de solução de trabalho. Sonice a 2 W usando ciclos de 4 s ligados e 4 segundos desligados por cinco repetições enquanto mantenho os samples no gelo.
      NOTA: Garantir que a concentração final de SDS permaneça <0,1%. Confirme a lise completa verificando o desaparecimento do pellet visível e a clareza uniforme da solução.

6. Detecção de imunoprecipitação e ubiquitinação

  1. A centrífuga lisa a 13.680 × g por 15 minutos a 4 °C. Transfira o supernadante para um novo tubo.
  2. Reserve 60 μL de lisado e adicione 15 μL de 5× de buffer de carga. Aqueça a 95 °C por 15 minutos e rotule como entrada.
  3. Adicione 100 μL de esferas acopladas a anticorpos ao lisado restante (volume final 540 μL). Incubar a 4 °C por 8-12 horas com rotação.
  4. Centrifuge esferas a 100 × g por 1 minuto a 4 °C e descarte o sobrenadante. Lave as contas 3 vezes com tampão de lise. Adicione 75 μL de tampão de carga SDS 1× e aqueça a 95 °C por 15 minutos para eluir proteínas. Rotule como IP.
  5. Detectar proteínas ubiquitinadas pelo western blot de acordo com um protocolo padrão JoVE.
    NOTA: Consulte o protocolowestern blot 29 para procedimentos detalhados de transferência e detecção. Manchas não recortadas de comprimento total com marcadores de peso molecular são fornecidas no Arquivo Suplementar 1.

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Resultados

Como um "mensageiro molecular" na via de sinalização TGF-β, o SMAD2, após ser fosforilado pelos receptores TGF-β, forma um complexo com SMAD3 e SMAD4, transloca-se para o núcleo e inicia a transcrição dos genes-alvo30 a jusante. Assim, é uma molécula chave que liga sinais extracelulares à expressão gênica intracelular. Sua degradação é mediada pelo SMURF2, uma ligase E3 de ubiquitina que catalisa a poliubiquitinação da proteína alvo, direcionando-a para a degradaç...

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Discussão

Este estudo apresenta e compara dois protocolos detalhados de lise proteica especificamente otimizados para detectar ubiquitinação do substrato mediada por ligas E3. Para garantir a detecção, usamos superexpressão baseada em plasmídeos (por exemplo, marcada como SMAD2, SMURF2 ou Ub) em células, o que forneceu níveis suficientes de proteína para visualizar sinais específicos de ubiquitinação, crítico para validar as interações ligase-substrato E3 neste estudo. Antes da colheita celular, M...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China, Nºs 82370647 (W.H.), Nºs 82170642 (J-X. Z), nºs 81801923 (X-F. Z), nºs 81670575 (J-X. Z), nºs 81570570 (W.H.) e nºs 81070355 (J-X. Z), e do Programa da Equipe Acadêmica Juvenil da HUST, Universidade de Ciência e Tecnologia Huazhong (2018QYTD02). Fundação Aberta de Hubei: Laboratório-chave de Medicina Regenerativa e Pesquisa Translacional Multidisciplinar (2022zsyx003). Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Chave da China (2024YFA1107601).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Microtubo de 1,5 mLServicebioEP-150-M
Prato cultivado tratado com TC de 100 mmServicebioCCD-100
Disco de 6 poçosServicebioCCP-6H
Anticorpos anti-FLAGProteintech20543-1-APdiluição usada 1:200 para IP 1:10000 para WB
Anticorpos anti-GAPDHProteintechMA5-15738diluição usada 1:10000
Anticorpos anti-HAProteintech51064-2-APdiluição usada 1:10000
Anticorpos anti-IgGCST#3900diluição usada 1:200 para IP
Anticorpos anti-MYCProteintech60003-2-IGdiluição usada 1:10000
Anticorpos anti-SMAD2CST#5339diluição usada 1:200 para IP 1:2000 para WB
Azul de bromofenolServicebioGC307006-5g
EDTA (pH=8,0)ServicebioG1207-1L
FBSABW
GlicerolSinopharm10010618
Banho seco de aquecimento/resfriamentoGuocheng
HEK293T célulasATCCCRL-3216
DMEM de alta glicoseServicebioG4515-500ML
Cadeia Leve IgG anti-camundongo conjugada HRP  AbclonalAS062diluição usada 1:5000
Cadeia Leve IgG anti-Coelho conjugada com HRP & nbsp;AbclonalAS061diluição usada 1:10000
Lipo8000BeyotimeC0533
MG132AladdinM421264
MicrocentrífugaLabgicCF1524R
Pó de NaClServicebioGC102004
PBS ServicebioG4202-500ML
pCMV-FLAG-SMAD2Para expressão em mamíferos
pCMV-HA-UbPara expressão em mamíferos
pCMV-MYCPara expressão em mamíferos
pCMV-MYC-SMURF2Para expressão em mamíferos
Penicilina-estreptomicinaServicebioG4003-100ML
Coquetel inibidor de protease sem EDTATargetMolC0001
Esferas de agarose A/G de proteínaBeyotimeP2017
Membrana PVDFVayzmeE801
Pó SDSSolarbioS8010-500g
Sistema SDS-PAGEAervicebioBVE4-BVT4
SonicsCélula de Uibra
Pó Tris-HClBiotopadoHST-0372
Triton X-100ServicebioGC204003-100ml
TripsinaServicebioG4021-100ML
Misturador de vórticeGentilmente doado por Vayzme
β-mercaptoetanolAladdinM301573

Referências

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